Рослинний екстракт, який має допамінергічну активність

1. Растительный экстракт, обладающий допаминергической активностью, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что он получен раздельной экстракцией спиртом (2,5:10) Corydahs и Eschscholtzia с последующим смешением экстрактов при массовом соотношении сухих веществ экстракта Corydalis экстракта Eschscholtzia 1:1-20. 2. Растительный экстракт по п. 1, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что объемное соотношение спиртовых экстрактов Corydalis и Eschscholtzia составляет 1:2-10. 3. Растительный экстракт по п. ^ о т л и ч а ю щ и й с я тем, что объемное соотношение спиртовых экстрактов Corydalis и Eschscholtzia составляет 1:4. 4. Растительный экстракт по любому из пп. 1-3, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что он представляет собой смесь экстрактов Corydahs cavae rhizoma и Eschscholtzia californicae herba. 5. Растительный экстракт по любому из пп. 1-4, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что он представляет собой порошок. 6 Растительный экстракт по любому из пп. 1-5, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что он дополнительно содержит фармацевтически приемлемые целевые добавки. 7. Растительный экстракт по любому из пп. 1-6, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что он представляет собой форму для орального введения. 8. Растительный экстракт по любому из пп 1-4, 6, 7, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что он представляет собой настойку. 9. Растительный экстракт по любому из пп. 1.6, 7, о т л и ч а ю щ и й с я гем, что он представляет собой таблетку, драже или капсулу. 10. Растительный экстракт по любому из пп. 1-9, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что он получен из высушенных растений. KJ о Изобретение относится к растительному экстракту, который может найти применение для смягчения состояния возбуждения и нервных дисфункций. Известно, что промежуточные и конечные продукты обмена веществ пирокатехоламина оказывают влияние на сос тояние возбуждения у человека. Так, например, конечный продукт адреналин действует как нейропередатчик адренергической нервной системы как на альфа-, так и на (5-рецепторы. Как симпатикомиметический препарат адреналин повышает силу сердечного сокращения. Кроме того, 26971 так как адреналин повышает окислительный обмен веществ в клетках, он вызывает в итоге повышенную мобилизационную готовность организма. В соответствии с этим наблюдают также увеличение выброса адреналина в ситуациях, вызванных стрессом. Особенно высокие концентрации адреналина и также его предстадии, норадреналина, могут иметь последствием перевозбуждение, нервозность и тем самым недостаточную функциональную способность организма, в то время как лишь немного повышенные величины этих аминов оказывают вполне положительное действие: пульповый удар и кровяное давление слегка повышены, мускулатура и головной мозг возбуждены, чувствительность повышена. Кроме того, известно, что нарушения в уровне концентрации ж допамина, следующей предстадии к адреналину, могут приводить к состояниям возбуждения и к нервным дисфункциям. В частности, при недостатке дипамина могут проявляться депрессии. Специальный синдром недостатка допамина представляет болезнь Паркинсона, частичными симптомами которой являются акинезия, оцепенение и дрожание в покое. Новейшие клинические ре' зультаты говорят об терапевтической эффективности допа при лечении паркинсонизма. Это действие становится понятным на основании наблюдаемого уменьшения допамина в базальных ганглиях. Таким образом, при недостатке допамина желательно естественным путем повышать концентрацию этого пирокатехоламина. Этого можно достигнуть повышением синтеза допа (допамина) и подавлением расщепления допамина. Задачей настоящего изобретения является создание лекарственного средства, повышающего концентрацию допамина в организме пациента. Указанную задачу, согласно изобретению, решают путем получения растительного экстракта раздельной экстракцией спиртом (2,5:10) Corydalis и Eschscholtzia с последующим смешиванием экстрактов. При этом массовое отношение сухих веществ экстрактов CorydaJis и Eschscholtzia составляет 1:1-20. Предпочтительно, чтобы объемное соотношение спиртовых экстрактов Corydalis и Eschscholtzia составляло 1:210, что еще предпочтительнее, 1:4. В частности растительный экстракт может представлять собой смесь экстрактов Corydalidis cavae rhiza и Eschschoftziae 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 californicae herba. Он может представлять собой, в частности, порошок. Растительный экстракт может дополнительно содержать фармацевтически приемлемые целевые добавки. Он может предсталять собой форму для орального введения, может представлять собой настойку, таблетку, драже или капсулу. Растительный экстракт может быть получен из высушенных растений. * Растительный экстракт по изобретению может содержать полученные в результате экстракции спиртом экстракты в форме подвергнутого сушке вымораживанием порошка, водного и/или спиртового раствора. Подвергнутый сдике вымораживанием порошок получают, как правило, сублимационной сушкой полученного в результате экстракции спиртом экстракта (вытяжки из растительного сырья) обычными для этого способами сублимационной сушки. Подвергнутые сушке вымораживанием экстракты Corydalis и Eschscholtzia можно хранить отдельно или в смеси, а в случае необходимости для получения лекарственного средства смешивать с подходящими фармацевтическими веществами-носителями/растворителями. Для получения настоек для этого применяют в частности воду и/или спирт. Экстракт содержит, главным образом, активные вещества в форме полученной в результате экстракции спиртом (2,5:10) вытяжки из растительного сырья, и оно состоит, в частности, из такой вытяжки из растительного сырья Отношение Eschscholtzia и Corydalis (в пересчете на вес сухого экстракта) лежит преимущественно в области or 10:1 до 2:1 и составляет особенно 4:1. В качестве активного вещества применяют согласно изобретению преимущественно экстракты Corydalidis cavae rhiza * и Eschscholtziae californicae herba. Экстракт, согласно изобретению, может существовать в обычной для орального введения форме, в частности в форме таблеток, драже, капсул или, гланым образом, настоек. Получение этих форм введения осуществляют, в случае необходимости, с применением обычных для от-* дельных форм введения и подходящих фармацевтических растворителей и/или веществ-носителей, обычным методом, например таблетированием, дражированием, капсулированием находящегося в подвергнутой сублимационной сушке форме экстракта или спиртового и/или водного раствора из него. Для получения жидких форм 26971 введения, как, в частности, настоек, непосредственно применяют полученные в результате экстракции спиртом спиртовые вытяжки из растительного сырья. Наряду с сублимационной сушкой этих спиртовых вытяжек из растительного сырья для получения подвергнутых сублимационной сушке экстрактов можно также выпаривать досуха непосредственно спиртовые вытяжки из растительного сырья, преимущественно в вакууме и/или в атмосфере инертного газа, и полученный таким путем остаток можно затем обрабатывать дальше в желательную форму введения. Содержание активных веществ в экстракте согласно изобретению можно изменять в широких пределах. Как правило, оно составляет от 0,5 до 20 вес.%, в пересчете на готовый состав экстракта, особенно от 1 до 10 вес.%, главным образом, от 1 до 4 вес.%. Если применяют полученные в результате экстракции спиртом (2,5:10) спиртовую вытяжку из растительного сырья, то последнюю применяют преимущественно в полученной непосредственно после экстракции концентрации; при этом вытяжки из растительного сырья из Corydatis и Eschscholtziae применяют особенно в таком отношении, чтобы отношение Corydalis к Eschscholtzia соответствовал предпочтительно названным отношениям. Для получения отдельных экстрактов Corydalts и Eschscholtzia, особенно Corydafidis cavae rhiz. и Eschscholtziae californicae herba, применяют высушенные лекарственные растения, которые соответствуют спецификациям DAB 9 (немецкой фармакопеи). Это обеспечивается контролем качества при получении высушенных лекарственных растений. Получение отдельных экстрактов осуществляют известным образом обычными для этого и стандартными способами экстракции, как например мацерацией или перколяцией при помощи этанола или смесей этанола/воды. При этом сохраняют отношение высушенных лекарственных растений-экстракта 2,5:10, т.е. из 2,5 г высушенного лекарственного растения получают 10 мл экстракта высушенного ле'карственного растения. В качестве экстрагирующего агента применяют преимущественно 30 объем.% этанола. Получением можно управлять на основании контроля за процессом. Для оценки и гарантирования постоянного качества экстрактов используют 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 обычные для этого критерии качества. В частности, для этого служат общие спектры экстрагированных веществ и, с другой стороны, анализы известных из литературы основных алкалоидов обоих высушенных лекарственных растений. Затем освобождение после контроля качества экстракты в соответствии с желательной формой введения и в соответствии с желательными концентрациями перерабатывают дальше как жидкий или подвергнутый сублимационной сушке экстракт. Вид и количество экстракта зависит, в частности, от тяжести заболевания, от общего состояния и от возраста пациента. Как правило, количество назначаемого экстракта в форме настойки, которое предпочитают по изобретению, составляет от 1 до 2 капель/кг веса тела, один или несколько раз в день. В форме других оральных форм введения назначено как правило, соответствующие количества, предпочтительно от 2 до 5 мг общего сухого экстракта/кг веса тела, один или несколько раз в день. На фиг. 1 показана схема обмена вещества синтеза пирокатехаламина; на фиг. 2 - обзор схемы реакции тирозина через допахинон до допахрома или меланина; на фиг. 3 - определенное при 303 нм ультрафиолетового спектра гидроксилирование тирозина в присутствии Corydalis-экстракта 1:10,000, Eschscholtziaэкстракта 1:10000 или 20 Е фенолазы; на фиг. 4 - график Uneweaver-Burk для реакции фенолазы с Corydaiis-экстрактом (фиг. 4а и 4в) и для сравнения без Corydalisэкстракта (фиг. 4c-4f); на фиг. 5 - реакция фенолазы в присутствии 3,4-дигидроксибензола; на фиг. 6 - влияние D,hкода на реакцию фенолазы при различных концентрациях кода (К = контроль); на фиг. 7 - торможение допамин-Э-гидроксилазы Eschscholtzia-экстрактом (кривая А) и водным 1%-ным раствором подвергнутых сублимационной сушке экстрактов Corydalis и Eschscholtzia (кривая В); на фиг. 8 - при помощи фотометра при 41 нм торможение катализированной благодаря аминоксидозе реакции превращения бензиламида до бензальдегида Corydaiisэкстрактом; на фиг. 9 - торможение катализированного МАО (моноаминоксидазой) образования бензальдегида при 241 нм в зависимости от концентрации экстракта из Eschscholtzia; на фиг. 10 - торможение катализированного МАО образо 26971 8 2. "Активность пирокатехинолазы" кавания бензапьдегида при 241 нм экстрактализирует дальнейшее окисление обратами Escnscholtzia A) Corydalis; Б) и смесью зованного о-диола до соответствующего экстрактов Corydalis и Eschschoitzia в отхинона. ношении 20:80. Обе реакции зависят непосредственИз фиг. 1 видна схема обмена ве- 5 но друг от друга. Тесная связь реакции ществ пирокатехинаминов. Появляющиеся крезолазы и реакции пирокатехинолазы при этом соединения Допа и допамина основывается на состоянии окисления атоотносительно их концентрации, во-первых, ма меди в активном центре, который опзависят от того, как быстро происходит 10 ределен по D.Kertosz и R.Zrto в O.Hayaischi превращение тирозина до Допа, и, в-вто(ttzsg) "Oxygenases", Academic Press, Лонрых, с какой скоростью допамин реагидон (1962), глава 8: Фенолаза, как указарует дальше до норадреналина и адренано следующим образом: лина. Кроме того, допамин подвергается ++ (Си )2-фермент + О-дигидроксифенол -> также расщеплению моноаминооксидаза+ + ми (МАО), так что и это может оказывать 15 -> (Си )2-фермент + о-хинон ++ 2Н ; ++ + (Си )2-фермент + 0,5О2 + «2Н _>(Си )2значительное влияние на его концентрафермент + Н2О. цию в обмене веществ. В вышеприведенном электронном баКак видно из фиг. 1, повышенную конлансе меди реакция крезолазы остается центрацию допамина получают, если повышают реакцию фенолоксидазы (фено- *® не учтенной. Фактически, остается неясным, катализируют ли гидроксидирование лаза, тиросиназа), и влияние допамин-рмонофенола прямой ферментативной реакгидроксилазы и моноаминооксидаз можцией или эта реация протекает химичесно уменьшать. Ниже были проведены эксперименты, & ким путем параллельно окислению пирокатехина по следующей схеме: которые показывают, в какой степени ак• о-хинон + монофенол + Н2О -> 2 о-дифетивные компоненты лекарственного нол. средства по изобретению влияют на три За гипотезу неферментативной реакферментативные реакции. ции говорит тот факт прежде всего, что Следующие исследования, поскольку 3 0 при реакции монофенолов с фенолазами не было ничего другого, были осуществможно наблюдать индукционную фазу, колены с имеющимися в продаже ферменторая при тирозиназах из животной ткани тами и с Corydalis cavae rhizoma и может продолжаться до одного часа. НепEschscholtziae californicae herba. 35 рерывная ферментативная реакция Может 1, Исследование реакции тирозиназы: начинаться лишь тогда, когда диолы или Тирозин при обмене веществ гидрокхиноны присутствуют как примеси или обсидируют в расходующей кислород реакразованы в результате самоокисления. ции до L-допа. Эту первую стадию синтеИсследование реакции тирозиназы с за пирокатехинамина катализирует тиро- 4Q растворительными экстрактами из Corydalis зиназа или фенолаза или фенолоксидаза, и Eschschoitzia. которая представляет содержащий медь, Фиг. 2 показывает схематический обмало сдецифический фермент. зор реакции, исходя из тирозина, до доИзвестно, что фенолазы широко расппахрома и его превращения до хинонимиространены в приоде и встречаются в рас- 45 на или меланина. тениях, грибах и в различных животных Экспериментально наблюдали ниже тканях. Они повсюду играют важную роль" окисление тирозина до допахрома (фиг 2), там, где окисляют моно- или дифенолы, первого продукта окисления дигидроксипричем во многих случаях начинаются фенилаланина (Допа). Сам допахром явокислительные реакции полимеризации, 50 ляется* субстрактом для допахромтаутокак например образование лигнина или меразы и представляет предстадию обрамеланина. зования меланина. Как образование до*Фенолазы катализируют две следуюпахрома, так и синтез меланина приводят щие друг за другом стадии окисления,. к расщеплению Допа и тем самым к которые можно описать следующим об- 55 уменьшенному синтезу допамина. разом: За концентрацией допахрома можно t. "Активность крезолазьГ фермента следить в ультрафиолетовом спектре при вызывает гидроксидирование монофенодлине волны 303-318 нм. При этом его ла в орто-положении с образованием диобразование из тирозина приравнивается фенола. к активности исследуемой фенодазы, ко 26971 торую считают определяющей скорость реакции. Исследования проводили на следующих смесях субстратов: 2 ммол тирозина; 100 ммол фосфатного буферного раствора, рН 6,5; 20 единиц тирозиназы или спиртовых вытяжек Eschscholtzia или Corydalis, разбавленных в отношении 1:10000 (исходя из основного экстракта по нижеследующему примеру). Фиг. 3 показывает определенное при 303 нм ультрафиолетового спектра гидроксилирование тирозина в присутствии фенолоксидазы или экстрактов из Corydalis и Eschscholtzia. При этом наблюдают в присутствии одной фенолазы появление приблизительно 15-минутной Lagфазы (стадии покоя). Разбавления из экстрактов Corydalis до 1:10000 приводят к определенному сокращению этой "lag-фазы" или начальной фазы, как это видно из фиг. 3. При более высоких концентрациях CorydaHs наблюдают немедленное наступление максимальной нормы превращения без "lag-фазы". Экстракт из Eschscholtzia приводит также к сокращенной начальной фазе; однако эффективность экстракта Eschscholtzia лежит значительно ниже эффективности Corydalis. Контрольные опыты показали, что присутствие соответствующих количеств этанола не оказывают никакого влияния на реакцию. Кроме того, опыты с пирролохинолинхиноном (PGG) показали, что добавка этого физиологически очень интересного хинона не оказывает никакого влияния на начальную фазу реакций фенолазы. И гиперицин, который как пара-хинон возможно мог бы оказывать влияние на lag-фазу, не влияет на реакцию. При этой серии опытов интересен тот факт, что экстракт из Corydalis хотя и определенно смещает вперед момент максимальной нормы превращения тирозина, но не оказывает никакого влияния на максимальную норму превращения. Опыты с различными концентрациями субстрата на графике Lineweaver Burk-PLO не показывают никакого смещения Км-величины реакции фенолазы (см.для этого фиг. 4а до 4f). Для дальнейшего пояснения механизма реакции тирозиназы, в частности, учитывая сокращение lag-фазы, к испытываемой исходной смеси добавляют другие вещества: а) Добавка солей меди не оказывала никакого влияния на ферментативную реакцию. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 10 б) Аскорбиновая кислота как восстанавливающий действующий фактор - как это известно из литературы - может подавлять стадию покоя при различных типах реакции. Однако этого нельзя было наблюдать в пределах настоящей серии опытов: аскорбиновая кислота хотя и может начинать превращение тирозина до L-допа, но одновременно препятствует его дальнейшему окислению до дипахрома. Рекцию фенолазы нельзя было наблюдать в присутствии аскорбиновой кислоты при 303 нм в течение 30 мин; стадия покоя была, возможно, даже удлинена. с) Комбинация PQQ с аскорбиновой кислотой, причем образуется восстановленная форма PQQH2, которая могла бы влиять на реакцию в качестве диола, также вызывала удлинение стадии покоя. д) Добавка настоящих диолов, как 3,4дигидроксибензол и О,1_-допа (ДОФА-, 3,4диоксифениладанина), сокращает стадию покоя реакции (в случае добавки 3,4-диоксифенилаланина, благодаря большему количеству субтрата повышается также скорость образования допахрома). На фиг. 5 показана реакция фенолазы в присутствии 3,4-дигидроксибензола. Фиг. 5 показывает влияние D.L-допа на реакцию фенолазы в зависимости от концентрации дола. Как из фиг. 5, так и из фиг. 6 можно отчетливо видеть влияние названных диолов на стадию покоя. Самоокисление 3,4-диоксифенилаланина, которое наступает при щелочных величинах рН, можно не наблюдать или наблюдать лишь немного при рН 6,5. Вышеприведенные опыты показывают, что сокращение начальной фазы реакции фенолазы можно вызывать только добавкой диолов. Хинолины и аскорбиновая кислота не оказывают никакого влияния. Поэтому следует полагать, что экстракты Corydahs и Eschscholtzia содержат ортодиолы, которыевызывают немедленное превращение тирозина до 3,4-диоксифенилаланина. Далее, следует предполагать, что экстракты Corydalis и Eschscholtzia и на живом организме приводят к более быстрому превращению тирозина и тем самым к более повышенной концентрации "Дола" 3,4-диоксифенилаланина. 2. Исследование реакции допамин-^гидроксилазы: Фермент допамин- р-гидроксилазы катализирует превращение допамина до норадреналина, Допамин -fJ-гидрокси л аза также представляет содержащий медь фермент. Гидроксилирование происходит при расходе кислорода и требует аскор 11 26971 биновой кислоты и фумарата в качестве восстанавливающих агентов, чтобы регенерировать окислительный статус атома меди Активность фермента определяют по- 5 тенциометром на основании расхода молекулярного кислорода. Соответствующая тест-добавка содержала следующие компоненты: по 100 мл тирамина, фумарата, аскорбата (соответствено 5 ммол); 1 мл 10 фосфатного буферного раствора, рН 5 (100 ммол); 1 мл воды; 100 мл фермента (соответственно 0,1 единицы). Нормы расхода кислорода вычисляли на основании О?-содержания раствора с 15 температурой 37"С при соответствующем объеме. При добавке Eschscholtzia-экстракта происходит заметное, зависящее от концентрации торможение ферментативной 20 реакции, т.е. гидроксилирование боковой цепи в значительной степени подавляется Наблюдали, что ферментативная активность тормозится также этанолом. Однако торможение экстрактом значительно 25 выше, так что здесь можно видеть определенное различие. Фиг. 7 показывает торможение допамин-р-гидроксилазы Eschscholtzia-экстрактом (кривая А) и водным 1%-ным ратво- 30 ром подвергнутых сублимационной сушке экстрактов Eschscholtzia и Corydaiis в отношении 20:1 (кривая В) по изобретению. На фиг. 7 обе кривые показывают отчетливое торможение ферментативной ак- 35 тивности. Различия в ходе кривых следовало бы отнести к присутствию или к отсутствию этанола и Corydalis-экстракта (кривая В). Снижающееся действие ферментативного торможения при 40 Eschscholtzia-экстракта частично можно объяснить расходом кислорода различными субстратами экстракта. Хотя водный раствор подвергнутых сублимационной сушке экстрактов Corydaiis и Eschscholtzia также 45 показывают расход кислорода с тирамином, аскорбатом и фумаратом; однако тормозящее действие на фермент не снижается, вследствие чего здесь значительно затруднена интерпретация эффекта. 50 Вышеприведенные опыты ясно показывают, что фермент допамин-р-гидроксилазы тормозят спиртовым экстрактом Eschscholtzia (кривая А) и также водным раствором подвергнутых сублимационной 55 сушке Eschscholtzia и Corydaiis (кривая В), что при обмене пирокатехинамина приводит к уменьшению образования норадреналина и адреналина. Это тормозящее действие объясняет успокаивающее дейст 12 вие лекарственного средства по изобретению. Поддерживаемая торможением высокая концентрация допамина вызывает положительное влияние в случае паркинсонизма, картины болезни, при которой допаминэргические нервные клетки разрушены и содержание допамина в головном мозге следует поддерживать высокими искусственными приемами. 3. Исследование реакции моноаминооксидазы (МАО). Как видно из фиг. 8, концентрацию Допа (3,4-диоксмфенилаланина) или допамина регулируют также путем его расщеплення моноаминооксидазами, моноаминооксидазы превращает первичные амины при помощи кислорода в водной среде до соответствующего альдегида, аммиака и до соответствующей перекиси водорода в стехиометрическом отношении. Примененная здесь аминооксидаза была куплена у фирмы Сигма Кемикадо. Эта аминооксидаза показывает высокое сродство к бензиламину в качестве субстрата. Поэтому были проведены нижеследующие исследования с бензиламином в качестве субстрата и было проверено влияние Corydaiis и Eschscholtzia на активность этой моноаминооксидазы. Превращение бензиламина до бензилальдегида благодаря моноаминооксидазе определяли фотометром и потенциометром: а) При помощи фотометра обнаруживают образующий бензальдегид, который при 241 им имеет высокий молекулярный удельный показатель поглощения (1,2x104). Это чувствительное обнаружение позволяет применять очень маленькие количества фермента, которые могут находиться при • 0,01 и 0,02 единицы моноаминооксидазы (МАО) в реакционном объеме 2 мл. Соответствующая тест-добавка с общим объемом 2,000 л содержала: 50 мл 100 ммол водного раствора бензиламинаHCI (соответственно 2,5 ммол); 100 ммол фосфатного буферного раствора, рН 7,4; 0,01 единицы или 0,02 единицы МАО, добавленной частями по 100 мл в соответствующий основной раствор; эталонная кювета содержала буферный раствор, воду и бензиламин. В опытах с вышеописанной тест-добавкой через 10 минут реакционного времени в измерительную кювету и в эталонную кювету добавляли разбавленные экстракты Eschscholtzia и Corydaiis и опре : деляли измененную активность. Фиг. 8 показывает торможение образования бензальдегида в зависимости о** концент 13 26971 рации Corydalis (20 или 40 мл 1:10) разбавленного раствора основного экстракта). На фиг. 9 показано торможение экстракта из Eschscholtzfa на МАО-активность при различных количествах экстракта. При этом наблюдается отчетливое торможение МАО-активности. Фиг. 10 показывает тормозящее действие МАО-активности в результате добавки различных концентраций Eschscholtzia экстракта (кривая А), Corydahs-экстракта (кривая В) и смеси экстрактов Corydalis и Eschscholtzia в отношении 20:80 (кривая С). Для лучшего сравнения результатов опытов на фиг. 10 цана схема тормозящих действий в %. При этом активность МАО в каждом опыте была принята за 100% (на основании вязкого раствора сульфата аммония-фермента было трудно брать постоянные количества фермента, предложенного в продаже продукта). Оценка опытов показывает, что экстрактом Corydalis вызывают умеренное торможение МАО-активности. Более сильное влияние можно наблюдать благодаря Eschscboltzia-экстракту. Значительным является также MAQ-торможение в присутствии смеси обоих экстрактов, состоящей из 80% Eschscholtzia-экстракта и 20% Corydalis-экстракта. б) При помощи потенциометра можно определить реакцию бензиламина + О2 + + Н2О->бензальдегида - NH3 + Н2О2 благодаря уменьшению содержания кислорода в реакционном растворе посредством платиново-кислородного электрода. Доказательство превращения кислорода требует более высоких количеств субстрата и фермента. Соответствующая тест-добавка содержала: 200 мл 100 ммолярного раствора бензиламина (соответственно 10 ммол); 1,000 мл 200 ммолярного фосфатного буферного раствора, рН 7,5 (соответственно 100 ммол); 1,000 мл дистиллированной воды; 0,05 единицы МАО. Добавкой 100 мл экстрактов Corydalis и Eschscholtzia после 3 минут реакционного времени можно вычислять различные нормы превращения кислорода. Результаты на кислородном электроде показывают уменьшение активности моноаминооксидазы благодаря отдельным экстрактам из Corydalis и Eschscholtzia. При этом было подтверждено сильное влияние экстракта Eschscholtzia на МАОактивность. Вышеприведенные опыты показывают, что можно достигнуть значительного торможения МАО .экстрактами из Corydalis и 5 10 15 20 25 30 35 40 J& 50 55 14 Eschscholtzia и смесью атих двух экстрактов. Отсюда можно сделать вывод, что если тормозить активность аминооксидаз в плазме, то амины, как допамин, имеют более длительное время пребывания в токе крови и тем самым дольше остаются эффективными. Отсюда вытекает положительный эффект лекарственного средства согласно изобретению при смягчении состояний возбуждения и дисфункций нервов и получающихся в результате этого состояний депресии, особенно также при синдромах дефицита допамина, как паркинсонизм. П р и м е р 1. Получение экстракта. Были получены отдельные экстракты Corydalis caval rhizoma и Eschscholtzia californical herba. Получение отдельных" экстрактов осуществляли экстракцией при помощи перколяции при 50*С в течение 16 ч Соблюдали отношение высушенных лекарственных растений-эктсракта 2,5:10, т.е. из 2,5 г соответствующего высушенного лекарственного растения получали 10 мл экстракта высушенного лекарственного растения. Экстрагирующий агент: 30 объем, % этанол. Полученные таким путем экстракты можно непосредственно применять для получения состава лекарственного средства или можно переводить их лиофилизациеи в сухой экстракт. П р и м е р 2. Влияние DL-дигидроксифенилаланина на реакцию фенолазы приведено в табл. 1. Условия реакции: фосфатный буферный раствор, рН = 6,5, 100 ммол; тирозин 2 ммоп; фенолаза 20 единиц; DL-дигидроксифенилаланин, изменяемое количество Как показывает фиг. 6, DL-допа может заметно сокращать стадию покоя фенолазы, причем 5 мол допа вызывают немедленное образование допахрома. С 50 мол допа реакция непосредственно после начала, вызванного ферментом, уже протекает с максимальной нормой превращения. Самоокисление допа, т.е. образование допахрома без участия фермента, при рН = 6,5 в наблюдаемом интервале времени не было установлено. Однако DL-допа представляет не любой диол, а субстрат фенолазы, продукт которого снова дает допахром. Поэтому ниже были предприняты (пример 3) сравнительные исследования с 3,4-дигидроксибензолом. П р и м е р 3. Влияние 3,4-дигидроксибензола (как стартера) на реакцию фенолазы приведено-в табл. 2» 15 269? Условия реакции: фосфатный буферный раствор, рН 6,5, 100 ммол; тирозин 2 ммол; фенолаза 20 единиц, 3,4-дигидроксибензол, изменяемое количество. Оказыбается, что орто-дигидроксибензол при концентрациях 5 и 50 ммол мс~ жет сокращать или снимать стадию покоя .реакции фенолазы (фиг. 5). П р и м е р 4. а) Определение константы Михаэлиса для превращения тирозина благодаря фенолоксидазе приведено в табл. 3. Условия реакции: фосфатный буферный раствор, рН = 6,5, 100 ммол; тирозин 20 ммол до 2 ммол; фенолаза 20 единиц/ /исходная смесь. Результаты представлены на фиг. 4c-4f. б) Константа Михаэлиса реакции с экстрактом Corydalis. Исследование нормы превращения в присутствии экстракта Corydalis проводятся с разбавлением экстракта 1:200. Это количество экстракта приводило в предшествующих опытах к немедленному наступлению полной ферментативной активности, начальная фаза составляет 0 минут. Определенные К^-величины показывают в присутствии CorydaHs-экстракта несколько повышенный разброс, однако лежат в одинаковой области концентраций. Константы Михаэлиса в присутствии экстракта Corydalis приведены в табл. 4. Условия реакции: фосфатный буферный раствор, рН = 6,5, 100 ммол; тирозин от 20 ммол до 2 ммол; фенолаза 20 единиц/исходная, смесь, экстракт Corydalis, 1:2000. Результаты представлены на фиг. 4а и 46 П р и м е р 5 . а ) Влияние экстракта Corydaiis: Как показывают нижеследующая табл. 5 и фйт. 8, экстракт из Corydalis cava тормозит активность МАО. При этом применяют 20 или 40 мл 1:10 разбавленного раствора экстракта (2 или 4 мл основного вещества). Эти количества соответствуют, в пересчете на общий объем реакции 2 мл, разбавление 1:1000 или 1:500. Собственная абсорбция экстракта при 241 нм благодаря присутствию многочисленных ароматических соединений препятствует исследованию более крупных количеств экстракта, так как в этом случае невозможно больше уравновешивание реакционной и эталонной кюветы. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 16 Активность МАО мЕ/мин под влиянием Corydalis Условия реакции: фосфатный буферный раствор, рН 7,4, 100 ммол; бензиламин 2,5 ммол;, моноаминооксидаза 0,01, 0,02 единиц/исходная смесь; экстракт Corydalis, 1:10, изменяемое количество Результаты представлены на фиг. 8. б) Влияние экстракта Eschscholtzia: На основании повышенной прозрачности экстракта Eschscholtzia в этом исследовании можно применять 20, 40 и 60 мл 1:10 разбавленного раствора. В этом случае в реакционной исходной смеси находится 1:1000, 1:500 или 1:330 разбавленный раствор экстракта Eschscholtzia. Нижеприведенная табл. 6 и фиг. 9 поясняют высокую тормозящую способность этого экстракта: уже с разбавлением 1:500 поддерживают активность моноаминооксидазы четко ниже 50%, с разбавлением 1:330 активность фермента снижается до трети первоначальной величины. Активность МАО под влиянием Eschscholtzia Условия реакции: фосфатный буферный раствор, рН = 7,4, 100 ммол; бензиламин 2,5 ммол; моноаминооксидаза 0,01, 0,02 единицы/исходная смесь; экстракт Eschscholtzia, 1:10, изменяется. Результаты представлены на фиг. 9, П р и м е р 6. Получение фармацевтической лекарственной формы а) Получение настойки Для получения настойки смешивали изготовленные по примеру 1 спиртовые экстракты высушенных лекарственных растений, а именно 20 мл экстракта высушенного лекарственного растения Corydalis cavae rhixoma и 80 мл экстракта высушенного лекарственного растения Eschscholtiza californial herba. Получают 100 мл готовой к употреблению настойки. б) Получение таблеток Полученные по примеру 1 экстракты из Corydalis cavae rhizoma и Eschscholtzia californicae herba сушили (например лиофилизацией), и сухие экстракты перемешивали в весовом отношении Eschscholtzia/ /Corydalis = 4/1 вместе с измельченным в порошок крахмалом (в качестве фармацевтического вещества-носителя) и формовали на таблетировочном прессе в таблетки (0,5 г, диаметр 0,6 см). Количество экстрактов активного вещества в таблетках составляло 2 вес.%.. 18 26971 17 Таблица 1 t(мин) + ДОПА + ДОПА + ДОПА 500 ммол Фенолаза 5 ммол ммол мЕ +/ мЕ +/ мЕ +/~ мЕ +/ 0 0 0 0 0 0 0 0 2 4 0 23 2,2 70 4.5 4 13 1.5 69 2.9 157 8.1 3,2 117 5.2 236 11 0 6 5 0,53 8 6 1.2 50 2,9 170 4,7 1 15 10 12 1.5 75 .1 223 7.2 4 15 • .. .. .. .. • • 12 о. 14 39 3.1 16 60 4,7 18 84 7.3 20 19 16 91 14 564 16 775 29 30 404 32 562 28 88 21 1090 37 Таблица2 + 3.4-DHB t (мин) + 3,4-DHB 5 ммол Фенолаза 50 ммол мЕ +/ мЕ +/ мЕ +/ 0 0 0 0 0 0 2 6 1,7 27 2.7 4 15 1,3 63 4,8 0 6 8 0,91 33 4.1 102 6,9 •'*' 8 16 1.3 58 6,2 143 13 10 38 2,7 97 11 180 18 20 312 14 355 42 446 42 30 678 29 638 64 712 69 19 20 26971 ТаблицаЗ Обратная Обратная норма концентрация превращения л/(М) 1/(мЕ/мин) 20 ммол 0,05 0,27 40 ммол 0,025 0,173 60 ммол 0,0167 0,0116 80 ммол 0,0125 0,098 100 ммол 0.01 0,076 00 ммол 0,002 0,044 1 ммол 0,001 0,040 20 ммол 0,05 0,163 30 ммол 0,033 0,125 40 ммол 0,025 0,10 0 ммол 0,00 0,081 70 ммол 0,014 0,061 100 ммол 0.01 0,0555 120 ммол 0,0083 0,0525 140 ммол 0,0071 0,0475 160 ммол 0,0063 0,0435 180 ммол 0,006 0,0415 200 міФіол 0, 0,040 1000 ммол 0,001 0, 1400 ммол 0,00071 0, 40 ммол 0,0005 0, ммол 0,0005 0, 0 Концентрация субстрата Область от 20 ммол до 1 ммол ^ = 141 ммол Область от 20 до 70 ммол К м = 145 ммол Область от 100 до 200 ммол К м = 14 ммол Область от 1 до 2 ммол К м - 37 ммол 4 21 22 26971 Таблица4 Обратная Концентрация субстрата концентрация л/(М) Обратная норма превращения 1/(мЕ/мин) Область от 20 ммол до 100 ммол 0,05 0,033 0,025 20 ммол 30 ммол 0,083 0,263 0,057 0,020 0,017 80 ммол 70 ммол 100 ммол 0,045 0,040 0,033 0,110 0,014 40 ммол 60 ммол 0,030 0,080 К„ = 164 ммоль 137 ммол Область от 100 до 200 ммол 100 ммол 120 ммол 0,01 0,0083 140 ммол 0,0071 0,0500 0,0435 • 0,0414 160 ммол 180 ммол 0,0063 0,0383 0,0056 0,005 0,0370 0,0344 200 ммол К,^ =151 ммол Таблицаб Бензальдегид (мЕ/мин) 0,01 единицы МАО 0,02 единицы МАО 8,35±0,50{100%) 18,4*1,0(100%) + 2 мл СО ,30±0,02 (76,4%) 12,6±1,0(68,5%) 4- 4 мл СО ,50±0,0 (65,9%) 1, ±0,46 (66,3%) Таблицаб Бензальдегид (мЕ/мин) МАО 0,01 единицы 2 мл Е СН 4 мл 5 мл 10,3+/-1,40(100%) 5,75 / 0,25 (55,5%) 4,50 / 0, (4 ,7%) 3,50 / 0, ( ,9%) 0,02 единицы 20,0+/-0,(100%) , 11,3 / 0,55(55%) 8,50 / 0,30 (42,5%) 7,50 / 0, 0 (37 — СН2 - С Н - С00 + NH3 Тирозин 1. Гидроксилирование "тирозиназа" НО——СН2 - С Н — С00 У-/ но і Дола 2* Окисление -сн-соо+ I Допахинон NH3 • Допахром полимеризация хинонимин Допахром - таутомераза спонтанно -со 2 Дигидроксиндол \ Дигидрокси-индолкарбоновая кислота меланин 26971 Гидроксилирование тирозина при 303 нм -.02 Область 100 - 200 -.01 j 0 -0.0061 -.01 .02 .03 .04 1 / ( субстрат ) Фиг. 4а .06 т -02 .01 і. .00 -0.00663 і 01 .02 . і,З .0S .06 26971 1mM Область .30.25 Г- 20 s t .5 1 ^ .10.05-.02 -.01 j .0 .01 -0.00707 .02 .03 .04 .05 .06 1 / Субстрат Область 20 - 70 JjM .20 n .15 .10.05 Z -.02 -.011 .00 .01 е -0.0068 ? 02 .03 Ч .05 .06 0/ "J / Концентрация суСотрата Область 100 - 2Q0JJM -.010 I -005 -0.007022 0 .005 ] / Субстрат .010 26971 .О1О-ОО9-Ш-^О7.-Ш»-0О5-Ш-.ООЗ-ХЮ2-.ООО 0 .001.002 -0.0073 1/ Субстрат Реакция фенолазы с 3,4-дигидроксибёнзолом 900 т 10 Время (мин.) 26971 50 рМ 5 J)M Допа Допа 500 ПМ Допа Фенолазаа 10 20 30 Время {мин.) Фиг. 6 Торможение допамин-р-гидроксилаэы 20 40 60 80 100 120 .140 Экстракция в (цл)