Штам перещеплюваних клітин нирки свині рк-15-iecvm

Штам перещеплюваних клітин нирки свині PK15-IECVM для репродукції вірусу класичної' чуми свиней, родина Suidae, рід Sus, вид Sus scroba. Корисна модель відноситься до ветеринарної вірусології та біотехнології і може бути використана для вивчення та накопичення вірусів. Відома перещеплювана лінія клітин нирки свині РК-15, ізольована в 1957 році М. Harris з культури клітин РК-2а нирки дорослої свині. Внаслідок культивування штаму перещеплюваних клітин нирки свині при нестандартних умовах і в різних за складом живильних середовищах його культуральні, морфологічні, цитогенетичні характеристики та чутливість до вірусу класичної чуми свиней стали нестабільними. Бютехнологічне використання лінії клітин РК15 потребує додавання до складу ростового середовища фетальної'сироватки крові великої рогатої худоби (ВРХ), що економічно не вигідно для виробництва біологічних препаратів. В основу корисної моделі поставлено задачу одержання штаму перещеплюваних клітин нирки свині PK-15-IECVM, який є стабільним за біотехнологічними характеристиками, забезпечує високий рівень репродукції вірусу класичної чуми свиней і придатним для науково-дослідної роботи. Штам клітин PK-15-IECVM отриманий з перещеплюваної' лінії клітин нирки свині РК-15, що адаптовано до живильного середовища, яке включає рівне співвідношення середовищ Ігла DMEM, 199 та 10% сироватки великої рогатої худоби очищеної' поліетилен гліколем, з одночасним добором високочутливої до вірусу класичної чуми свиней та морфологічно однорідної популяції клітин. Штам PK-15-IECVM зберігається у колекції клітинних культур Інституту експериментальної та клінічної ветеринарної медицини (ІЕКВМ) УААН за номером 13: родина Suidae, рід Sus, вид Sus scroba. Штам PK-15-IECVM має такі властивості: Морфологічні ознаки Клітини мають епітелюподібну форму з округлими ядрами, що вміщують 2-6 дрібних ядерець різноманітної форми. Цитоплазма клітин гомогенно-дрібнозерниста. Контури між клітинами ЧІТКІ, моношар прозорий. Карюлогічні ознаки Кількість хромосом у клітинах коливається від 35 до 53, модальна група відповідає 44-46 хромосомам, до якої' відноситься 37% клітин популяції. Головні зміни в каріотипі клітин PK-15-IECVM, у порівнянні з вихідним каріотипом нирки свині відбулися за рахунок анеуплоідії та багатокількісних аберацій окремих хромосом, що сталися в процесі адаптування клітин нирки вівці до культивування in vitro з використанням нового складу живильного середовища. Умови культивування та ростові властивості Середовище культивування: суміш рівних об'ємів середовища 199 та Ігла DMEM з додаванням 10% сироватки крові ВРХ, очищеної поліетиленгліколем. Температура культивування 37°С, рН 7,27,4. Кратність розсіву клітин (1:4)-(1:6), посівна концентрація 80-125 тис. клітин в 1см3, інтервал пересіву 4-6 діб. На третю добу культивування КІЛЬКІСТЬ клітин зростає в 3,5 рази. Режим кріоконсервування Суспензію клітин фасують в ампули у концентрації 5-7млн./см3. Як кріозахисне середовище со (О о 7061 використовують ростове середовище з додаванням 10% стерильного д и мети л сульфоксиду (ДМСО). Консервують в ампулах, що запаяні, охолодженням зі зниженням температури "ГС/хвилину до - 30°С, на другому етапі 10°С/хв. до - 70°С, після чого переносять в рідкий азот. Режим відновлення Ампули з клітинами, які зберігались у рідкому азоті, піддають відтаванню у водяній бані з температурою 39°С. Розморожену клітинну суспензію переносять до стерильного флакону. Подальшу процедуру «відмивання» клітин від кріопротекторів здійснюють додаванням (по краплині) ростового живильного середовища (суміш рівних об'ємів середовища 199 і Ігла DMEM з додаванням 10% сироватки крові ВРХ без антибіотиків), до 50-100см3, після чого центрифугують. Визначають концентрацію живих та мертвих клітин в осаду, після чого готують посівну суспен Пасажний рівень культури клітин 10 ЗО 50 Таблиця Т и т р и накопичення вакцинного штаму вірусу КЧС (Iq К К И Д so/смз) UA-IEKBM Ші-Минь 10^ 10 4 > э 10ээ 10чэ 10 4 ' 0 10 3 '° Ш т а м п е р е щ е п л ю в а н и х клітин нирки свині РК15-ІЕКВМ забезпечує високий рівень репродукції Комп'ютерна верстка Д. Шеверун зію клітин у ростовому середовищі концентрацією 80-125 тис. клітин у 1см3 та розливають у культуральні посудини. Через 24 години замінюють живильне середовище на свіже, що сприяє видаленню залишків кріопротектора. Термін кріоконсервування 1-10 років не відбивається на зберіганні основних морфологічних, каріологічних характеристик та віру срепроду куючих властивостей клітин PK-15-IECVM. Контроль штаму PK-15-IECVM на сторонні контамінанти. При обстеженні клітин штаму РК-15IECVM на наявність контамінантів (бактерій, грибів, мікоплазм) отримано негативні результати. Видова ідентичність підтверджена цитогенетичним методом. Приклад використання штаму PK-15-IECVM. Дослідження вірусу класичної чуми свиней (таблиця). вірусу класичної ч у м и с в и н е й т а є п р и д а т н и м д л я науково-дослідної роботи. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освгти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вуп. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601