Спосіб одержання церулоплазміну

Корисна модель відноситься до медицини, а саме до одержання донорського ферменту церулоплазміну, що є мідьвмісним глобулярним білком плазми крові ссавців, і може бути використаний при виробництві ферментних лікарських препаратів з плазми крові. Найбільш близьким є спосіб одержання церулоплазміну, що включає розчинення вихідної сировини в ацетатному буферному розчині, сорбцію ферменту на іонообміннику з ДЕАЕ функціональною групою, елюцію та наступне очищення, [RU, патент №2087150, опубліковано 20.08.1997, кл. А61К35/16 [1]], в якому отриманий після хроматографії елюат з концентрацією білка 0,5...2,0% піддають відстоюванню протягом 6...12 годин при рН 5,1...5,4 і іонній силі 0,01...0,04, центрифугують та концентрують ультрафільтрацією. Сорбцію на іонообміннику, де як такий використовують ДЕАЕ-сефадекс А-50, проводять в 0,05М ацетатному буферному розчині при рН 5,5 протягом 5...7 годин. Після відстоювання промивання проводять 0,05М ацетатним буферним розчином при рН 5,5...7,0, що містить 0,07М хлористого натрію. Недоліком відомого способу є вірусонебезпечність цільового продукту, оскільки спосіб не забезпечує ефективного вилучення вірусів при очистці. Так, титр цільового продукту, до якого перед очисткою було внесено 4,5Іоg10 ТЦІД50/см3 модельного вірусу вірусної діареї BVDV, становить після очистки >3,5log10 ТЦІД50/см3. Крім того, часткова денатурація білка, що відбувається під час центрифугування, приводить до зниження виходу цільового продукту. Задачею корисної моделі є удосконалення способу одержання церулоплазміну, в якому за рахунок запропонованої комплексної обробки і умов її проведення підвищується ефективність вилучення вірусів при очистці, що гарантує вірусобезпечність отриманого церулоплазміну. Крім того, запропонований спосіб є більш технологічним і дозволяє знизити денатурацію білка, що приводить до підвищення виходу цільового продукту. Поставлена задача вирішується запропонованим способом одержання церулоплазміну, що включає розчинення вихідної сировини в ацетатному буферному розчині, сорбцію ферменту на іонообміннику з ДЕАЕ функціональною групою, елюцію та наступне очищення, в якому як іонообмінник з ДЕАЕ функціональною групою використовують сорбент на жорсткій стиролдивінілбензольній матриці з привитою групою ДЕАЕ, а при очищенні фермент у вигляді розчину спочатку обробляють сольвент-детергентною сумішшю, потім оброблений фермент іммобілізують на сульфопропілкатіонітному сорбенті, промивають ацетатним буфером, що містить хлорид натрію, і проводять елюцію очищеного ферменту. Сорбція ферменту на сорбенті з жорсткою стиролдивінілбензольною матрицею з привитою групою ДЕАЕ, що має зерна фракції 200-250мкм і розмір пор 30нм, проводиться за допомогою колоночної хроматографії у «киплячому шарі», що не дозволяє нерозчиненому матеріалу накопичуватися в хроматографічній колоні. Зважений стан сорбенту забезпечується організацією потоку знизу вгору та великим розміром зерна. Іммобілізація ферменту і наступна промивка на сульфопропілкатіонітному сорбенті, що має зерна фракції 100-200мкм з діаметром пор 30нм, також проводиться за допомогою колоночної хроматографії. Даний сорбент дозволяє іммобілізувати не менше 25мг/см3 цільового ферменту, не створює високого тиску, практично не зсідається при використанні. Краще, сольвент-детергентна суміш для обробки ферменту складається з 0,1М ацетатного буферного розчину при рН 5,8, що містить 1% мас. три-н-бутилфосфату і 1% мас. полісорбату 80. Обробку ведуть шляхом перемішування сольвент-детергентної суміші з розчином ферменту в реакторі протягом 6...9 годин з наступним розбавленням 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і поліпропіленгліколь у кількості 0,2г/л. Оброблений фермент, іммобілізований на сульфопропілкатіонітному сорбенті, промивають у дві стадії, де на першій стадії використовують 0,1М ацетатний буферний розчин при рН 5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію та поліпропіленгліколь у кількості 0,2г/л. Для промивки на першій стадії використовують об'єм, що відповідає 7-ми об'ємам сорбенту. На другій стадії промивання використовують 0,1М ацетатний буферний розчин при рН 5,8, що містить 0,05М хлориду натрію, в об'ємі, що відповідає трьом об'ємам сорбенту. На першій і другій стадіях промивання ведуть зі швидкістю 4,5...5см/хв. Елюція очищеного ферменту здійснюється 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 0,3М хлориду натрію. Спосіб здійснюється таким чином. Фракції крові IV-I та осаду Б, що містять церулоплазмін, зміщують з ацетатним буферним розчином у ємності з мішалкою при 0...5°С і перемішують протягом 3...5 годин. Розчин фільтрують через капронове сито. Осад утилізують. Фільтрат за допомогою насосу пропускають знизу вгору через хроматографічну колону, що як іонообмінник містить сорбент на жорсткій стиролдивінілбензольній матриці з привитою групою ДЕАЕ з зернами фракції 200-250мкм і розміром пор 30нм, який знаходиться у зваженому стані. Елюат збирають у ємність. Елюат розбавляють 3...5 об'ємами ацетатного буферного розчину і обробляють сольвент-детергентною сумішшю. Як сольвент використовують, наприклад, три-н-бутилфосфат, як детергент - полісорбат 80, октоксинол 10, β-пропіолактон та інші поверхнево активні речовини. Змішування проводять в реакторі. Наприклад, 0,1М ацетатний буферний розчин при рН 5,8, що містить 1% мас. три-н-бутилфосфату і 1% мас. полісорбату 80, змішують з розчином ферменту. Суміш перемішують протягом 6...9 годин при температурі 25°С. Далі суміш розбавляють 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і поліпропіленгліколь у кількості 0,2г/л. Оброблений фермент іммобілізують колоночною хроматографією при лінійній швидкості елюенту 2см/хв. на сульфопропілкатіонітному сорбенті, що має сорбційну ємність 25...30мг/см3 і зерна фракції 100-200мкм з діаметром пор 30нм. Іммобілізований фермент промивають на сульфопропілкатіонітному сорбенті зі швидкістю 4,5...5см/хв. протягом 80-120 хвилин. Таке промивання краще здійснювати у дві стадії: на першій стадії 0,1 М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і поліпропіленгліколь у кількості 0,2г/л; на другій - 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 0,05М хлориду натрію. Промивання ведуть об'ємом, що відповідає 7-ми об'ємам сорбенту на першій стадії, і об'ємом, що відповідає трьом об'ємам сорбенту на другій стадії. Елюцію здійснюють 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 0,3М хлориду натрію. Процес елюції триває 50...80хв. Елюат містить очищений церулоплазмін, який збирають до стерильної скляної тари і подають на ультрафільтрацію. Корисна модель демонструється нижче наведеним прикладом. 0,5кг осаду Б змішували з 7,5л ацетатного буферного розчину у ємності з мішалкою при температурі 0°С і перемішували протягом 3 годин. Розчин фільтрували через капронове сито. Осад утилізували. Одержали 7л фільтрату, який за допомогою насосу пропускають знизу вгору через хроматографічну колону, діаметром 45мм, що містить 300см3 сорбенту з привитою групою ДЕАЕ на стиролдивінілбензольній матриці фракції 200-250мкм і розміром пор 30нм. Об'ємна швидкість елюенту - 1л/год. Через 7 годин у ємності зібрали 0,5л елюату, що містить церулоплазмін. Елюат змішують з 2л ацетатного буферного розчину. Для перевірки ефективності вилучення вірусів при реалізації запропонованого способу використовували модельні віруси вірусної діареї ВРХ (BVDV), які були внесені до розбавленого після елюції розчину ферменту у кількості 4,5log10 ТЦІД50/см3 вірусу BVDV. Згідно до вимог GVP навмисне внесення будь-якого вірусу у виробничі приміщення не допускається. Тому валідація проводилась у окремій лабораторії, обладнаній відповідним чином, з використанням моделі виробничого процесу. Розбавлений розчин ферменту з модельним вірусом переносили до реактору, де обробляли 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 1% мас. три-н-бутилфосфату і 1% мас. полісорбату 80. Суміш перемішують протягом 7 годин при температурі 25°С. Далі суміш розбавляли 5-ма об'ємами 0,1М ацетатного буферного розчину при рН 5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і поліпропіленгліколь у кількості 0,2г/л. Оброблений фермент колоночною хроматографією (діаметр колонки 15мм) при лінійній швидкості елюенту 2см/хв. іммобілізують на сульфопропілкатіонітному сорбенті, що має сорбційну ємність 25мг/см3 і зерна фракції 100-200мкм з діаметром пор 30нм. Одержаний розчин утилізували. Іммобілізований на сульфопропілкатіонітному сорбенті фермент промивали зі швидкістю 5см/хв. протягом 90 хвилин у дві стадії: на першій стадії 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і поліпропіленгліколь у кількості 0,2г/л; на другій - 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 0,05М хлориду натрію. Елюцію здійснювали 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 0,3М хлориду натрію. Процес елюції тривав 60хв. Елюат збирали до стерильної скляної тари, піддавали ультрафільтрації з наступною стерелізуючою фільтрацією. Одержали 20мл розчину церулоплазміну, що має вміст білку 750мг з питомою біологічною активністю 30ум.од./мг. Вихід цільового продукту - 99%, співвідношення Е610/Е280 - 0,045, концентрація білку - 38мг/мл. Титр після інактивації показав відсутність вірусу BVDV. Запропонований спосіб гарантує вірусобезпечність одержаного лікарського препарату церулоплазмін і дозволяє підвищити вихід цільового церулоплазміну.