Спосіб одержання інгібітора трипсину

Спосіб одержання інгібітора трипсину, що передбачає обробку насіння зернової культури екст 3 Активність інгібітора трипсину, який вилучено за прототипом, складала 24,6%. В основу корисної моделі поставлено задачу створити ефективний спосіб одержання інгібітора трипсину, в якому шляхом розробити оптимальних умов екстрагування та очищення білку забезпечити вилучення інгібітора трипсину з максимальною антипротеолітичною активністю. Поставлена задача вирішена в способі одержання інгібітора трипсину, що передбачає обробку насіння зернової культури екстрагентом, відокремлення осаду, обробку осаду екстрагентом, хроматографічне очищення виділеного білка і сушку цільового продукту тим, що гомогенізоване насіння люцерни обробляють боратним буферним розчином при рН=6,1-9,2, відокремлюють осад і фракціонують білки подвійною обробкою сульфатом амоніаку, після чого видаляють сульфат амоніаку і здійснюють очищення білка афінною хроматографією. Новим у корисній моделі, що заявляється, є наявність таких ознак: - використання насіння люцерни в якості джерела інгібітора трипсину; - умови екстрагування. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю заявлених ознак і досягнення технологічного результату можна пояснити наступним: в якості джерела інгібітора трипсину використовується насіння люцерни, яке характеризується значним вмістом інгібітора трипсину з високим значенням інгібіторної активності. Активність інгібітора трипсину, який вилучено за прототипом значно менше, ніж активність інгібітора трипсину, виділеного за методом, що заявляється (68,7%). Вилучення інгібітора трипсину з максимально можливою антипротеолітичною активністю базується на досягненні максимального ступеню очищення інгібітора за рахунок використання найбільш ефективного специфічного екстрагенту - боратного буферу, подвійного використання неорганічних (тобто, більш фізіологічних) реактивів та найбільш ефективної афінної хроматографії, в основу якої покладена спорідненість інгібітора до ферменту. Спосіб здійснюють наступним чином. Гомогенізоване насіння люцерни попередньо знежирювали 10-ма об'ємами петролейного ефіру в апараті Сокслета. Екстракцію інгібітора трипсину з насіння люцерни проводять 0,05М боратним буфером, рН=6,1-9,2, який містить 0,5М NaCl (гідромодуль 100) при постійному перемішуванні на магнітній мішалці (число обертів 5000об/хв.) при кімнатній температурі протягом 1 години. Осад відокремлювали від супернатанту за допомогою центрифугування при швидкості 8000 обертів за хвилину впродовж 20 хвилин. Фракціювання супернатанту проводили сульфатом амоніаку з масовими концентраціями солі між 75 і 100%. Отриманий осад розчинювали у дистильованій воді. 42847 4 Суспензію білка розміщували в пористу мембрану і діалізували проти 500мл дистильованої води впродовж 3 днів. Отриманий зразок центрифугували при 5000об/хв. впродовж 30 хвилин. Супернатант піддавали афінній хроматографії. Супернатант наносили на колонку (1´15см) з сорбентом: трипсин - сефароза 4В зі швидкістю 15мл/год. Після закінчення насичення сорбенту, яке контролювали за появою в фільтраті інгібіторної активності по відношенню до трипсину підшлункової залози людини, гель промивали 0,05М трис/НСl буфером, рН=8,0. Потім гель в колонці промивали послідовно 1М розчином NaCl та 8М сечовиною в 0,05М трис/НСl буфері, рН=8,0. Десорбцію інгібітора проводили 10-3М розчином НСl. Активну фракцію нейтралізували до рН=8,0 1М розчином NaOH й ліофільно висушували. Активність інгібітора складала 68,7%. Як видно з даних, наведених в таблиці, оптимальне значення рН є 7,6, при цьому екстрагується білок з найбільшою інгібіторною активністю по відношенню до трипсину підшлункової залози людини. Приклад 1. Гомогенізоване насіння люцерни попередньо знежирювали 10-ма об'ємами петролейного ефіру в апараті Сокслета. До 5г насіння додавали 500мл 0,1М боратного буферу, рН=7,6, який містить 0,5М NaCl. Екстракцію проводили при постійному перемішуванні на магнітній мішалці (число обертів 5000об/хв.) при кімнатній температурі впродовж 1 години. Осад відокремлювали за допомогою центрифугування при швидкості 8000об/хв. впродовж 20 хвилин. До екстракту додавали 242,63г (NH4)2SO4. Осад відокремлювали центрифугуванням, до супернатанту додавали 88,43г (NH4)2SO4, осад відокремлювали центрифугуванням. До одержаного осаду додавали 30мл дистильованої води. Суспензію білка розміщували в пористу мембрану і діалізували проти 500мл дистильованої води впродовж 3 днів. Проводили афінну хроматографію на колонку (1´15см) з сорбентом: трипсин - сефароза 4В наносять супернатант зі швидкістю 15мл/хв. Після закінчення насичення сорбенту, яке контролювали за появою в фільтраті інгібіторної активності по відношенню до трипсину, гель промивали 0,05М трис/НСІ буфером, рН=8,0 (50мл). Потім гель в колонці промивали послідовно 1М розчином NaCl (20мл) та 8М сечовиною в 0,05М трис/НСl буфері, рН=8,0 (32мл). Десорбцію інгібітора проводили 10-3М розчином НСl (80мл). Активну фракцію нейтралізували до рН=8,0 1М розчином NaOH й ліофільно висушили. Приклад 2-5. Здійснювали аналогічно прикладу 1, але екстракцію боратним буфером проводили при різних значених рН середовища. Отримані дані наведені в таблиці. 5 42847 6 Таблиця Вплив рН боратного буферу на антипротеолітичну активність інгібітора NN прикладу 1 2 3 4 5 рН боратного буферу 7,6 6,1 7,0 8,2 9,2 Комп’ютерна верстка C.Чулій Активність інгібітора трипсину, % 68,7 60,4 63,0 59,8 57,4 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601