Спосіб інактивації вірусів при одержанні церулоплазміну

Корисна модель належить до медицини, а саме до інактивації вірусів у виробництві донорського ферменту церулоплазміну, що є мідновмісним глобулярним білком плазми крові ссавців, і може бути використана при виробництві ферментних лікарських препаратів з плазми крові. Найбільш близьким є спосіб інактивації вірусів при одержанні церулоплазміну, що включає очистку хроматографією розчину напівфабрикату церулоплазміну шляхом промивання ацетатним буферним розчином з наступною елюцією [RU, патент №2087150, кл. А61К35/16, опубл.20.08.1997]. Для промивання використовують 0,05М ацетатний буферний розчин при рН5,5-7,0 що містить 0,07М хлористого натрію. Недоліком відомого способу є низький рівень вилучення вірусів при одержанні церулоплазміну, що залишає його вірусонебезпечним. Титр після інактивації напівфабрикату церулоплазміну, до якого було внесено 6,3 Іоg10 ТЦІД50/см 3 модельного вірусу вірусної діареї BVDV, становить 4,5 Іоg10 ТЦІД 50 /см 3. Задачею корисної моделі є удосконалення способу інактивації вірусів при одержанні церулоплазміну, в якому за рахунок запропонованої обробки і умов її проведення підвищується вірусобезпечність церулоплазміну за рахунок ефективного вилучення вірусів. Поставлена задача вирішується запропонованим способом інактивації вірусів при одержанні церулоплазміну, що включає очистку хроматографією розчину напівфабрикату церулоплазміну шляхом промивання ацетатним буферним розчином з наступною елюцією, в якому попередньо до розчину напівфабрикату церулоплазміну додають 0,1М ацетатний буферний розчин при рН5,8, що містить 1% мас. три-н-бутилфосфату і 1% мас. полісорбату 80, суміш перемішують протягом 6...9 годин і розбавляють 0,1М ацетатним буферним розчином при рН5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і поліпропіленгліколь у кількості 0,2г/л, оброблений напівфабрикат іммобілізують на сульфопропілкатіонітному сорбенті і здійснюють його двостадійне промивання. На першій стадії промивання використовують 0,1М ацетатний буферний розчин при рН5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і поліпропіленгліколь у кількості 0,2г/л, і на другій стадії промивання використовують 0,1М ацетатний буферний розчин при рН5,8, що містить 0,05М хлориду натрію, і промивання ведуть зі швидкістю 4,5...5см/хв. Використовують сульфопропілкатіонітний сорбент, що має зерна фракції 100-200мкм. Елюцію здійснюють 0,1М ацетатним буферним розчином при рН5,8, що містить 0,3М хлориду натрію. Експериментально було встановлено, що попередня сольвент-детергентна обробка розчину напівфабрикату церулоплазміну з наступною його іммобілізацією на сульфопропілкатіонітному сорбенті і промивкою певним ацетатним буферним розчином, приводять до підвищення ефективності вилучення вірусів, що забезпечує вірусобезпечність препарату церулоплазміну. Спосіб здійснюється таким чином. До розчину напівфабрикату церулоплазміну, отриманого з вихідної сировини шляхом розчинення фракцій IV та осаду Б фракціонуванням плазми крові за методом Кона, або отриманого після хроматограцічної очистки, додають 0,1М ацетатний буферний розчин при рН5,8, що містить 1% мас. три-н-бутилфосфату і 1% мас. полісорбату 80. Суміш перемішують протягом 6...9 годин при температурі 25°С. Далі суміш розбавляють 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і поліпропіленгліколь у кількості 0,2г/л. Оброблений таким чином напівфабрикат церулоплазміну колоночною хроматографією при лінійній швидкості елюенту 2см/хв.. іммобілізують на сульфопропілкатіонітному сорбенті, що має зерна фракції 100-200мкм. Після завершення сорбції здійснюють двостадійне промивання попередньо обробленого напівфабрикату церулоплазміну, іммобілізованого на сульфопропілкатіонітному сорбенті, зі швидкістю 4,5...5см/хв. На першій стадії промивання використовують ацетатний буферний розчин, що містить каприлат натрію, хлорид натрію і пропіленгліколь. Краще, на першій стадії промивання використовувати за складом той самий розчин, що і для розбавлення суміші: 0,1М ацетатний буферний розчин при рН5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і поліпропіленгліколь у кількості 0,2г/л. На другій стадії промивання використовують ацетатний буферний розчин, що містить хлорид натрію: 0,1М ацетатний буферний розчин при рН5,8, що містить 0,05М хлориду натрію. Елюцію здійснюють 0,1М ацетатним буферним розчином при рН5,8, що містить 0,3М хлориду натрію. Елюат містить очищений церулоплазмін, який збирають до стерильної скляної тари і подають наультрафільтрацію. Нижче наведений приклад, що демонструє ефективність способу інактивації вірусів при одержанні церулоплазміну, але не обмежує його. Приклад. Згідно до вимог GVP навмисне внесення будь-якого вірусу у виробничі приміщення не допускається. Тому валідація проводилась у окремій лабораторії, обладнаній відповідним чином, з використанням моделі виробничого процесу. Для демонстрації ефективності вилучення вірусів запропонованим способом використовували модельні віруси вір усної діареї ВРХ (BVD V). В 1%-ний розчин напівфабрикату церулоплазміну вносили 6,45 Іоg10 ТЦІД 50/см 3 вірусу BVD V. До реактору, що містить 32мл 1%-ного розчину виділеного з вихідної сировини напівфабрикату церулоплазміну з вірусом BVDV за допомогою вакууму подають 32мл 0,1М ацетатного буферного розчину при рН5,8, що містить 1% мас. три-н-бутилфосфату і 1% мас. полісорбату 80. Суміш перемішують при температурі 25°С протягом 7 годин при швидкості обертання мішалки 80об./хв. Далі до ректору подають 64мл розчину, що містить: 0,1М ацетатного буферного розчину при рН5,8, 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і 0,2г/л поліпропіленгліколю 80. Оброблений таким чином напівфабрикат церулоплазміну пропускають через попередньо урівноважену хроматографічну колону діаметром 14мм, що містить 7мл сульфопропілкатіонітного сорбенту, при об'ємній швидкості потоку 3мл/хв (лінійна швидкість елюенту - 2см/хв..). Сорбцію проводять 40 хвилин. Іммобілізований на сульфопропілкатіонітному сорбенті попередньо оброблений фермент піддають двостадійному промиванню. Для цього через колонну пропускають 50мл 0,1М ацетатного буферного розчину при рН5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і 0,2г/л поліпропіленгліколю. Розчин пропускають при об'ємній швидкості 5мл/хв., (відповідає лінійній швидкості - 5см/хв.), протягом 10 хвилин. Потім промивають 20мл 0,1М ацетатним буферним розчином при рН5,8, що містить 0,05М хлориду натрію, при об'ємній швидкості 7,5мл/хв. (відповідає лінійній швидкості - 5см/хв.), протягом трьох хвилин. Елюцію здійснювали 0,1М ацетатним буферним розчином при рН5,8, що містить 0,3М хлориду натрію, при швидкості потоку 3мл/хв. Процес елюції тривав 10 хвилин. Елюат у кількості 13мл зібрали у стерильний л скляний посуд. Титр після інактивації -