Гуманізована специфічна до cd37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну

1. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну, що містить варіабельну ділянку легкого ланцюга й варіабельну ділянку важкого ланцюга, де (і) гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула зв'язує CD37 людини, і (ii) (a) варіабельна ділянка легкого ланцюга включає CDR1 легкого ланцюга, наведену в SEQ ID NO:61 або 62, CDR2 легкого ланцюга, наведену в SEQ ID NO:64, і CDR3 легкого ланцюга, наведену в SEQ ID NO:66, і (b) варіабельна ділянка важкого ланцюга включає CDR1 важкого ланцюга, наведену в SEQ ID NO:63, CDR2 важкого ланцюга, наведену в SEQ ID NO:65, і CDR3 важкого ланцюга, наведену в SEQ ID NO:67, 68, 213 або 219. 2. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну за п. 1, де варіабельна ділянка легкого ланцюга включає амінокислоти 21127 SEQ ID NO:48. 3. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну за п. 1, де варіабельна ділянка важкого ланцюга включає амінокислоти 144-259 SEQ ID NO:48 або 52. 4. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну за п. 1, де варіабельна ділянка легкого ланцюга включає амінокислоти 21127 SEQ ID NO:6, і CDR3 важкого ланцюга являє собою наведену в SEQ ID NO:67. 5. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну за п. 1, де варіабельна ділянка легкого ланцюга включає амінокислоти 21127 SEQ ID NO:48, і CDR3 важкого ланцюга являє собою наведену в SEQ ID NO:67. 6. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну за п. 1, де варіабельна ділянка легкого ланцюга включає амінокислоти 21127 SEQ ID NO:6, і CDR3 важкого ланцюга являє собою наведену в SEQ ID NO:68. 7. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну за п. 1, де варіабельна ділянка легкого ланцюга включає амінокислоти 21127 SEQ ID NO:48, і CDR3 важкого ланцюга являє собою наведену в SEQ ID NO:68. 8. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну за п. 1, де CDR1 легкого ланцюга являє собою наведену в SEQ ID NO:62, і варіабельна ділянка важкого ланцюга включає амінокислоти 144-259 SEQ ID NO:48. 9. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну за п. 1, де CDR1 легкого ланцюга являє собою наведену в SEQ ID NO:61, і варіабельна ділянка важкого ланцюга включає амінокислоти 144-259 SEQ ID NO:48. 10. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну за п. 1, де CDR1 легкого ланцюга являє собою наведену в SEQ ID NO:62, і варіабельна ділянка важкого ланцюга включає амінокислоти 144-259 SEQ ID NO:52. 11. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну за п. 1, де 97469 4 CDR1 легкого ланцюга являє собою наведену в SEQ ID NO:61, і варіабельна ділянка важкого ланцюга включає амінокислоти 144-259 SEQ ID NO:52. 12. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну за п. 1, де варіабельна ділянка легкого ланцюга включає амінокислоти 21-127 SEQ ID NO:6, і варіабельна ділянка важкого ланцюга включає амінокислоти 144259 SEQ ID NO:48. 13. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну за п. 1, де варіабельна ділянка легкого ланцюга включає амінокислоти 21-127 SEQ ID NO:48, і варіабельна ділянка важкого ланцюга включає амінокислоти 144-259 SEQ ID NO:48. 14. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну за п. 1, де варіабельна ділянка легкого ланцюга включає амінокислоти 21-127 SEQ ID NO:6, і варіабельна ділянка важкого ланцюга включає амінокислоти 144259 SEQ ID NO:52. 15. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну за п. 1, де варіабельна ділянка легкого ланцюга включає амінокислоти 21-127 SEQ ID NO:48, і варіабельна ділянка важкого ланцюга включає амінокислоти 144-259 SEQ ID NO:52. 16. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну за п. 1, де гуманізована специфічна до CD37 зв'язувальна молекула являє собою одноланцюжковий поліпептид Fv (scFv), антитіло або його зв’язувальний фрагмент або одноланцюжковий поліпептид, який містить від аміно- до карбоксикінця: специфічний до CD37 scFv, шарнірну область імуноглобуліну і ефекторний домен, який містить домен CH2 та домен CH3. 17. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну за п. 16, де специфічна до CD37 зв’язувальна молекула є химерною або гуманізованою. 18. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну за п. 1, де гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула являє собою одноланцюжковий поліпептид, який містить від аміно- до карбоксикінця: специфічний до CD37 scFv, шарнірну область імуноглобуліну і ефекторний домен, який містить домен CH2 та домен CH3, і де варіабельна ділянка легкого ланцюга приєднана до варіабельної ділянки важкого ланцюга за допомогою лінкерного пептиду, що містить (Gly4Ser)n, де n дорівнює 1, 2, 3, 4, 5 або 6. 19. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну за п. 18, де зв'язані варіабельні ділянки легкого й важкого ланцюгів приєднані до ефекторного домену за допомогою шарнірної області імуноглобуліну, що складається з амінокислотної послідовності, вибраної з групи, яка складається з SEQ ID NO:90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 115, 116, 118, 120, 122, 124, 126 і 127. 20. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну за п. 19, де 5 шарнірна область імуноглобуліну включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:92 або SEQ ID NO:106. 21. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну за п. 19, де ефекторний домен містить домени CH2 та CH3 IgG1. 22. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну за п. 1, яка містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 80 або 84. 23. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну за п. 1, яка містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:48 або SEQ ID NO:52. 24. Гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула імуноглобуліну за будьяким з пп. 1-23, де гуманізована специфічна до CD37 зв’язувальна молекула має спорідненість зв'язування до CD37 людини від приблизно 0,5 нМ до приблизно 10 нМ. 25. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує специфічну до CD37 зв’язувальну молекулу імуноглобуліну за будь-яким з пп. 1-24. 26. Фармацевтична композиція, що містить специфічну до CD37 зв’язувальну молекулу імуноглобуліну за будь-яким з пп. 1-24 і фармацевтично прийнятний носій. 27. Спосіб лікування захворювання, пов'язаного з аберантною активністю В-клітин, що включає введення пацієнту-людині, що потребує цього, ефективної кількості гуманізованої специфічної до CD37 зв’язувальної молекули імуноглобуліну за будь-яким з пп. 1-24. 28. Спосіб за п. 27, де захворювання, пов'язане з аберантною активністю В-клітин, являє собою Вклітинний рак або аутоімунне захворювання. 29. Спосіб за п. 28, де аутоімунне захворювання являє собою ревматоїдний артрит, розсіяний склероз, системний червоний вовчак, хворобу Крона, синдром Шегрена, хворобу Граве, цукровий діабет типу I, псоріаз, імунну тромбоцитопенічну пурпуру, пухирчатку, ідіопатичну запальну міопатію або макроглобулінемію Вальденстрема. 30. Спосіб за п. 28, де В-клітинний рак являє собою неходжкінську лімфому, хронічну лімфоцитарну лейкемію, хворобу Ходжкіна, лімфоми центральної нервової системи, гостру лімфобластну лейкемію, волосатоклітинну лейкемію, хронічну лімфоцитарну лейкемію, множинну мієлому, дрібноклітинну лімфоцитарну лімфому, Вклітинну пролімфоцитарну лейкемію, лімфоплазмоцитарну лімфому, лімфому маргінальної зони селезінки, плазмоцитарну мієлому, солітарну плазмоцитому кісток, позакісткову плазмоцитому, екстранодулярну В-клітинну лімфому маргінальної зони, пов'язану зі слизовою лімфоїдної тканини, нодулярну В-клітинну лімфому маргінальної зони, фолікулярну лімфому, покривноклітинну лімфому, дифузну великоклітинну В-клітинну лі 97469 6 мфому, великоклітинну В-клітинну лімфому середостіння (тимусу), внутрішньосудинну великоклітинну В-клітинну лімфому, первинну ефузійну лімфому, лімфому Беркітта/лейкемію, проліферації В-клітин невизначеного злоякісного значення, лімфоматоїдний грануломатоз, і лімфопроліферативне порушення після трансплантації. 31. Спосіб за п. 27, де гуманізовану специфічну до CD37 зв’язувальну молекулу імуноглобуліну вводять у дозовому діапазоні від приблизно 0,01 мг/кг до приблизно 50 мг/кг. 32. Спосіб за п. 27, де гуманізовану специфічну до CD37 зв’язувальну молекулу імуноглобуліну вводять у дозовому діапазоні від приблизно 5 мг/кг до приблизно 15 мг/кг. 33. Спосіб за будь-яким з пп. 27-32, що додатково включає введення пацієнту-людині ефективної кількості специфічної до CD20 зв’язувальної молекули. 34. Спосіб за п. 33, де специфічна до CD20 зв’язувальна молекула являє собою антитіло або його зв’язувальний фрагмент, або одноланцюжковий поліпептид, який містить від аміно- до карбоксикінця: специфічний до CD37 scFv, шарнірну область імуноглобуліну і ефекторний домен, який містить домен CH2 та домен CH3. 35. Спосіб за п. 34, де специфічна до CD20 зв’язувальна молекула являє собою моноклональне антитіло ритуксимаб або одноланцюжковий поліпептид, який містить від аміно- до карбоксикінця: специфічний до CD20 scFv, шарнірну область імуноглобуліну і ефекторний домен, який містить домен CH2 та домен CH3, як наведено в SEQ ID NO:4. 36. Спосіб за будь-яким з пп. 27-32, що додатково включає введення пацієнту-людині ефективної кількості специфічного до CD37 антитіла або його зв’язувального фрагмента. 37. Спосіб за п. 36, де специфічне до CD37 антитіло має гуманізований зв’язувальний домен антитіла, вибраного з G28-1, MB371, BL14, NMN46, IPO24, HH1 і WR17. 38. Спосіб за будь-яким з пп. 27-32, що додатково включає введення пацієнту-людині ефективної кількості цитокіну, хемокіну, фактора росту, хіміотерапевтичного засобу, радіотерапевтичного засобу, модифікатора біологічних реакцій у відповідь, адренокортикостероїду/антагоністу або імуносупресивного засобу. 39. Спосіб за п. 38, де пацієнту-людині вводять хіміотерапевтичний засіб, і де хіміотерапевтичний засіб являє собою алкілуючий агент, аналог піримідину або аналог пурину. 40. Спосіб за п. 38, де пацієнту-людині вводять хіміотерапевтичний засіб, і де хіміотерапевтичний засіб являє собою флударабін або хлорамбуцил. 41. Спосіб за п. 38, де пацієнту-людині вводять модифікатор біологічних реакцій у відповідь, де модифікатор біологічних реакцій у відповідь являє собою G-CSF або GM-CSF. 7 Дана заявка заявляє пріоритет згідно §119 35 U.S.C. заявки на патент США № 60/702499, поданої 25 липня 2005 p., заявки на патент США № 60/798344, поданої 16 травня 2006 p., кожна з яких в повному об'ємі включена посиланням. Даний винахід в основному належить до способів зниження кількості В-клітин у індивідуума з використанням CD37-специфічних зв'язувальних молекул. Зокрема, винахід належить до способів зниження кількості В-клітин з використанням тільки одних CD37-специфічних зв'язувальних молекул або комбінації СD37-специфічних зв'язувальних молекул і СD20-специфічних зв'язувальних молекул, у деяких випадках синергічної комбінації. Винахід додатково належить до речовин і способів лікування захворювань, що включають аномальну активність В-клітин. У звичайній ролі імунна система людини захищає організм від пошкоджень в результаті впливу чужорідних речовин і патогенів. Один шлях, за допомогою якого імунна система захищає організм, полягає в продукуванні спеціалізованих клітин, які називаються В-лімфоцитами або Вклітинами. В-клітини продукують антитіла, які зв'язуються з чужерідною речовиною або патогеном і в деяких випадках опосередковують їх руйнування. У той же час в деяких випадках імунна система людини і, зокрема, В-лімфоцити імунної системи людини, стають пошкодженими і приводять до розвитку захворювання. Існують численні злоякісні пухлини, патогенез яких включає неконтрольовану проліферацію В-клітин. Також є численні аутоімунні захворювання, в розвитку яких бере участь продукування В-клітинами антитіл, які замість зв'язування з чужерідними речовинами і патогенами зв'язуються з системами організму. Такі антитіла в деяких випадках називають аутоантитілами. Крім того, є численні аутоімунні і запальні захворювання, які включають патологію В-клітин, наприклад, у вигляді неадекватної презентації антигену Вклітинами для Т-клітин, або інших шляхів, в яких беруть участь В-клітини. Наприклад, у мишей, схильних до аутоімунних захворювань з дефіцитом В-клітин, не відбувається розвитку аутоімунного захворювання нирок, васкуліту або продукування аутоантитіл. Дивись Shlomchic et al., J. Exp. Med., 180: 1295-306 (1994). Цікаво, що у тих же мишей, схильних до аутоімунних захворювань, які мають В-клітини, але з недостатністю продукування імуноглобулінів, відбувається розвиток захворювань в експерименті, як описано Chan et al., J. Exp. Med., 189: 1639-48 (1999), цей факт вказує на те, що В-клітини відіграють істотну роль в розвитку аутоімунних захворювань. В-клітини можна ідентифікувати по молекулах на їх клітинній поверхні. CD20 була першою людською диференціювальною, специфічною для Вклітин поверхневою молекулою, ідентифікованою за допомогою моноклональних антитіл. Вона являє собою неглікозильований, гідрофобний Вклітинний трансмембранний фосфопротеїн масою 35 кДа, у якого обидва - аміно- і карбоксикінці 97469 8 розташовані всередині клітини. Дивись Einfeld et al., EMBO J., 7: 711-17 (1998). CD20 експресується всіма нормальними зрілими В-клітинами, але не експресується попередниками В-клітин або плазматичними клітинами. Природні ліганди для CD20 не встановлені, і повністю ще не зрозуміла функція CD20 в біології В-клітин. Іншою диференціювальною, специфічною для В-клітин поверхневою молекулою є CD37. CD37 представляє сильно глікозильований білок масою 40-52 кДа, який належить до чотиривимірного трансмембранного сімейства клітинних поверхневих антигенів. Він перетинає клітинну мембрану чотири рази, утворюючи дві позаклітинні петлі і розташовуючи свої аміно- і карбоксикінці в цитоплазмі. CD37 інтенсивно експресується на нормальних продукуючих антитіла (slg+) B-клітинах, але не експресується на попередниках В-клітин або плазматичних клітинах. Експресія CD37 на спочиваючих і активованих Т-клітинах, моноцитах і гранулоцитах є низькою, і відсутня скільки-небудь детектована експресія CD37 на природних клітинах-кілерах, тромбоцитах або еритроцитах. Дивись Belov et al., Cancer Res, 61(11): 4483-4489 (2001); Schwartz-Albiez et al., J. Immunol, 140(3): 905-914 (1988) і Link et al, J. Immunol, 137(9): 30133018 (1988). Крім нормальних В-клітин, майже всі злоякісні клітини, похідні В-клітин, є позитивними на експресію CD37, включаючи CLL, NHL і волосатоклітинної лейкемії [Moore et al. Journal of Pathology, 152: 13-21 (1987); Merson and Brochier, Immunology Letters, 19: 269-272 (1988) і Faure et al, American Journal of Dermatopathology, 12(3) (1990)]. CD37 бере участь в регуляції функції Вклітин, оскільки було встановлено, що у мишей з відсутністю CD37 є низькі рівні IgGl в сироватці крові і порушення у них гуморальної відповіді на вірусні антигенні і модельні антигени. Виявилося, що він функціонує як некласична костимуляторна молекула або при безпосередньому впливі на презентацію антигену за допомогою утворення комплексу з молекулами МНС класу II. Дивись Knobeloch et al., Мої. Cell Biol., 20(15): 5363-5369 (2000). Також ймовірно, що CD37 відіграє роль в передачі сигналів TCR. Дивись Van Spriel et al., J. Immunol., 172: 2953-2961 (2004). Проводили дослідження і розробляли лікарські препарати на основі концепції, що диференціювальні, специфічні для В-клітин поверхневі молекули, такі як CD37 або CD20, можуть самі представляти мішені для антитіл, які будуть зв'язуватися з ними і опосередковувати руйнування В-клітин, що приводять до розвитку злоякісних або аутоімунних захворювань, які мають на їх поверхні CD37 або CD20. Названі засобами «імунотерапії» антитіла, отримані (або на основі отриманих антитіл) на тваринах, відмінних від людини, які зв'язуються з CD37 або CD20, вводили пацієнтам для виснаження В-клітин, що приводять до розвитку злоякісних або аутоімунних захворювань. 135 Одне антитіло проти CD37 мітили І і проводили його тестування в клінічних випробуваннях для лікування NHL. Дивись Press et al., J. Clin. Oncol., 7(3): 1027-1038 (1989); Bernstein et al., 9 Cancer Res. (Suppl.), 50: 1017-1021 (1990); Press et al., Front. Radiat. Ther. Oncol., 24: 204-213 (1990); Press et al., Adv. Exp. Med. Biol, 303: 91-96 (1991) і Brown et al, Nucl. Med. Biol, 24: 657-663 (1997). Антитіло, MB-1, являє собою мишаче моноклональне IgGl-антитіло, у якого відсутні опосередковані Fc ефекторні функції, такі як антитілозалежна клітинна цитотоксичність (ADCC), і МВ-1 не придушує зростання пухлин на моделі ксенотрансплантатів в умовах in vivo, якщо тільки в нього не введена ізотопна мітка (Buchsbaum et al. Cancer Res, 52(83): 6476-6481 (1992). Спостерігали сприятливий розподіл 1351-MB-1 у пацієнтів з лімфомою при низькому пухлинному навантаженні (5 або по SLEDAI >2 розглядається як показник клінічно активного захворювання. Реакцію у відповідь на лікування можна трактувати у вигляді поліпшення або стабілізації по 2 показниках активності захворювання (індексу активності системного червоного вовчака [SLEDAI] і шкалі активності системного червоного вовчака і по 2 показниках якості життя (оцінка пацієнта загалом і шкала Krupp Fatigue Severity Scale) (Petri et al., Arthritis Rheum., 2004, 50: 2858-68). Також передбачається, що введення зв'язувальної молекули пацієнтам з SLE приводить до зниження рівня антитіл проти дволанцюжкової ДНК. Альтернативно про поліпшення можна судити по критеріях оцінної системи British Assessment Group Criteria (BILAG). Також передбачається, що у пацієнтів з розсіяним склерозом, які піддались лікуванню за винаходом, наступає поліпшення по значенню клінічних балів оцінної шкали Kurtzke Expanded Disability (EDSS) (Kurtzke, F., Neurology 1983, 33: 1444-52) щонайменше на 0,5 або сповільнення клінічного прогресування захворювання щонайменше на 1,0 по шкалі Kurtzke (Rudick et al., Neurology 1997, 49: 358-63). Додатково передбачається, що у пацієнтів з ІІМ, які одержують CD37-специфічні і СD20специфічні зв'язувальні молекули, має місце зниження одного з п'яти критеріїв по оцінній системі Idiopathic Inflammatory Myopathy Criteria (IIMC) (Miller F., вище). Також передбачається, що введення пацієнтам з ІІМ приводить до зниження пов'язаних з ІІМ факторів, вибраних з групи, яка складається з креатинкінази (СК), лактатдегідрогенази, альдолази, С-реактивного білка, аспартатамінотрансферази (ACT), аланінамінотрансферази (АЛТ) і антинуклерного аутоантитіла (ANA), специфічних для міозиту антитіл (MSA) і антитіл проти ядерних антигенів, що екстрагуються. Альтернативно, у пацієнтів є 3 з 6 критеріїв, приведених Rider et al., Arthritis Rheum., 50(7): 22812290 (2004), без погіршення не більш ніж по 2 критеріях. У деяких варіантах здійснення у пацієнтів з Вклітинною злоякісною пухлиною, які отримують лікування за винаходом, має місце позитивна загалом реакція на лікування при її оцінці по клінічних показниках, добре відомих і звичайно використовуваних в даній галузі, і описаних нижче, таких як зменшення розмірів пухлин, зниження числа пухлин і/або ослаблення симптомів захворювання. Зразкові клінічні критерії приведені Національним інститутом рака (NCI), який поділяє деякі види групи злоякісних пухлин на клінічні категорії «повільно протікаючі» і «агресивні» лімфоми. «Повільно протікаючі» лімфоми включають фолікулярні клітинні лімфоми, що поділяються по їх цитології на «категорії», дифузну дрібноклітинну лімфоцитарну лімфому/хронічну ліфоцитарну лейкемію (CLL), лімфоплазмоцитоїдную/макроглобулінемію Вальденстрема, лімфому маргінальної зони і волосатоклітинну лейкемію. «Агресивні» лімфоми включають дифузну змішану і великоклітинну лімфому, лімфому Беркіт 45 та/дифузну дрібноклітинну лімфому, лімфобластну лімфому, покривноклітинну лімфому і пов'язану зі СНІДом лімфому. У деяких випадках застосовують міжнародний прогностичний індекс (ІРІ) для агресивної і фолікулярної лімфоми. Фактори, які потрібно враховувати при використанні ІРІ, включають вік (вік 60 років), активність лактатдегідрогенази в сироватці крові (нормальні рівні проти підвищених), стан активності (0 або 1 проти 2-4) (дивись визначення нижче), стадію захворювання (І або II проти III або IV) і ураження областей крім лімфатичних вузлів (0 або 1 проти 2-4). Пацієнти з наявністю 2 або більше факторів ризику мають 50%-ний шанс відсутності рецидивів або виживання загалом протягом 5 років. Стан активності ІРІ при агресивній лімфомі визначають таким чином: опис категорії: 0 - повністю активний, здатний до активності, схожої з такою до початку захворювання, без обмежень; 1 - обмежений в фізичній, яка вимагає зусиль активності, але жвавий і здатний виконувати легку або сидячу, наприклад, легку домашню роботу, роботу в офісі; 2 - жвавий і здатний доглядати за собою, але не здатний до якої-небудь діяльності, до і приблизно більш ніж 50% часу не спить; 3 здатний тільки до обмеженого догляду за собою, в 50% часу проводить в ліжку або кріслі; 4 - повністю безпорадний, не здатний доглядати за собою, повністю обмежений постіллю або кріслом; і 5 - смерть. (Дивись The International NonHodgkin's Lymphoma Prognostic Factors Project. A predictive model for aggressive non-Hodgkin's lymphoma. N. Engl. J. Med. 329: 987-94, 1993). Як правило, категорію лімфоми клінічно оцінюють з використанням положення про те, що лімфоми низької категорії, як правило, виявляються у вигляді захворювання лімфатичних вузлів і часто є в'ялопротікаючий або повільно зростаючими. Звичайно лімфоми проміжної або високої категорії протікають у вигляді значно більш агресивного захворювання з великим пухлинним навантаженням крім лімфатичних вузлів. Класифікаційна система Ann Arbor також використовується для оцінки прогресування пухлин, зокрема, неходжкінських лімфом. Згідно з даною системою лімфоми стадій І, II, III і IV у дорослих пацієнтів з NHL можна класифікувати в категорії А і В в залежності від того, чи є у пацієнта добре виражені, генералізовані симптоми (В) або ні (А). Позначення В дається пацієнтам з наступними симптомами: втрата, що не піддається поясненню більш ніж 10% маси тіла протягом 6 місяців до встановлення діагнозу, нез'ясовна лихоманка з підвищенням температури тіла вище 38°С і інтенсивне потовиділення вночі. Визначення стадій є наступним: стадія І ураження одного лімфатичного вузла або локалізоване ураження одного органу або області поза лімфатичним вузлом. Стадія II ураження двох або більше лімфатичних вузлів з одного боку діафрагми або локалізоване ураження одного органу або області поза лімфатичним вузлом і його регіональними лімфатичними вузлами з або без інших лімфатичних вузлів з одного боку діафрагми. Стадія III ураження лім 97469 46 фатичних вузлів з обох сторін діафрагми, що можливо супроводжується локалізованим ураженням органу або області поза лімфатичними вузлами, ураженням селезінки або обома видами уражень. Стадія IV дисеміноване (мультифокальне) ураження однієї або більше області поза лімфатичними вузлами з або без асоційованого ураження лімфатичних вузлів або окреме ураження органу поза лімфатичними вузлами з ураженням віддалених (нерегіональних) лімфатичних вузлів. Додаткові деталі дивись в "The International Non-Hodgkin's Lymphoma Prognostic Factors Project: A predictive model for aggressive non-Hodgkin's lymphoma", New England J. Med., (1993) 329: 987-994. У одному аспекті терапевтичний ефект способів за винаходом визначається по рівню реакції у відповідь, наприклад, часткова реакція у відповідь визначається як зменшення пухлини до розміру, що складає менше за половину від її первинного розміру. Повна реакція визначається як повна елімінація захворювання, підтверджена при клінічному або радіологічному обстеженні. У одному варіанті здійснення у індивідуума, який піддався лікуванню за винаходом, є щонайменше часткова реакцію у відповідь на лікування. Згідно з критеріями Cheson, що використовуються для оцінки NHL, розробленими спільно з Національним інститутом рака (Cheson et al., J. Clin. Oncol. 1999, 17: 1244; Grillo-Lopez et al., Ann. Oncol. 2000, 11: 399-408), повну реакцію у відповідь отримують, коли є повне зникнення всіх детектованих клінічних ознак, ознак захворювання, що виявляються радіографічними методами, і пов'язаних із захворюванням симптомів, всі лімфатичні вузли повертаються до свого нормального розміру, селезінка меншає в розмірі і в кістковому мозку відсутня лімфома. Непідтверджену повну реакцію у відповідь отримують, коли у пацієнта спостерігають повне зникнення захворювання і зменшення розміру селезінки, і лімфатичні вузли зазнають регресії більш ніж на 75%, і не визначений стан кісткового мозку. Непідтверджена повна реакція у відповідь відповідає і перевищує критерії для часткову реакцію у відповідь. Загалом, реакцію оцінюють як зниження пухлинного навантаження щонайменше на 50%. Аналогічні критерії були розроблені для різних інших форм злоякісних захворювань або гіперпроліферативних захворювань, і їх можуть легко знайти фахівці в даній галузі. Дивись, наприклад, Cheson et al., Clin. Adv. Hematol. Oncol. 2006, 4: 4-5, де описуються критерії для оцінки CLL; Cheson et al., J. Clin. Oncol. 2003, 21: 4642-9, де описуються критерії для оцінки AML; Cheson et al., Blood 2000, 96: 3671-4, де описуються критерії для оцінки мієлодиспластичних синдромів. У іншому аспекті реакція у відповідь на лікування у пацієнтів з В-клітинним злоякісним захворюванням виражається у вигляді сповільнення прогресування захворювання в порівнянні з пацієнтами, які не одержують терапію. Визначення уповільненого прогресування захворювання або будь-якого з вказаних вище чинників можна 47 провести з використанням методів, добре відомих в даній галузі, включаючи сканування кісток, СТ-сканування, сканування з використанням галію, лімфангіограму, MRI, РЕТ-сканування, ультразвукове дослідження і тому подібне. Також, очевидно зрозуміло, що схему лікування можна змінювати, якщо застосовуються традиційні лікарські препарати в комбінації з препаратами за винаходом. Як додатковий аспект винахід включає набори, які містять одну або більше сполук або композиції, придатних для способів за винаходом, упакованих таким чином, щоб полегшити їх застосування в практиці способів за винаходом. У найпростішому варіанті здійснення такий набір містить сполуки або композицію, описані тут, як придатні для практичного застосування способу за винаходом, упаковані в контейнері, такому як запаяний бутель або резервуар, з етикеткою, прикріпленою до контейнера або вкладеною в упаковку, на якій описане застосування сполуки або композиції для практичного використання способу за винаходом. Переважно сполуки або композиція вміщені в разову лікарську форму. Набір може додатково містити пристрій, відповідний для введення композиції переважним шляхом введення або для постановки скринінгового тесту. Набір може включати етикетку, на якій описане застосування композиції(й) зв'язувальної молекули в способі за винаходом. Даний винахід також включає промислові вироби. Такі вироби включають СD37-специфічні зв'язувальні молекули і СD20-специфічні зв'язувальні молекули, необов'язково разом з фармацевтичним носієм або розріджувачем і щонайменше одну етикетку, на якій описаний спосіб застосування зв'язувальних молекул за винаходом. Такі промислові вироби можуть необов'язково включати щонайменше один другий засіб для введення разом із зв'язувальними молекулами. Даний винахід також належить до застосування композиції, що містить CD37-специфічну зв'язувальну молекулу або СD37-специфічну і СD20-специфічну зв'язувальні молекули у виробництві лікарського препарату для лікування або профілактики захворювання, пов'язаного з аномальною активністю В-клітин. Короткий опис фігур На фігурі 1А схематично приведена структура молекули TRU-016; на фігурі 1В представлені результати аналізу SDS-PAGE, які показують, що експресований білок мігрує відповідно до молекулярної маси, яка дорівнює приблизно 110 кДа в невідновлюваних умовах і приблизно 52 кДа в відновлювальних умовах; і на фігурі 1С показано, що молекула TRU-016 виявляє високий рівень специфічного зв'язування з В-клітинами периферичної крові людини і істотно більш низький рівень зв'язування з іншими клітинними субпопуляціями серед клітин, відмінних від В-клітин (CD 19 негативних популяції), при аналізі проточною цитометрією. На фігурі 2А-Е показане інгібування зв'язування під дією різних реагентів з направленою дією проти CD37. 97469 48 На фігурі 3А показано зв'язування FITC Clq з молекулами TRU-016 при інкубації з В-клітинами Ramos в нормальній сироватці людини з і без фактора з отрути кобри (CVF); на фігурі 3В показана CDC активність молекул TRU-016 при інкубації з В-клітинами Ramos в нормальній сироватці людини з і без CVF; і на фігурі 3С показана CDC активність молекул TRU-016 при інкубації з В-клітинами Ramos і людським або кролячим комплементом. На фігурі 4 показані хроматограми гельфільтрації (SEC) при високому тиску (ВЕРХ), отримані при GPC очищенні TRU-016, при побудові графіка залежності поглинання проти часу втримання для різних зібраних фракцій. На фігурі 5А показані зв'язувальні властивості фракцій, отриманих при SEC; на фігурі 5В приведені дані по CDC активності фракцій, отриманих при SEC; і на фігурі 5С показана ADCC активність фракцій, отриманих при SEC. На фігурі 6 приведені дані по CDC активності TRU-015, ритуксану, TRU-016 або їх комбінацій на В-клітинах Ramos. На фігурі 7 показаний вплив TRU-016 на CDC активність TRU-015 на В-клітинах DHL-4. На фігурі 8 показаний вплив TRU-016 на CDC активність TRU-015 і ритуксану. На фігурі 9 показаний вплив TRU-016 на TRU-015 в тесті визначення CDC активності. На фігурі 10 показаний вплив TRU-016 на ритуксан в тесті визначення CDC активності. На фігурі 11 показана взаємодія TRU-015 і TRU-016 в тесті визначення ADCC активності з використанням клітин BJAB. На фігурі 12 показана взаємодія TRU-015 і TRU-016 в тесті визначення ADCC активності з використанням клітин Daudi. На фігурі 13 показана взаємодія TRU-015 і TRU-016 в тесті визначення ADCC активності з використанням клітин Ramos. На фігурі 14 показаний вплив ритуксану, TRU-016 і їх комбінації на специфічну загибель клітин BJAB. На фігурі 15 показаний вплив ритуксану, TRU-016 і їх комбінації на специфічну загибель клітин BJAB. На фігурі 16 показаний вплив TRU-015, TRU016 і їх комбінації на специфічну загибель клітин BJAB. На фігурі 17 показаний вплив TRU-015, TRU016 і їх комбінації на специфічну загибель клітин BJAB. На фігурах 18A-D показано, що димери TRU016 не опосередковують одну CDC, але посилюють CDC активність ритуксимабу в умовах in vitro. На фігурах 19А-В показано, що очищений на протеїні A TRU-016 індукує апоптоз клітин Ramos і Daudi, в той час як для димерів необхідне перехресне зв'язування. На фігурі 20 показано, що TRU-016 переважно знижує кількість нормальних В-клітин з культур РВМС. На фігурі 21 показана ефективність TRU-016 в порівнянні з hulgG, ритуксаном і комбінованою 49 обробкою TRU-016 і ритуксану відносно об'єму пухлин у тварин. На фігурах 22А і В показано, що димери TRU016 виявляють високу протипухлинну активність за даними визначення об'єму пухлин і процента виживаності на моделі ксенотрансплантатів пухлин. На фігурі 23 показано, що димери TRU-016 не посилюють CDC активність за результатами обробки специфічними реагентами для МНСІІ, CD 19, CD80/86 або CD45. На фігурі 24 представлені дані по проценту виживаності мишей з пухлинами Ramos (період спостережень до 90 діб) після обробки TRU-016, ритуксимабом і їх комбінацією. На фігурах 25 і 26 представлений процент загибелі мишей з пухлинами Daudi (період спостережень до 90 діб) після обробки TRU-016 або ритуксимабом. На фігурі 27 показано, що TRU-016 ефективно знижував відносну життєздатність клітин, оброблених флударабіном, тим самим, потенціюючи цитотоксичну дію одного флударабіну. На фігурі 28 показано, що TRU-016 індукував більш високу токсичність для клітин в порівнянні з герцептином або ритуксимабом на резистентних до ритуксимабу клітинних лініях. На фігурі 29 показано, що TRU-016 індукував фосфорилювання тирозину в CD 19+ В-клітинах первинної CLL. На фігурі 30А приведена консенсусна амінокислотна послідовність гуманізованої конструкції TRU-016 No.019001 (SEQ ID NO:6) і TRU-016 (SEQ ID NO:2) за системою нумерації Kabat; на фігурі 30В показані зіставлення амінокислотних послідовностей трьох гуманізованих конструкцій TRU-016 (019001, 019008 і 109009). На фігурі 31 приведені зіставлення ДНК- і амінокислотних послідовностей трьох гуманізованих конструкцій TRU-016 (019001, 019041 і 019044). На фігурі 32 представлені зіставлення послідовностей в форматі FASTA тих же трьох гуманізованих конструкцій TRU-016 (019001, 019041 і 019044). Приклади Додаткові аспекти і докладні деталі винаходу стануть очевидними з подальших прикладів, які призначаються для ілюстрації, а не обмеження. У прикладі 1 описане отримання СD37-специфічної зв'язувальної молекули; в прикладі 2 показано, що TRU-016 і різні CD37-специфічні антитіла розпізнають одні і ті ж або епітопи, що перекриваються; в прикладі 3 показано, що TRU-016 мало активний в зв'язуванні Clq і активуванні класичного шляху активації комплементу; в прикладі 4 показана активність і зв'язування мультимерів TRU-016; в прикладі 5 описане отримання СD20специфічної зв'язувальної молекули; в прикладі 6 показано, що комбінації TRU-016 з TRU-015 або ритуксаном синергічно посилюють апоптоз Вклітин; в прикладі 7 показано, що комбінації TRU016 з СD20-специфічними антитілами або SMIP синергічно посилюють CDC; в прикладі 8 показано, що TRU-016 посилює ADCC і CDC активність 97469 50 CD20-специфічних антитіл і SMIP; в прикладі 9 показано, що TRU-016 індукує апоптоз В-клітин; в прикладі 10 показано, що комбінації СБ37специфічних SMIP з CD20-специфічним антитілом синергічно зменшують об'єм пухлин на моделі пухлинних ксенотрансплантатів на мишах; в прикладі 11 показано, що СD37-специфічні SMIP одні також зменшують об'єм пухлин на моделі пухлинних ксенотрансплантатів на мишах; в прикладі 12 показано, що TRU-016 не надає впливу на CDC активність відносно інших поверхневих рецепторів В-клітин; в прикладі 13 показано, що TRU-016 не посилює CDC активність відносно різних рецепторів-мішеней, включаючи МНСІІ, CD 19, CD80/86 і CD40; в прикладі 14 представлені додаткові дані, що показують, що TRU-016 підвищує виживаність мишей з пухлинами в умовах in vivo; в прикладі 15 показано, що TRU-016 потенціює індуковану флударабіном загибель клітин CLL в умовах in vitro; в прикладі 16 показано, що TRU-016 індукує прямий цитотоксичний ефект відносно резистентних до ритуксимабу клітин; в прикладі 17 показано, що TRU-016 індукує фосфорилювання тирозину в CD 19+ В-клітинах первинної CLL; і в прикладі 18 приведені молекули гуманізованих TRU-016. Приклад 1 Отримання СD37-специфічної зв'язувальної молекули CD37-специфічні SMIP описані в спільній заявці на патент США № 10/627556 і патентних публікаціях США № 2003/133939, 2003/0118592 і 2005/0136049. Отримували зразковий SMIP, TRU016, як описано нижче. TRU-016 [G28-1 scFv VH11S (SSC-P)H WCH2 WCH3] представляє рекомбінантний одноланцюжковий білок, який зв'язується з антигеном CD37. Зв'язувальний домен оснований на послідовності антитіла G28-1, раніше розкритій в патентних публікаціях, перерахованих в попередньому абзаці, розкриття яких включене тут посиланням. Зв'язувальний домен пов'язаний з ефекторним доменом, СН2 і СН3 областями людського IgGl за допомогою модифікованої шарнірної області. TRU-016 в розчині знаходиться у вигляді димера, і димер має теоретичну молекулярну масу, яка дорівнює приблизно 106000 дальтон. Виділяли загальну фракцію РНК з гібридоми, яка продукує G28-1, з використанням реагенту на РНК Triazol (Gibco), слідуючи інструкціям виготовлювача. Отримували кДНК з використанням 5 мкг РНК, довільних праймерів і зворотної транскриптази Superscript II (Gibco BRL). Варіабельні області клонували з використанням пулів вироджених праймерів для сімейств генів різних мишачих VL або VH. Варіабельні області з гібридоми G28-1 клонували в клонуючі вектори PCR 2.1 ТОРО (Invitrogen) і секвенували ДНК з трансформантів з вставками потрібного розміру. Потім варіабельні області важкого і легкого ланцюгів з потрібних клонів використовували як матрицю для ампліфікації ПЛР G28-1 scFv, сполученого разом в орієнтації VL-VH, з лінкер 15 аа (gly4ser3). scFv проти CD37 приєднували до модифікованої шарнірної області людського IgGl, 51 областей СН2 і СН3 (дивись фігуру 1А). Для гарантії адекватної експресії клітинами ссавців відбирали модифікації варіабельних областей, що дозволяють забезпечити істотне посилення експресії в клітинах ссавців. Зокрема, лейцин замінювали на серин в положенні 11 scFv. Передбачуваний зрілий пептид був довжиною 473 амінокислоти. Полінуклеотидна послідовність, що кодує TRU-016, і амінокислотна послідовність TRU-016 відповідно представляють SEQ ID NO:1 і 2. TRU-016 отримували технологією рекомбінантної ДНК в експресуючій системі клітин ссавців, клітинах яєчників золотистого хом'яка (СНО). Трансфіковані клітини СНО, які продукують SMIP, культивували в біореакторі з використанням прийнятного середовища. TRU-016 SMIP виділяли з культуральних супернатантів СНО афінною хроматографією на протеїні А. С використанням dPBS колонку з 50 мл rПротеїн А/сефароза FF (GE Healthcare rProtein A Sepharose FF, Catalog# 17-0974-04) врівноважували з швидкістю потоку 5,0 мл/хв. (150 см/год.) 1,5 об'ємами колонки (CV). Культуральний супернатант наносили на колонку з rПротеїн А/сефароза FF з швидкістю проточної рідини 1,7 мл/хв. з використанням повітряного зонда АКТА 100 (GE Healthcare АКТА Explorer 100 Air, номер по каталогу #18-1403-00), із захопленням рекомбінантного TRU-016. Колонку промивали dPBS в кількості 5 об'ємів колонки (CV), потім 1,0 М NaCl, 20 мМ фосфатом натрію, рН 6,0, і потім 25 мМ NaCl, 25 мМ NaOAc, рН 5,0. Дані стадії промивання приводили до видалення неспецифічно зв'язаних білків клітин-хазяїв СНО з колонки з rПротеїном А, які вносять свій внесок в осадження продукту після елюювання. Рекомбінантний TRU-016 елюювали з колонки 100 мМ гліцину, рН 3,5. Отримували фракції елюйованого продукту об'ємом 10 мл і потім елюйований продукт доводили до рН 5,0 0,5М 2(N-морфоліно)етансульфоновою кислотою (MES), рН 6,0 в кількості 20% від елюйованого об'єму. Даний елюйований продукт отримували для очищення GPC концентруванням проби приблизно до 25 мг/мл TRU-016 і потім стерилізували пропусканням через фільтр для очищення GPC. Потім очищений білок піддавали GPC гельфільтрації (SEC) для додаткового очищення молекули TRU-016 (димера) від агрегатів з більш високою молекулярною масою. При використанні dPBS колонку ХК 50/100 (пуста хроматографічна колонка GE Healthcare XK 50/100, номер по каталогу #18-8753-01), що містить 1 л сефарози Superdex 200 FF, врівноважували з швидкістю потоку 12,6 мл/хв. (38 см/година) 1,5 об'ємами колонки. Максимальний об'єм 54 мл (3% CV) проби наносили на колонку. Колонку продовжували елюювати з швидкістю 12,6 мл/хв., і елюйований білок фракціонували на фракції по 40 мл. Кожну фракцію аналізували на якість продукту з використанням аналітичної ВЕРХ, і елюйовані фракції TRU-016 з >95% РОІ (які не піддались агрегації) об'єднували. Дану отриману об'єднану 97469 52 фракцію стерилізували пропусканням через фільтр з розміром пор 0,22 мкм. Потім речовину концентрували і переводили в розчин 20 мМ фосфату натрію і 240 мМ сахарози з отриманим рН 6,0. Композицію фільтрували перед перенесенням в скляні флакони з концентрацією 10 мг/мл. Кожний скляний флакон містив 5 мл TRU-016 (50 мг/флакон). Білок TRU-016 також піддавали аналізу SDSPAGE на гелях з 4-20% Тріс-гліцином Novex (Invitrogen, San Diego, CA). Проби наносили з використанням буфера для зразків SDS Трісгліцин Novex (2x) в відновлювальних умовах (додання 1/10 об'єму відновника для проб NuPAGE) або невідновлювальних умовах після нагрівання при 95°С протягом 3 хв. з подальшим проведенням електрофорезу при 150 В протягом 90 хв. Електрофорез проводили з використанням буфера для електрофорезу їх Тріс-гліцин Novex SDS (Invitrogen). Гелі після електрофорезу забарвлювали фарбою Кумассі SDS-PAGE R-250 протягом 30 хв. при струшуванні, і фарбу видаляли щонайменше протягом 1 год. Передбачуване значення молекулярної маси зрілого пептиду становить 51,5 кДа. У відновлювальних умовах рекомбінантний білок мігрує відповідно передбачуваній молекулярній масі. У невідновлюваних умовах молекула мігрує відповідно масі, що становить приблизно 150 кДа (фігура 1В). Також проводили досліди з метою визначення того, що специфічність зв'язування вихідного антитіла з клітинним поверхневим рецептором CD37 зберігається у TRU-016. Людські РВМС виділяли в градієнті щільності середовища для розділення лімфоцитів і інкубували з некон'югованим TRU-016 і РЕ-кон'югованими антитілами проти людського CD 19. Клітини промивали і інкубували з FITC GAH IgG 1:100 (Fc-специфічним) протягом 45 хв. на льоду. Клітини промивали і аналізували двоколірною проточною цитометрією на цитометрі FACsCalibur з використанням програмного забезпечення CellQuest. Клітини аналізували з вікном збудження на В-лімфоцити або відмінні від В-лімфоцитів при фарбуванні CD 19. При збільшенні концентрацій TRU-016 сигнал FITC на В-лімфоцитах (CD 19 позитивне вікно) швидко зростав від 0,01-1,0 мкг/мл доти, поки він не досягав насичення приблизно при 1 мкг/мл або середнього значення інтенсивності флуоресценції (MFI), що дорівнює 1000. У протилежність фарбування популяції клітин, відмінних від Влімфоцитів, зазнавало детектування, але було дуже слабким і повільно зростало з підвищенням концентрації scFvlg. Таким чином, характер фарбування мишачим моноклональним антитілом G28-1 зберігається у TRU-016 (фігура 1С). CD37-зв'язувальні молекули за винаходом мають структури (зв'язувальні області з антитіла, варіанти шарнірної області, де СН2СНЗ області є такими ж або іншими, і різних ізотипів). Приклад 2 TRU-016 і різні CD37-специфічні антитіла зв'язуються з одними і тими ж або епітопами, що перекриваються, в CD37 53 Проводили досліди з метою ідентифікації епітопу CD37, що зв'язується з TRU-016 і іншими описаними раніше СВ37-специфічними антитілами. Некон'юговані МВ371 (#555457) і FITCкон'юговані МВ371 (#555456) отримували від BD Pharmingen (San Jose, CA), FITC-кон'юговані BL14 (#0457) - від Immunotech/Beckman Coulter (Fullerton, CA), FITC-кон'юговані NMN46 (#RDICBL 136FT) і некон'юговані NMN46 (#RDI-CBL 136) - від RDI (Flanders, NJ), FITC-кон'юговані IPO24 (#186-040) і некон'юговані ІРО24 (#186020) - від Ancell Corporation (Bayport, MN), FITCкон'юговані HHI (#3081) і некон'юговані ННІ (#3080) - від DiaTec. Com. (Oslo, Norway) і FITCкон'юговані WR17 (YSRTMCA483F) і некон'юговані WR17 (YSRTMCA483S) - від Accurate Chemical & Scientific (Westbury, NY). Білок TRU-016 отримували, як описано в прикладі 1. TRU-016 кон'югували з FITC в Trubion з використанням набору для введення мітки Molecular Probes Fluororeporter FITC (F6434), слідуючи інструкціям виготовлювача, таким чином: цікавлячий пік білка TRU-016 (POI) з концентрацією 13,5 мг/мл доводили до 5 мг/мл з використанням PBS. 1 мг (200 мкл) вносили в пробірки, що є в наборі, з перемішуючим стержнем і додавали 1М NaHCO3 (доводили до рН 8,5 6Н розчином NaOH) до кінцевої концентрації 0,1 М. Додавали 50 мкл ДМСО до 370 мкг FITC і вносили в пробірки при молярному співвідношенні FITC:6uiok, що дорівнює 15, 20, ЗО і 40, з використанням наступної формули для визначення мкл FITC для додання: [мкл розчину FITC для внесення = 5 мг/мл білка х 0,2 мл х 389 х 100 х бажане молярне співвідношення/молекулярна маса TRU-016 (110000)]. Реакційні суміші ставили в темряву і безперервно перемішували протягом 75 хв. при кімнатній температурі. Реакційні суміші наносили на обертові колонки, приготовані, як описано в інструкції до набору, і центрифугували при 1100 g протягом 5 хв. із заміною буфера на PBS з азидом і видаленням некон'югованого FITC. Визначали оптичну густину при 280 нм і 494 нм при доданні 2 крапель Nanodrop; експериментально встановлювали для даного приладу коефіцієнт екстинкції для TRU-016 при вимірі показника для розведення вихідного некон'югованого SMIP, концентрація кожного з кон'югатів становила 4,25 мг/мл, і визначали значення при наступних співвідношеннях FITC:білок: 2,7 FITC:TRU-016 при співвідношенні 15; 3,7 FITC:TRU-016 при співвідношенні 20; 4,4 FITC:TRU-016 при співвідношенні 30 і 5,1 FITC:TRU-016 при співвідношенні 40. Додавали BSA до концентрації 3 мг/мл для стабілізації білка. Зв'язування кожної фракції оцінювали при розведенні від 100-24300х на клітинах Ramos і 3200-25600 на людських РВМС. Всі зв'язувалися, але співвідношення MR30 було вибране для подальшого використання, оскільки воно давало високе значення MFI, яке добре зберігалося у використовуваних межах титрування, вказуючи на те, що в даній реакції виявлявся мінімальний вплив на авідність зв'язування. 97469 54 У первинному дослідженні зв'язування кон'югати міченого FITC антитіла титрули в межах від 10 нг/мл до 10 мкг/мл з метою встановлення оптимальних кількостей для використання в дослідах з блокуванням. Вибрана концентрація була дещо нижча насичуючих кількостей, і її зберігали сталою в подальших дослідах, в той час як концентрації блокуючого антитіла збільшували в 10кратних межах. За даними будували графік залежності процента максимального зв'язування від концентрації блокуючого антитіла, при тому, що більш високі концентрації вказували на менш ефективне блокування, в той час як більш низькі концентрації вказували на більш високу активність блокування, що є. Всі тестовані антитіла виявили блокуючу активність при максимальному зв'язуванні, що спостерігається без не мічених реагентів (фігура 2). Потім клітини BJAB, В-лімфобластоїдна лінія В-клітин (люб'язно надана Ed. Clark, University of Washington), забарвлювали панеллю різних клонів MAb проти CD37, включаючи МВ371, BL14, NMN46, ІРО24, НН1, WR17 і TRU-016 SMIP. Для постановки дослідів по конкурентному 5 зв'язування 2,5x10 клітин BJAB інкубували в 96ямкових планшетах з U-подібним дном в середовищі для фарбування (PBS з 2% мишачої сироватки) з FITC-кон'югованими МАЬ проти CD37 в концентрації 1,25 мкг/мл в присутності некон'югованих МАb проти CD37 у вказаних концентраціях (2,5, 1,25, 0,6 або 0,3 мкг/мл) або в середовищі для фарбування протягом 45 хв. на льоду в темряві. Блокуючі антитіла і FITC-мічені кон'югати антитіл вносили в реакційні суміші перед доданням клітин. Потім клітини промивали 2,5 рази PBS і фіксували в 1% параформальдегіді (#19943, USB, Cleveland, Ohio). Клітини аналізували проточною цитометрією з використанням цитометра FACsCalibur і програмного забезпечення CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA). Для постановки дослідів по перехресному 5 блокуванню з FACs 2,5x10 клітин BJAB інкубували в 96-ямкових планшетах з U-подібним дном в середовищі для фарбування (PBS з 2% мишачої сироватки) в присутності некон'югованих МАb проти CD37 в концентрації 5 мкг/мл середовища для фарбування протягом 45 хв. при кімнатній температурі на льоду в темряві. Потім FITCкон'юговані МАb проти CD37 вносили в кінцевій концентрації 2 мкг/мл з розведенням не мічених реагентів до концентрації 3,3 мкг/мл. Потім реакційні суміші додатково інкубували протягом 45 хв. при кімнатній температурі в темряві. Реакційні суміші промивали 2,5 рази PBS і фіксували в 1% параформальдегіді (#19943, USB, Cleveland, Ohio). Клітини аналізували проточною цитометрією з використанням цитометра FACsCalibur і програмного забезпечення CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA). Для постановки клітинних тестів по зв'язування клітини суспендували в PBS (#14040-133, Gibco/Invitrogen, Grand Island, NY), що містить 2% FBS (#16140-071, Gibco/Invitrogen, Grand Island, NY) (Середовище для фарбування) з отриман6 ням титру приблизно 4x10 клітин/мл. Потім клі 55 тини висівали в планшети і потім вносили тестовані проби, розведені в середовищі для фарбування, в співвідношенні 1:1 до кінцевих вказаних концентрацій. Реакційні суміші інкубували протягом 45 хв. на льоду. Проби центрифугували і промивали 2 рази PBS. Додавали мічений FITC козячий антилюдський IgG (#H10501, CalTag, Burlingame CA) до кінцевого розведення 1:50 і інкубували протягом 45 хв. на льоду. Проби центрифугували, промивали PBS, потім фіксували в 1% параформальдегіді в PBS (#19943, USB, Cleveland, Ohio). Клітини аналізували проточною цитометрією з використанням цитометра FACsCalibur і програмного забезпечення CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA). Було показано, що кожне антитіло виявляло залежне від дози інгібування зв'язування, цей факт вказує на те, що всі тестовані молекули зв'язуються з одним і тим же або дуже близьким епітетом. Для кожного антитіла спостерігали різну активність в інгібуванні зв'язування. TRU-016 SMIP володіли найбільш високою блокуючою активністю з всіх тестованих молекул, в той час як НН1 виявляли проміжний рівень блокуючої активності, і WR17, ІРО24 блокували сильніше, ніж МВ371, але були менш ефективними в блокуванні, ніж дві інші не мічені молекули (фігура 2). У доповнення до аналізу блокуючої активності проводили аналогічну серію експериментів, в яких різні антитіла проти CD37 тестували на їх здатність конкурувати один з одним за зв'язування з рецептором CD37. Результати даних дослідів, як і результати, отримані в експериментах по блокуванню для всіх тестованих молекул, вказували, що різні антитіла проти CD37 і TRU-016 мають одні і ті ж або епітопи, що перекриваються. Приклад 3 TRU-016 мало активний в зв'язуванні Clq і активуванні класичного шляху активації комплементу Проводили експерименти для дослідження того, чому димер TRU-016 не здатний опосередковувати високу залежну від комплементу загибель В-клітин-мішеней. Однією можливістю є те, що димер TRU-016 виявляє низьке зв'язування з компонентами каскаду комплементу в порівнянні з нормальним людським IgGl-антитілом. Таким чином, проводили досліди з метою визначення того, чи активує TRU-016 класичний шлях активації комплементу при оцінці зв'язування TRU016 з Clq. Clq являє собою субодиницю ферментного комплексу СІ, який активує сироваткову комплементну систему і є компонентом розпізнавання класичного шляху активації комплементу. Досліди по зв'язуванню з Clq проводили, як описано раніше (Cragg et al., Blood 2004, 103: 2738-2743). Коротко, В-клітини Ramos в середовищі Iscove (#12440-053, Gibco/Invitrogen, Grand Island, NY) без сироватки висівали в 96-ямкові 5 планшети з U-подібним дном з титром 5x10 клітин/ямку в 100 мкл. Клітини інкубували з реагентами протягом 15 хв. при 37°С і потім вносили нормальну людську сироватку (NHS, #A113, Quidel Corp., San Diego, CA), розведену в середовищі Iscove, в об'ємі 50 мкл в кожну ямку до 97469 56 кінцевої концентрації 10, 5, 2,5 або 1,25% людської сироватки. 50 мкл середовища вносили в контрольну ямку. Для дослідів з чинником з отрути кобри CVF додавали до проб комплементу людської сироватки з розрахунку 20 Од. CVF/мл сироватки на 90 хв. при 37°С перед внесенням сироватки до проб комплементу і з урахуванням розведення сироватки CVF при приготуванні розведення проб. Клітини плюс джерело комплементу інкубували ще протягом 5 хв. при 37°С і промивали 2 рази холодним PBS (#14040-133, Gibco/Invitrogen, Grand Island, NY) при центрифугуванні, і ресуспендували в 100 мкл PBS. 50 мкл з кожної ямки переносили у другий планшет для проведення другої стадії контрольного фарбування. Обидва планшети забарвлювали протягом 15 хв. в темряві на льоду або міченому FITC анти-HU Clq (#C7850-06A, US Biological, Swampscott, Mass), або міченим FITC овечим IgG (#11904-56Р, US Biological, Swampscott, Mass). Проби промивали, ресуспендували в холодному PBS і відразу ж знімали показники на проточному цитометрі FACsCalibur, і їх обробляли з використанням програмного забезпечення CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA). FITC Clq не зв'язувався значною мірою ні з однією субфракцією очищеного SEC TRU-016, незважаючи на те, що фракція з більш високою молекулярною масою (HMW) або агрегати А2 зв'язувалися сильніше в порівнянні з іншими формами (фігура 3А). У протилежність ритуксан виявляв більш високий рівень зв'язування з Clq, зокрема, при більш низьких концентраціях NHS. Присутність CVF не могла повністю блокувати дане зв'язування, хоч, значення MFI достовірно меншали в порівнянні з одним середовищем. Потім ставили тести за оцінкою CDC для порівняння здатності різних субфракцій очищеного TRU-016 і ритуксану опосередковувати загибель клітин в присутності або за відсутності CVF і людського сироваткового комплементу (фігура ЗВ). Тести по CDC проводили з використанням фарбування пропідієм йодидом для диференціації рухомих і мертвих клітин після інкубації клітинмішеней з антитілом, рекомбінантними білками, асцитною рідиною, молекулами TRU-016 або середовищем і джерелом комплементу, таким як 5 людська сироватка. Коротко, 3 х 10 В-клітин Ramos попередньо інкубували з тестованими реагентами протягом 30-45 хв. при 37°С перед внесенням комплементу. Попередньо зв'язані проби центрифугували, промивали і ресуспендували в середовищі Iscove (#A113, Quidel, San Diego, CA) у вказаних концентраціях, потім інкубували протягом 90 хв. при 37°С. Проби промивали і додавали пропідій йодид (#Р-16063, Molecular Probes, Eugene, OR) до кінцевої концентрації 0,5 мкг/мл в PBS. Клітини інкубували з пропідієм йодидом протягом 15 хв. при кімнатній температурі в темряві і потім аналізували проточною цитометрією на цитометрі FACsCalibur з використанням програмного забезпечення CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA). 57 Загибель клітин, опосередкована фракцією А2 TRU-016 і ритуксаном, була достовірно нижча в присутності CVF, незважаючи на його нездатність повністю блокувати зв'язування Clq (фігура 3В). Потім проводили порівняння людського і кролячого комплементу по їх здатності до CDC в присутності TRU-016. Оцінювали активність до CDC молекул TRU-016, інкубованих з Вклітинами Ramos і людським або кролячим комплементом (фігура 3С). В-клітини Ramos вносили в ямку з безсироватковим середовищем. Ритуксан або димер, HMW A2 або рА фракції TRU-016 додавали до клітин з отриманням кінцевої концентрації 10 мкг/мл і інкубували протягом 15 хв. при 37°С перед промиванням 1,5x в безсироватковому середовищі і доданням нормальної людської сироватки (NHS) або кролячого комплементу (Pelfreez) при концентрації 10, 5 або 2,5%. Клітини плюс джерело комплементу інкубували протягом 90 хв. при 37°С. Клітини промивали один раз холодним PBS і вносили пропідій йодид (Molecular Probes, #P3566) до кінцевої концентрації 0,5 мкг/мл в холодному PBS. Клітини інкубували з РІ в темряві при кімнатній температурі протягом 15 хв. і потім аналізували проточною цитометрією. Походження фракції комплементу впливає на отримані результати по CDC (фігура 3С). Кролячий комплемент опосередковував більш високу CDC в порівнянні з людським комплементом в присутності молекул TRU-016. Цікаво зазначити, що димерна форма TRU-016 опосередковувала високу CDC з використанням кролячого комплементу, але дуже низьку активність CDC в присутності людського комплементу. Приклад 4 Активність і зв'язування мультимерів TRU016 Проводили експерименти з метою оцінки біологічної активності мультимерних форм TRU-016 (мультимери TRU-016) в розчині. Перше, для встановлення розміру рекомбінантного білка TRU-016 очищену на протеїні А речовину аналізували SEC при високому тиску (ВЕРХ) і встановили, що в розчині TRU-016 знаходиться у вигляді мультимерів. Хроматограми гель-фільтрації (SEC) при високому тиску (ВЕРХ) отримували очищенням GPC TRU-016, побудувавши графік залежності поглинання від часу втримання для різних зібраних фракцій (фігура 4). TRU-016 виділяли з клітинних культуральних супернатантів спочатку афінною хроматографією з використанням протеїн А/сефароза. Рекомбінантну молекулу елюювали з колонки 100 мМ гліцином, рН 3,5. Збирали фракції елюйованого продукту об'ємом 10 мл і потім рН елюйованого продукту доводили до 5,0 0,5М 2-(N-морфоліно)етансульфонової кислоти (MES), рН 6,0, в кількості 20% від елюйованого об'єму. Елюат отримували для очищення GPC концентруванням проби приблизно до концентрації 25 мг/мл TRU-016 і потім стерилізували фільтруванням при приготуванні для очищення GPC. Проводили гель-фільтрацію з використан 97469 58 ням повітряного зонда GE Healthcare АКТА Explorer 100 на колонці GE Healthcare XK і препаративної Superdex 200 (GE Healthcare). Фракції HMW або А2 показували час втримання, який дорівнює приблизно 6,23 хв., в той час як найбільш виражена форма мала час втримання, що становить 8,38 хв. Використовуваною в даному випадку як референс-стандарт була (рА стандарт або std) очищена на протеїні А речовина, що містить димери і мультимери HMW, як представлено на першій панелі на фігурі 4. Найбільш виражена форма, мігруюча з часом втримання 8,38 хв., найбільш ймовірно відповідала молекулі димера в невідновлюваних умовах SDSPAGE і декілька мінорних форм найбільш ймовірно відповідали мультимерам, які утворювалися за допомогою нековалентних взаємодій, оскільки їх не виявляли при SDS-PAGE в невідновлюваних умовах. Для розділення даних різних форм TRU-016 речовина, отримана афінною хроматографією культуральних супернатантів на протеїн А/сефароза, піддавали додатковому очищенню GPC і фракціонуванню ВЕРХ для відділення димера (позначеного як «димери» або «пік димерів») від мультимерів з більш високою молекулярною масою (позначених як фракція HMW або А2 agg). Потім кожну з даних трьох субфракцій аналізували окремо нафункціональну активність в умовах in vitro з використанням тестів оцінки зв'язування, ADCC і CDC. Для дослідження того, наскільки фракції, виділені SEC, виявляють різні зв'язувальні властивості, кожну фракцію TRU-016 SEC аналізували на здатність зв'язуватися з клітинами Ramos. Для оцінки зв'язувальних властивостей фракцій, отриманих з використанням SEC, клітини суспендували в середовищі для фарбування з титром 6 4x10 клітин/мл і потім висівали в планшети з 5 розрахунку 50 мкл/ямку (2x10 клітин/ямку) в середовищі для фарбування. Потім серійне розведення фракцій SEC вносило в послідовну ямку, інкубували протягом 45 хв., промивали і активність зв'язування визначали з використанням FITC козячого антилюдського IgG. Проби фіксували в 200 мкл 1% параформальдегіду в PBS. Клітини аналізували проточною цитометрією на цитометрі FACsCalibur з використанням програмного забезпечення CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA). Для оцінки активності фракцій, отриманих SEC, в тесті CDC клітини суспендували при титрі 5 5х10 клітин/ямку в 75 мкл IMDM. Фракції TRU016 SEC (75 мкл) додавали до клітин в подвійній вказаній концентрації. Давали можливість протікати реакціям зв'язування протягом 45 хв. перед центрифугуванням і промиванням в безсироватковому середовищі Iscove. Клітини ресуспендували в середовищі Iscove з людською сироваткою (#А113, Quidel, San Diego, CA) у вказаних концентраціях. Клітини інкубували протягом 60 хв. при 37°С, промивали і ресуспендували в середовищі для фарбування з 0,5 мкг/мл пропідію йодиду (РІ, #Р-16063, Molecular Probes, Eugene OR). Проби інкубували протягом 15 хв. при кімнатній температурі в темряві перед аналізом проточною ци 59 тометрією з використанням цитометра FACsCalibur і програмного забезпечення CellQuest (Becton Віскішопфігура 5В).) Для оцінки активності фракцій, отриманих SEC, в тесті ADCC лімфобластоїдні В-клітини BJAB, Ramos і Daudi (107) мітили 500 мккюрі/мл 51 Сr-хромату натрію протягом 2 год. при 37°С в середовищі IMDM/10% FBS. Виділяли РВМС з гепанізованої людської крові фракціонуванням в градієнті середовища для розділення лімфоцитів (LSM, ICN Biomedical). Проби реагентів додавали до середовища RPMI з 10% FBS і готували п'ять серійного розведення для кожного реагенту. Для отримання комбінацій реагенти попередньо змішували і розводили перед внесенням в ямку. 51 4 Мічені Cr BJAB вносили з титром 2х10 клі5 тин/ямку. Потім додавали РВМС (5x10 клітин/ямку) з кінцевим співвідношенням ефекторні клітини (РВМС):клітини мішеней (BJAB), що дорівнює 25:1. Реакційні суміші вносили в чотири паралельні ямки 96-ямкового планшета. Фракції TRU-016 SEC вносили в ямку з кінцевою концентрацією в межах від 10 нг/мл до 20 мкг/мл, як указано на графіках. Кожний ряд даних представляє графік для різної фракції, отриманої SEC, при описаних межах титрування. Реакціям давали протікати протягом 6 год. при 37°С в атмосфері 5% СО2 перед збором і підрахунком. Визначали вивільнену кількість імп/хв на лічильнику Packard TopCountNXT з 50 мкл висушеного культурального супернатанту. Процент специфічної загибелі клітин розраховували відніманням (імп/хв [середнє значення чотирьох паралельних проб] проб імп/хв спонтанне вивільнення)/(імп/хв максимальне вивільнення -імп/хв спонтанне вивільнення)x 100 (фігура 5С). На фігурі 5А представлені криві титрування зв'язування різних фракцій SEC з клітинами Ramos. Всі фракціоновані молекули зв'язувалися з CD37 при наявності аналогічних кривих зв'язування, за винятком варіанту тестування при найвищій концентрації, коли в цьому випадку речовина HMW показувала краще зв'язування (більш висока інтенсивність флуоресценції) в порівнянні з рА стандартом і піком димерних форм. Також проводили експерименти з метою визначення того, чи виявляють фракції TRU-016 SEC різну функціональну активність, таку як опосередкована CDC і ADCC направлена загибель клітин. На графіку, представленому на фігурі 5В, показано, що тільки очищена фракція мультимерів HMW опосередковувала високу CDC активність відносно В-клітин Ramos при використанні людського комплементу. Стандарт рА виявляв деяку CDC активність в більш високих концентраціях, в той час як пік димера показував дуже низьку активність або відсутність CDC активності при всіх тестованих концентраціях. Проводили тести за оцінкою ADCC з серійним розведенням фракцій TRU-016 різної маси з використанням мічених В-клітин BJAB як мішень і людських РВМС як ефекторних клітини. Фракції TRU-016 SEC знаходилися в ямку в кінцевій концентрації в межах від 10 нг/мл до 20 мкг/мл, як указано на графіку на фігурі 5С. Кожний ряд да 97469 60 них представляє графік для різних фракцій, отриманих SEC, при описаних межах титрування. Будували графік у вигляді функції % специфічної загибелі від концентрації білка.Все субфракції SEC, включаючи рА стандарт, фракцію HMW або А2 і пік димера, опосередковували високу, залежну від дози ADCC відносно клітин-мішеней BJAB. Також аналогічні результати отримували з використанням клітин Ramos як мічені мішені (дані не представлені). Приклад 5 Отримання СВ20-специфічної зв'язувальної молекули СD20-специфічні SMIP описані в спільних патентних публікаціях США № 2003/133939, 2003/0118592 і 2005/0136049. Отримання зразкового CD20-специфічного SMIP, TRU-015, описане нижче. TRU-015 представляє рекомбінантний (мишачий/людський) одноланцюжковий білок, який зв'язується з антигеном CD20. Зв'язувальний домен оснований на відомій послідовності людського антитіла проти CD20. Зв'язувальний домен пов'язаний з ефекторним доменом, СН2 і СН3 областями людського IgGl за допомогою модифікованої шарнірної області CSS. TRU-015 в розчині знаходиться у вигляді димера, і димер має теоретичну молекулярну масу, яка дорівнює приблизно 106000 дальтон. Нуклеотидна послідовність, що кодує TRU-016, і амінокислотна послідовність TRU-015 відповідно представляють SEQ ID NO:3 і 4. Відносно амінокислотної послідовності, представленої в SEQ ID NO:4, TRU-015 містить лідерний пептид 2е12, клоновану послідовність з амінокислот 1-23; варіабельну область легкого ланцюга мишачого антитіла 2Н7 проти людського CD20 із заміною лізину на серин (VHL11S) в залишку 11 у варіабельній області, який вказаний в положенні 34; лінкер asp-gly3-ser-(gly4ser)2, що починається в залишку 129, при тому, що лінкер має додатковий серин в кінці з включенням сайта рестрикції Sacl для касетної перестановки; варіабельну область важкого ланцюга мишачого антитіла 2Н7 проти людського CD20, в якій відсутній залишок серину в кінці області важкого ланцюга, тобто зміненої з VTVSS на VTVS; Fc-область людського IgGl, що включає модифіковану шарнірну область, що містить послідовність (CSS), і області СН2 і СН3 диких типи. Клітини СНО, які продукують TRU-015, культивували в біореакторі з використанням відповідного середовища. TRU-015 очищали з використанням ряду стадій хроматографії і фільтрування, включаючи фільтрування для елімінації вірусів. Потім речовину концентрували і готували розчин 20 мМ фосфату натрію і 240 мМ сахарози з отриманням рН, що дорівнює 6,0. Композицію фільтрували перед перенесенням в скляні флакони з концентрацією 10 мг/мл. Кожний скляний флакон містив 5 мл TRU-015 (50 мг/флакон). Приклад 6 Комбінації TRU-016 з TRU-015 або ритуксаном синергічно посилюють апоптоз В-клітин