Спосіб одержання засобу з гепатопротекторною активністю з листя винограду

Винахід відноситься до фармації, зокрема до способів одержання комплексів біологічно активних речовин з лікарської сировини, а саме екстракту з листя винограду культурного, краще сорту Ізабелла, з вираженою гепатопротекторною активністю і може бути використаний, як активна діюча речовина при одержанні лікарських засобів у різних лікарських формах. Відомий спосіб одержання комплексу біологічно активних речовин, що має гепатопротекторну дію [Патент 30879А, Україна, А61К38/43, А61К9/20, заявл.16.06.1998p., опубл. 15.12.2000р., Бюл.№7], який полягає в екстракції трави гороху посівного етанолом, упарюванні екстракту до водного залишку з подальшим очищенням хлористим метанолом. Отримання продукту зазначеним способом потребує використання такого токсичного розчинника, як хлористий метанол, і, як наслідок, - додаткового обладнання та створення спеціальних умов для здійснення способу. Найближчим до заявленого є спосіб одержання поліфенольного комплексу "Флавітин" з протизапальною, анальгетичною, противиразковою та антиоксидантною активністю [Патент 59681А, Україна, А61К35/78, заявл. 15.11.2002p., опубл. 15.09.2003p., Бюл.№9], який полягає у екстракції подрібненого листя винограду (краще сорту Дабугі) 50% спиртом етиловим при співвідношенні сировина:екстрагент 1:10, одержаний екстракт упарюють до видалення спирту етилового, водний залишок відфільтровують від осаду, осад обробляють водою для ресорбціії фенольних сполук, одержаний водний розчин останніх поєднують з фільтратом, упарюють і піддають сушінню. До недоліків способу за прототипом можна віднести необхідність використання додаткової ресорбції осаду після фільтрації екстракту, невисокий вихід готового продукту та використання переважно листя винограду сорту Дабугі, що непоширений на території України, Завданням винаходу є створення нового способу одержання засобу з гепатопротекторною активністю, в якому шляхом використання листя винограду вітчизняних сортів в якості сировини, проведення вичерпної екстракції біологічно активних речовин (БАР) при заданих параметрах способу, одержують засіб з вираженою гепатопротекторною активністю, який може бути використаний як активна діюча речовина при виготовленні лікарських засобів у різних лікарських формах, причому сам спосіб є економічним та простим у виконанні. Поставлене завдання вирішується таким чином, що у способі одержання засобу з гепатопротекторною активністю, який включає екстракцію подрібненого листя винограду етанолом, фільтрування та упарювання, винаходом передбачено, що в якості сировини використовують листя винограду, переважно сорту Ізабелла, екстракцію проводять 39-41% етанолом при співвідношенні сировини до екстрагенту як 1:12 послідовно тричі по 12 годин, а одержані екстракти об'єднують, фільтрують та упарюють до стану густого екстракту. Переважне використання в якості сировини листя винограду сорту Ізабелла викликане тим, що проведені авторами дослідження показали, що серед різних культурних сортів винограду саме сорт Ізабелла відрізняється високою концентрацією у листі БАР з гепатопротекторною активністю, що робить промислово доцільним їх вилучення і забезпечує високий вихід кінцевого продукту. При цьому ві тчизняна сировинна база даного сорту винограду достатня для промислового виробництва. У ході проведення експериментів визначено, що оптимальним екстрагентом для одержання засобу з гепатотротекторною активністю у відповідності із заявленим способом є етанол у концентрації 39-41%. При зменшенні концентрації етанолу нижче 39% не досягається максимальне вилучення комплексу БАР із сировини. Збільшення концентрації етанолу понад 41% недоцільне, бо не призводить до суттєвого збільшення виходу БАР. Доцільність використання у заявленому способі співвідношення сировини:екстрагент 1:12 доведено експериментальним шляхом і враховує особливості водопоглинання сировини. При зменшенні співвідношення сировина:екстрагент спостерігалось зменшення виходу основних груп БАР внаслідок неповного намокання сировини. При збільшенні співвідношення сировина:екстрагент не спостерігалось суттєвих змін у якісному складі кінцевого продукту, проте зростали витрати екстрагенту та енерговитрати на упарювання одержаного рідкого екстракту до густого стан у. З метою забезпечення вичерпної екстракції БАР із сировини заявленим способом передбачено проведення екстракції послідовно у 3 етапи по 12 годин кожний, з наступним об'єднанням одержаних екстрактів. Готовий засіб одержують у формі густого екстракту з вмістом сухого залишку не менш 70%. Отримання сухого екстракту недоцільно тому, що він не стійкий при зберіганні, внаслідок великої гігроскопічності. Засіб, одержаний за заявленим способом, - густий екстракт темно-брунатного кольору, кислуватий на смак, зі специфічним приємним запахом, що містить не менше ніж 1,5% оксикоричних кислот (у перерахунку на хлорогенову), 2,2% флавоноідів (у перерахунку на гіперозид), 10,5% дубильних речовин. Заявлений спосіб здійснюється наступним чином: подрібнене листя винограду, краще сорту Ізабелла, піддають екстракції 39-41% етанолом при співвідношенні сировина:екстрагент 1:12, екстракцію проводять послідовно у три етапи по 12 годин, кожен раз новими порціями екстрагенту одержані екстракти об'єднують, фільтрують та упарюють до отримання густого екстракту. Винахід ілюструється прикладами. Приклад 1. 1000г листя винограду культурного сорту Ізабелла подрібнювали до розміру часток 2-3мм і піддавали екстракції 40% етанолом при співвідношенні сировина:екстрагент 1:12 тричі по 12 годин. Одержані екстракти об'єднували, фільтрували та упарювали до густого екстракту з вмістом сухого залишку 70%. Одержували 280г кінцевого продукту. Ви хід екстракту у перерахунку на сухий залишок складає 19,6%. Приклад 2. Визначення гепатопротекторної активності екстракту з листя винограду, одержаного заявленим способом, проводили у дослідах на щурах на моделі гострого тетрахлорметанового гепатиту. Гострий токсичний гепатит відтворювали шляхом внутрішньошлункового одноразового введення 50% олійного розчину тетрахлорметану у дозі 1мл/100г маси тіла. Тварини були розділені на 6 дослідних груп: гр упа інтактного контролю; контрольна патологія; тваринам третьої-п'ятої груп на тлі тетрахлорметанового ураження печінки вводили екстракт з листя винограду в дозах 25, 50 та 100 г/кг відповідно, тварини шостої групи поряд з тетрахлорметаном отримували в якості референс-препарату силібор у терапевтичній дозі 25мг/кг. Екстракт з листя винограду та препарат порівняння вводили за годину до та через дві години після введення тетрахлорметану. Висновок про вираженість гепатопротекторної активності робили за ступенем зменшення масового коефіцієнту печінки (МКП), вмісту продуктів перекисного окиснення ліпідів: малонового діальдегіду (МДА) і дієнови х кон'югатів (ДК) у тканині печінки, а також за зменшенням активності у сироватці крові маркерів цитолізу - аланінамінотрансферази (АлАТ) та аспартатамінотрансферази (АсАТ) та маркеру холестатичного синдрому - лужної фосфатази (ЛФ). Біохімічні показники печінки та сироватки крові дослідних тварин визначали через 18 годин після введення 50% олійного розчину тетра хлорметану. Результати проведених досліджень наведені у таблиці. Таблиця 1 Вплив екстракту з листя винограду на біохімічні показники печінки та сироватки крові в умовах гострого тетра хлорметанового гепатиту у порівнянні з силібором Показник МКП, % МДА, мкмоль/г ДК, мкмоль/г АлАТммоль/год •л АсАТ, ммоль/год •л ЛФ, мкмоль/ с•л Інтактний контроль 4.01 ±0.10 30,77 ±0,98 10,78 ±1,10 0,86 ±0,03 0,72 ±0,03 4,14 ±0,10 Контроль на патологію 5.48 ±0.33* 90,81 ±4,66* 18,14 ±1,05* 2,36 ±0,1 * 1,97 ±0,06* 12,38 ±0,86* Екстракт з листя винограду 25мг/кг 50мг/кг 100мг/кг 5,30 5.35 4.99 ±0,09* ±0.14* ±0.12* 71,32 70,30 58,96 ±4,01*/** ±4,97*/** ±2,61*/**/*** 13,39 12,63 11,58 ±0,41*/** ±0,75**/*** ±1,09*/** 2,16 1,75 1,52 ±0,07* ±0,02*/** ±0,06*/** 1,68 1,57 1,13 ±0,14* ±0,11*/** ±0,09*/** 8,15 8,30 6,91 ±0,48*/** ±0,11*/** ±0,53*/** Силібор 25мг/кг 4.95 ±0.05* 76,92 ±1,31*/** 16,34 ±1,41*/** 1,45 ±0,04*/** 1,21 ±0,05*/** 6,91 ±0,44*/** * - розбіжність достовірна по відношенню до інтакту (р£0,05); - розбіжність достовірна по відношенню до контрольної патології (р£0,05). *** - розбіжність достовірна по відношенню до референс-препарату (р£0,05). ** Як видно з таблиці, введення екстракту з листя винограду на тлі гострого токсичного гепатиту призводило до регресивних змін у розвитку патології. В умовах модельної патології екстракт з листя винограду виявляв виражені антиоксидантні властивості й достовірно зменшував вміст МДА та дієнових кон'югатів у тканині печінки в усіх досліджуваних дозах. У дозі 100мг/кг екстракт з листя винограду чинив достовірно виразніший гальмівний вплив щодо накопичення МДА у тканині печінки, ніж препарат порівняння та зменшував вміст ДК практично до рівня інтактного контролю. Введення екстракту з листя винограду призводило до зменшення цитолізу, що позначилося достовірним зменшенням активності АлАТ та АсАТ у сироватці крові при застосуванні екстракту з листя винограду в дозах 50 та 100мг/кг. Введення екстракту з листя винограду призводило до достовірного зменшення активності ЛФ у сироватці крові, що є свідченням зменшення холестатичного синдрому. В усі х досліджених дозах екстракт з листя винограду, одержаний за заявленим способом, проявляв гепатопротекторну активність не гіршу, а у дозі 100мг/кг вищу за активність препарату порівняння - силібору. Таким чином заявлено спосіб одержання засобу з гепатопротекторною активністю, який має наступні переваги: - одержаний засіб рослинного походження має виражену гепатопротекторну активність, є нетоксичним, не викликає алергічних реакцій, не має ульцерогенного ефекту; - засіб може бути використаний для одержання препаратів у різних лікарських формах; - спосіб простий у виконанні, не потребує спеціальних умов та обладнання, може бути відтворений в умовах стандартного фармацевтичного виробництва; - має достатню вітчизняну сировинну базу.