Спосіб прогнозування ускладень від дії індукторів інтерфероногенезу у наркозалежних хворих на вірусний гепатит

Винахід відноситься до медицини, а саме до лабораторної діагностики і може бути використаний в терапії для попередження ускладнень при застосуванні індукторів інтерфероногенезу. Відомий спосіб визначення індексу чутливості Т-лімфоцитів до імуномодуляторів, який базується на здатності Т-лімфоцитів утворювати з еритроцитами барана так звані розетки (Е-РОК) [Дифференцированные методы иммунокоррекции при туберкулезе и неспецифических заболеваниях легких: Метод, рекомендации // Чернушенко Е.Ф., Ко госова Л.С., Панасюкова Е.Р., Тишко Н.А. и др. - К., 1992. - 18c.]. Однак відомий спосіб не дозволяє визначити імовірність розвитку ускладнень терапії індукторами інтерфероногенезу, оскільки відсутні кількісні показники необхідних доз цих препаратів та часу експозиції для його виконання і прототип не спрямований на визначення імовірності ускладнень при застосуванні імуномодуляторів. В основу винаходу поставлено задачу створити спосіб прогнозування ускладнень від дії індукторів інтерфероногенезу у наркозалежних хворих на вір усний гепатит шля хом визначення індивідуальної чутливості лімфоцитів до індуктору за тестом змін рівня рецепторних розеток лімфоцитів з еритроцитами барана та ступеня рецепції, що забезпечить можливість визначити імовірність розвитку ускладнень до початку використання індуктора в терапії. Поставлена задача досягається тим, що в якості індуктора в культуральне середовище вводять циклоферон в кінцевій концентрації 10мкг/мл, визначають індекс індивідуальної чутливості лімфоцитів до циклоферону і при його рівні більше ніж 30%, прогнозують високу імовірність розвитку ускладнень від застосування індуктора у наркозалежних хворих на вірусний гепатит (від пірогенних реакцій та активації цитолізу гепатоцитів до печінкової енцефалопатії). Суттєвою відмінністю запропонованого способу від прототипу є використання чітко підібраних доз циклоферону, використання поряд з показником зміни рівня рецепторних "розеток" ступеня рецепції мононуклеарів, та регламентація виконання окремих операцій. Спосіб здійснюється таким чином. Спочатку з венозної крові хворого, відібраної з антикоагулянтом (5% розчин "Трилону В" 0,1мл на 5,0мл крові) на градієнті щільності 1,077 г/см 3 (суміш фіколл-гіпаку) виділяють завись мононуклеарних клітин. В центрифужну пробірку наливають 3мл фіколл-гіпаку. Потім обережно під кутом 30 градусів нашаровують на неї 2,0-3,0мл венозної крові, розведеної середовищем 199 в співвідношенні 1:1. Далі пробірку центрифугують протягом 30 хвилин при 1500об/хв. Після цього на межі розділу плазми і фіколл-гіпака відбирають "кільце" мононуклеарних лейкоцитів. Далі клітини відмивають двічі середовищем 199 (режим центрифугування 1500 об/хв. протягом 15 хв.) та доводять кількість лімфоцитів середовищем 199 до концентрації 1-2млн./мл. Після цього перевіряють життєздатність мононуклеарів. Проводять тест з забарвленням 0,1% розчином трипанової синьки. Барвник і завись мононуклеарів змішують в рівних об'ємах (1 краплю барвника додають до 1 краплі суспензії лімфоцитів) і після цього частину зависі вносять в камеру Горяєва та підраховують відсоток нежиттєздатних (забарвлених) клітин. Рівень нежиттєздатних мононуклеарів не повинен перевищувати 5%. Після виділення мононуклеарів безпосередньо переходять до етапу інкубації одержаних клітин з індуктором. Центрифужні пробірки позначають як контроль та дослід з назвою імуномодулятора. В пробірки розливають по 0,1мл зависі мононуклеарів. В дослідну пробірку додають 0,1мл розведеного в 1000 разів середовищем 199 12,5% розчину циклоферону, а в контрольну - 0,1мл середовища 199. Вміст пробірок перемішують, інкубують в термостаті при температурі 37,0°С протягом 1 години. Далі клітини двічі відмивають центрифугуванням з середовищем 199 (додають до зависі до 5мл середовища 199 та центрифугують 15 хв. при 1500об/хв.). Після відмивки в пробірці залишають до 0,1-0,2мл рідини і потім завись клітин обережно перемішують. Далі змішують в дослідній та контрольній пробірках по 0,1мл зависі лімфоцитів (уже інкубованих), 0,1мл 0,5% зависі еритроцитів барана в середовищі 199 та 0,1 середовища 199. Завись інкубують в термостаті при температурі 37,0°С протягом 30хв. з подальшим центрифугуванням при 1000об/хв. протягом 5хв. (для більш щільного контакту еритроцитів та лімфоцитів). Потім завись ставлять в холодильник при температурі 4°С на 1820 годин. Після експозиції в холодильнику клітини обережно перемішують, а потім підраховують утворені еритроцитарні "розетки" в камері Горяєва в нативному нефарбованому препараті, визначають відсоток розеткоутворюючих лімфоцитів (Е-РУК), оцінюють співвідношення рівня Е-РУК в досліді при інкубації з циклофероном (Е-РУКдослід) та контролі (Е-РУКконтроль) При обчисленні результатів тесту слід також враховувати ступінь рецепції (багато-рецепторні розетки - рецепція лімфоцитом більше ніж 3-х еритроцитів барана). Після цього розраховують індекс індивідуальної чутливості лімфоцитів (ІЧ) у відсотках за наведеною формулою: ІЧ=(Е-РУКдослід/Е-РУКконтроль-1)х100%. При рівні індексу індивідуальної чутливості лімфоцитів досліджуваного зразку більше ніж 30% за результатами тесту, прогнозують високу імовірність розвитку ускладнень у наркозалежних хворих на вірусний гепатит. Спосіб пояснюється такими прикладами. Приклад 1. Хворий К., 33 роки, знаходився на лікуванні в інфекційній лікарні с з клінічним діагнозом: Хронічний вірусний гепатит С. Реактивація з помірною активністю. Стадія реплікації. Жовтянична форма. Легкий перебіг. При госпіталізації стан хворого розцінено як відносно задовільний. Шкіра субіктерична, склери помірно іктеричні. Печінка м'яко-еластичної консистенції, край не гострий, поверхня гладка. Розміри печінки нижче реберної дуги: +1,5см (права доля); +2,5см (ліва доля). Селезінка не збільшена. Сеча насичена. Фекалії забарвлені. З анамнезу: хворіє на хронічний вірусний гепатит С на протязі 4-х років. Протягом останніх 5 років хворий внутрішньовенно періодично вживає сурогати опію. Гемо- та урограма без особливостей. Печінковий комплекс: білірубін загальний - 37 мкМ/л; білірубін прямий - 27мкМ/л; білірубін непрямий - 10мкМ/л; АЛТ - 3,7мМ/л/ч; тимолова проба 14,5Од. В сироватці крові виявлені антитіла класу Ig M та Ig G до CorAg HCV та РНК HC V. У цього хворого враховуючи реплікативну активність вірусу гепатиту С доцільно було призначення циклоферону. Рівень спонтанних Е-РОК (контроль) у хворого дорівнював - 45%; рівень Е-РОК після інкубації мононуклеарів з циклофероном (дослід) у хворого дорівнював - 52%. Перш, ніж призначити індуктор для лікування, було визначено запропонованим способом індивідуальний прогноз імовірності ускладнень за даними розрахунку індексу індивідуальної чутливості лімфоцитів хворого до циклоферону. Індекс індивідуальної чутливості лімфоцитів хворого до циклоферону, який було розраховано за запропонованою формулою, дорівнює: (Е-РУКдослід/Е-РУКконтроль-1)х100%=(52/45-1)x100%=15,55%. Висновок: Згідно одержаному значенню індексу індивідуальної чутливості лімфоцитів до циклоферону, який не перевищує 30%, ускладнень не повинно бути, циклоферон при лікуванні можна застосовувати та очікувати достатню противірусну та імуномоделюючу е фективність. Динамічне спостереження за станом здоров'я хворого здійснювалось протягом всього курсу лікування, результат позитивний - ускладнення не спостерігалися. Приклад 2. Хворий П., 23 років, знаходився на лікуванні в інфекційній лікарні з клінічним діагнозом: Гострий вірусний гепатит В (HBsAg+, IgM HBcorAg+). Жовтянична форма. При госпіталізації стан хворого розцінено як середньоважкий. Шкіра помірно іктерична, склери іктеричні. Печінка м'яко-еластичної консистенції, край не гострий, поверхня гладка. Розміри печінки нижче реберної дуги: +2,5см (права доля); +4,5см (ліва доля). Селезінка не збільшена. Сеча насичена. Кал слабо забарвлений. З анамнезу: Раніше вірусним гепатитом не хворів. Протягом останніх 8 місяців хворий регулярно внутрішньовенне вживає сурогати опію. Гемо- та урограма без особливостей. Печінковий комплекс: білірубін загальний - 49мкМ/л; білірубін прямий - 28мкМ/л; білірубін непрямий - 21мкМ/л; АЛТ - 5,0мМ/л/ч; тимолова проба 11,5Од. В сироватці крові виявлені HBsAg та антитіла IgM до HBcorAg. У цього хворого враховуючи реплікативну активність вірусу гепатиту В з метою індукції синтезу ендогенного інтерферону доцільно було призначення циклоферону. Перш, ніж назначити циклоферон, було визначено запропонованим способом індивідуальний прогноз ускладнень заданими розрахунку індексу індивідуальної чутливості лімфоцитів хворого до циклоферону. Рівень спонтанних Е-РУК (контроль) у хворого дорівнював - 41%, рівень Е-РУК після інкубації мононуклеарів з циклофероном (дослід) у хворого дорівнював - 57%. Індекс індивідуальної чутливості лімфоцитів хворого до циклоферону, який було розраховано згідно з запропонованою формулою, дорівнює: (Е-РУКдослід/Е-РУКконтроль-1)х100%=(57/41-1)х100%=39,02%. Висновок: Згідно одержаному значенню індексу індивідуальної чутливості індукція інтерфероногенезу циклофероном буде ефективною, але при застосуванні індуктора висока імовірність ускладнень, оскільки він перевищує 30%. Запропонований спосіб заснований на результатах спостережень при застосуванні циклоферону у 60 осіб, хворих на парентеральні вірусні гепатити (ВГ), які вживали наркотики. В якості контрольної групи використано результати досліджень 20 хворих на ВГ, які не вживали наркотиків, та групи з 20 клінічно здорових осіб. Дані про індивідуальну чутливість до циклоферону пацієнтів, хворих на ВГ та здорових осіб наведені в таблиці. Як видно з таблиці, середній рівень індивідуальної чутливості до циклоферону в гр упах був достатній для обґрунтування його застосування у хворих, які не вживали наркотиків або відмовились від їх вживання на період лікування ВГ. Однак у хворих, які не відмовились від застосування наркотиків, рівень активації лімфоцитів був значно вищім, ніж у других хворих. Така гіперактивація повинна була привести до побічних ефектів при застосуванні циклоферону, що і було відмічено у 10 хворих, які продовжували вживати наркотиків. Таблиця Чутливість пацієнтів до циклоферону (M ± 2s ) Групи хворих Рівень Е-РУК без Рівень Е-РУК з (n-число пацієнтів) циклоферону % циклоферомом % Клінічно здорові особи, 50,21±6,25 58,57±7,54 (n=20) Контрольна група з ВГ, 48,74±5,74 53,84±4,52 (n=20) Хворі на ВГ, які відмовились 44,83±4,32 48,77±6,82 від наркотиків, (n=15) Хворі на ВГ, які не 41,73±5,21 51,74±5,85 відмовились від наркотиків, (n=35) Наркозалежні з ВГ, у яких 42,72±4,91 59,92±4,31 виникли ускладнення терапії циклофероном, (n=10) *, **, *** - вірогідність розбіжностей між показниками в колонці (р