Гуманізована анти-cd20 антигензв’язуюча молекула іі типу, яка специфічно зв’язується з cd20 людини

1. Гуманізована анти-CD20 антигензв'язуюча молекула II типу, яка специфічно зв'язується з CD20 людини, що включає: i) варіабельну область важкого ланцюга, яка включає 3 області, що визначають комплементарнiсть (CDR), і 4 каркасні області (FR), при цьому щонайменш одна зі згаданих CDR вибрана з групи CDR важкого ланцюга антитiла мишi B-Ly1, яка складається з: CDR1 важкого ланцюга SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 або SEQ ID NO: 17; CDR2 важкого ланцюга SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 або SEQ ID NO: 27; і CDR3 важкого ланцюга SEQ ID NO: 28; і ii) варіабельну область легкого ланцюга, яка включає 3 CDR і 4 FR, при цьому щонайменш одна зі згаданих CDR вибрана з групи CDR легкого ланцюга антитiла мишi B-Ly1, яка складається з: CDR1 легкого ланцюга SEQ ID NO: 18; CDR2 легкого ланцюга SEQ ID NO: 19; і CDR3 легкого ланцюга SEQ ID NO: 20; і де згадана антигензв'язуюча молекула iндукує апоптоз цільових клітин після згаданої гуманізації. 2. Антигензв'язуюча молекула за п. 1, при цьому згадана антигензв'язуюча молекула включає Fcобласть, яка була глiкоконструйована для індукування пiдвищеної ADCC в результаті згаданого глiкоконструювання без суттєвої втрати здатностi iндукувати апоптоз цiльових клiтин. 3. Антигензв'язуюча молекула за п. 2, при цьому згадана антигензв'язуюча молекула індукує вищi рiвнi апоптозу при iнкубуваннi з CD20-позитивними людськими клiтинами порiвняно з контрольним дослiдом в iдентичних умовах з використанням химерного IgG1 антитiла C2B8 з послiдовнiстю, iдентичною ритуксимабу. 4. Антигензв'язуюча молекула за будь-яким з пп. 13, при цьому згадана варіабельна область важкого ланцюга включає CDR1 важкого ланцюга B-Ly1 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 або SEQ ID NO: 17; CDR2 важкого ланцюга SEQ ID NO: 25, SEQ ID UA (21) a200606108 (22) 05.11.2004 (24) 10.09.2010 (86) PCT/IB2004/003896, 05.11.2004 (31) 60/517,096 (32) 05.11.2003 (33) US (46) 10.09.2010, Бюл.№ 17, 2010 р. (72) УМАНА ПАБЛО, CH, БРЮНКЕР ПЕТЕР, CH, ФЕРРАРА КЛАУДІА, CH, СУТЕР ТОБІАС, CH, ПЮНТЕНЕР УРСУЛА, CH, МЬОССНЕР ЕККЕХАРД, CH (73) ГЛІКАРТ БІОТЕХНОЛОДЖІ АГ, CH (56) WO A 03011878, 13.02.2003. US A1 2003003097, 02.01.2003. WO A 0067796, 16.11.2000. POLYAK MARIA J ET AL: "Alanine-170 and proline172 are critical determinants for extracellular CD20 epitopes; heterogeneity in the fine specificity of CD20 monoclonal antibodies is defined by additional requirements imposed by both amino acid sequence and quaternary structure" BLOOD, W.B.SAUNDERS COMPANY, ORLANDO, FL, US, vol. 99, no. 9, 1 May 2002 (2002-05-01), pages 3256-3262, XP002308044 ISSN: 0006-4971. CRAGG MARK S ET AL: "Complement-mediated lysis by anti-CD20 mAb correlates with segregation into lipid rafts." BLOOD. 1 FEB 2003, vol. 101, no. 3, 1 February 2003 (2003-02-01), pages 1045-1052, XP002329935 ISSN: 0006-4971. DAVIES J ET AL: "Expression of GnTIII in a recombinant anti-CD20 CHO production cell line: Expression of antibodies with altered glycoforms leads to an increase in ADCC through higher affinity for FC gamma RIII" BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING COMBINATORIAL CHEMISTRY, WILEY, NEW YORK, NY, US, vol. 74, no. 4, 20 August 2001 (2001-08-20), pages 288-294, XP002285964 ISSN: 0006-3592. UA A 200504550, 15.08.2005. UA A 200507058, 17.10.2005. UA A 200510467, 15.02.2006. 2 (19) 1 3 91823 4 NO: 26 або SEQ ID NO: 27; і CDR3 важкого ланцюглiкоконструйована для того, щоб мати пiдвищену га SEQ ID NO: 28. кiлькість симетрично розрiзаних комплексних 5. Антигензв'язуюча молекула за будь-яким з пп. 1олiгосахаридiв в Fc-області. 4, при цьому згадана варіабельна область важкого 17. Антигензв'язуюча молекула за п. 15, при цьому ланцюга включає CDR1, CDR2 і CDR3 важкого згадана антигензв'язуюча молекула була ланцюга B-Ly1, представлені SEQ ID NO:16, SEQ глiкоконструйована для того, щоб мати знижену ID NO:26 і SEQ ID NO:28, відповідно. кiлькість фукозних залишкiв в Fc-області. 6. Антигензв'язуюча молекула за будь-яким з пп. 118. Антигензв'язуюча молекула за будь-яким з пп. 5, при цьому згадана варіабельна область легкого 15-17, при цьому щонайменш 20 % олiгосахаридiв ланцюга включає CDR1, CDR2 і CDR3 легкого лав Fc-області згаданої антигензв'язуючої молекули нцюга B-Ly1, представлені SEQ ID NO:18, SEQ ID є симетрично розрiзаними, нефукозильованими. NO:19 і SEQ ID NO:20, відповідно. 19. Антигензв'язуюча молекула за будь-яким з пп. 7. Антигензв'язуюча молекула за будь-яким з пп. 115-17, при цьому щонайменш 50 % олiгосахаридiв 6, при цьому FR1, FR2 і FR3 згаданої варіабельної в Fc-області згаданої антигензв'язуючої молекули області важкого ланцюга кодуються послідовністю є нефукозильованими. VH1_10 зародкової лiнiї людини, і FR4 згаданої 20. Антигензв'язуюча молекула за будь-яким з пп. варіабельної області важкого ланцюга кодується 2-19, при цьому згадана антигензв'язуюча молекупослідовністю JH4 зародкової лiнiї людини. ла в результатi згаданого глiкоконструювання ви8. Антигензв'язуюча молекула за будь-яким з пп. 1являє пiдвищену афiннiсть зв'язування з Fc7, при цьому FR1, FR2 і FR3 згаданої варіабельної рецептором. області легкого ланцюга кодуються послідовністю 21. Антигензв'язуюча молекула за п. 20, при цьому VK_2_40 зародкової лiнiї людини, і FR4 згаданої згаданий Fc-рецептор являє собою рецептор варіабельної області легкого ланцюга кодується FcγRIIIA. послідовністю JK4 зародкової лiнiї людини. 22. Антигензв'язуюча молекула за будь-яким з пп. 9. Антигензв'язуюча молекула за будь-яким з пп. 12-21, при цьому згадана антигензв'язуюча молеку4, при цьому згадана варіабельна область важкого ла в результатi згаданого глiкоконструювання виланцюга включає амінокислотну послідовність, являє пiдвищену ефекторну функцiю. вибрану з групи, яка складається з: SEQ ID NO: 30; 23. Антигензв'язуюча молекула за п. 22, при цьому SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; згадана пiдвищена ефекторна функцiя являє соSEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; бою пiдвищене пряме сигналiзування, що iндукує SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; апоптоз. SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54; 24. Антигензв'язуюча молекула за будь-яким з пп. SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 60; 1-23, при цьому згадана антигензв'язуюча молекуSEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 66; ла являє собою повне антитіло. SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 70; та SEQ ID NO: 72. 25. Видiлений полiнуклеотид, що включає 10. Антигензв'язуюча молекула за п. 9, при цьому послiдовнiсть, яка кодує варіабельну область важзгадана варіабельна область важкого ланцюга кого ланцюга антигензв'язуючої молекули за будьвключає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: яким з пп. 1-4, при цьому згаданий полiнуклеотид 32 або SEQ ID NO: 40. включає послідовність, вибрану з групи, яка скла11. Антигензв'язуюча молекула за п. 10, при цьому дається з: SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID згадана варіабельна область важкого ланцюга NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:40. NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID 12. Антигензв'язуюча молекула за будь-яким з пп. NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID 1-11, при цьому згадана антигензв’язуюча молекуNO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID ла включає виділений поліпептид, який містить NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID послідовність SEQ ID NO: 76 варіабельної області NO: 69, SEQ ID NO: 71. легкого ланцюга. 26. Видiлений полiнуклеотид за п. 25, при цьому 13. Антигензв'язуюча молекула за будь-яким з пп. згаданий видiлений полiнуклеотид включає послі1-12, при цьому згадана антигензв'язуюча молекудовність SEQ ID NO: 39. ла включає перший виділений поліпептид, який 27. Видiлений полiнуклеотид, що включає послідомістить послідовність SEQ ID NO: 32 або SEQ ID вність, яка кодує варіабельну область легкого лаNO: 40 варіабельної області важкого ланцюга, і нцюга гуманізованої анти-CD20 антигензв'язуючої другий виділений поліпептид, який містить послімолекули II типу за п. 6, причому згадана антигендовність SEQ ID NO: 76 варіабельної області легзв'язуюча молекула специфічно зв'язується з кого ланцюга. CD20, і при цьому вказаний полiнуклеотид вклю14. Антигензв'язуюча молекула за п. 13, при цьому чає SEQ ID NO: 75. згадана антигензв'язуюча молекула включає пос28. Клiтина-хазяїн, яка включає видiлений лідовність SEQ ID NO: 40 варіабельної області полiнуклеотид за будь-яким з пп. 25-27. важкого ланцюга. 29. Клiтина-хазяїн, яка експресує: 15. Антигензв'язуюча молекула за будь-яким з пп. i) щонайменш одну нуклеїнову кислоту, що кодує 1-14, при цьому згадана антигензв'язуюча молекуполiпептид, який має активнiсть β(1,4)-Nла включає Fc-область з модифiкованими ацетилглюкозамiнiлтрансферази III, у кiлькостi, олiгосахаридами. достатнiй для глiкоконструювання Fc-областi анти16. Антигензв'язуюча молекула за п. 15, при цьому гензв'язуючої молекули, продукованої згаданою згадана антигензв'язуюча молекула була клiтиною-хазяїном; і 5 91823 6 ii) щонайменш один трансфектований 34. Спосiб продукування гуманізованої анти-CD20 полiнуклеотид, що кодує антигензв'язуючу молеантигензв'язуючої молекули II типу, яка специфічкулу за будь-яким з пп. 1-24, при цьому згаданий но зв'язується з CD20 людини, при якому: полiнуклеотид мiстить послiдовнiсть, що кодує i) культивують клiтину-хазяїна за будь-яким з пп. область, еквiвалентну Fc-областi людського 28-33 у середовищi в умовах, що забезпечують iмуноглобулiну. експресiю полінуклеотиду, який кодує згадану ан30. Клiтина-хазяїн за п. 29, при цьому згадана антигензв'язуючу молекулу; та тигензв'язуюча молекула, продукована згаданою ii) видiляють згадану антигензв'язуючу молекулу з клiтиною-хазяїном, в результатi згаданого кiнцевої культури. глiкоконструювання виявляє пiдвищену афiннiсть 35. Фармацевтична композицiя, що включає антизв'язування з Fc. гензв'язуючу молекулу за будь-яким з пп. 1-24 та 31. Клiтина-хазяїн за п. 30, при цьому згаданий Fcфармацевтично прийнятний носiй. рецептор являє собою рецептор FcγRIIIA. 36. Антигензв'язуюча молекула за будь-яким з пп. 32. Клiтина-хазяїн за п. 29, при цьому згадана ан1-24 для застосування як лікарський засіб для тигензв'язуюча молекула, продукована згаданою лiкування B-клiтинного розладу. клiтиною-хазяїном, в результатi згаданого 37. Антигензв'язуюча молекула за п. 36, при цьому глiкоконструювання виявляє пiдвищену ефекторну згаданий розлад являє собою B-клiтинну лiмфому. функцiю. 38. Заcтосування антигензв'язуючої молекули за 33. Клiтина-хазяїн за п. 32, при цьому згадана будь-яким з пп. 1-24 для виробництва лікарського пiдвищена ефекторна функцiя являє собою засобу для лiкування розладу, що пiддається пiдвищене пряме сигналiзування, що iндукує апоплiкуванню шляхом вичерпання B-клiтин. тоз. 39. Заcтосування за п. 38, при цьому згаданий розлад являє собою B-клiтинну лiмфому. Передумови винаходу Область винаходу Даний винахід стосується антиген-зв'язуючих молекул (АВМ). В окремих варіантах здійснення винахід стосується рекомбінантних моноклональних антитіл, включаючи химерні, приматизовані або гуманізовані антитіла, специфічні до людського CD20. Крім того, даний винахід стосується молекул нуклеїнової кислоти, що кодують такі АВМ, а також векторів та клітин-хазяїв, які містять такі молекули нуклеїнової кислоти. Даний винахід також стосується способів продукування АВМ за даним винаходом та способів застосування цих АВМ у лікуванні хвороб. Крім того, даний винахід стосується АВМ з модифікованим глікозилюванням, що мають покращені терапевтичні властивості, включаючи антитіла з підвищеним зв'язуванням з Fc-рецепторами та підвищеною ефекторною функцією. Попередній рівень техніки Імунна система та анти-CD20 антитіла Імунна система хребетних, включаючи людину, складається з ряду органів та клітинних типів, що розвили функцію точного та специфічного впізнавання, зв'язування та руйнування чужорідних мікроорганізмів ("антигенів"), що вторгаються ззовні. Лімфоцити є особливо важливими для належного функціонування імунної системи. Ці клітини виробляються у тимусі, селезінці та кістковому мозку (дорослому) та складають близько 30% загальної кількості білих кров'яних тілець, присутніх у системі кровообігу дорослої людини. Існує дві основні субпопуляції лімфоцитів: Т-клітини та Вклітини. Т-клітини відповідають за клітинноопосереднений імунітет, а В-клітини відповідають за продукування антитіл (гуморальний імунітет). Проте у типовій імунній реакції Т-клітини та Вклітини функціонують взаємопов'язано: Т-клітини активуються, коли Т-клітинний рецептор зв'язуєть ся з фрагментами антигену, які зв'язуються з глікопротеїнами головного комплексу гістосумісності ("МНС") на поверхні антиген-презентуючої клітини; така активація спричиняє вивільнення біологічних медіаторів ("інтерлейкінів"), які стимулюють диференціацію В-клітин з продукуванням антитіл ("імуноглобулінів") проти цього антигену. Кожна В-клітина в організмі хазяїна експресує антитіло одного конкретного типу та специфічності, а інші В-клітини експресують антитіла, специфічні до інших антигенів. Реакцією на чужорідний антиген є проліферація В-клітин та пік продукування антитіл, та обидва процеси припиняються (або суттєво вповільнюються), коли чужорідний антиген вже нейтралізовано. Проте іноді проліферація окремої В-клітини може продовжуватися на тому ж рівні; така проліферація може привести до раку, званого "В-клітинною лімфомою". Як Т-клітини, так і В-клітини містять білки клітинної поверхні, що можуть використовуватися як "маркери" для диференціації та ідентифікації. Одним з таких маркерів людської В-клітини є антиген обмеженої диференціації В-лімфоцитів людини Вр35, що позначається "CD20". CD20 експресується під час початкового розвитку попередників Вклітин та залишається до диференціації плазматичних клітин. Зокрема, молекула CD20 може регулювати деякий етап процесу активації, необхідний для ініціювання та диференціації клітинного циклу та звичайно експресується у дуже великих кількостях на неопластичних ("пухлинних") В-клітинах. Оскільки CD20 присутній у великих кількостях на "злоякісних" В-клітинах, тобто, тих В-клітинах, необмежена проліферація яких може привести до Вклітинної лімфоми, поверхневий антиген CD20 може виступати потенціальною мішенню для "цілеспрямування" на В-клітинні лімфоми. По суті, це цілеспрямування може бути узагальнене таким чином: антитіла, специфічні до 7 91823 8 поверхневого антигену CD20 В-клітини, вводять реакція була зумовлена кращим in vivo зв'язуванпацієнту, наприклад, шляхом ін'єкції. Ці анти-CD20 ням антитіла з Fc RIIIa, що привело до підвищення антитіла специфічно зв'язуються з антигеном активності ADCC проти клітин лімфоми (Cartron, CD20 клітинної поверхні (здогадно) як нормальних, G., et al. Blood 99(3):754-757 (February 2002)). так і злоякісних В-клітин; анти-CD20 антитіло, зв'яОписані різноманітні спроби цілеспрямування зане з поверхневим антигеном CD20, може привена поверхневий антиген CD20. В одному з дослісти до руйнування та вичерпання неопластичних джень, моноклональне антитіло миші 1F5 (антиВ-клітин. Крім того, з анти-CD20 антитілом можуть CD20 антитіло) вводили шляхом безперервного бути кон'юговані хімічні засоби або радіоактивні внутрішньовенного вливання пацієнтам з Вмітки, що мають потенціал руйнування пухлин, з клітинною лімфомою. Повідомляється, що знадометою специфічної "доставки" цього засобу, набилися надзвичайно високі рівні (>2 г) 1F5 для приклад, до неопластичних В-клітин. Незалежно вичерпання циркулюючих пухлинних клітин, і ревід підходу, головною метою є руйнування пухлизультати були описані як "нестійкі" (Press et al., ни: конкретний підхід може бути визначений у за"Monoclonal Antibody 1F5 (Anti-CD20) Serotherapy лежності від конкретного анти-CD20 антитіла, що of Human B-Cell Lymphomas". Blood 69/2:584-591 використовується, і, таким чином, придатні підходи (1987). Проблема такого підходу може складатися до цілеспрямування антигену CD20 можуть суттєв тому, що нелюдським моноклональним антитіво відрізнятися. лам (наприклад, моноклональним антитілам миші) Некон'юговані моноклональні антитіла (mAbs) звичайно бракує людської ефекторної функції, можуть бути корисними лікарськими засобами для тобто, вони нездатні, між іншим, опосереднювати лікування раку, що показало ухвалення Управлінкомплемент-залежний лізис або лізувати людські ням США з контролю за харчовими продуктами та цільові клітини за допомогою антитіло-залежної ліками Ритуксимабу (Rituxan ; IDEC клітинної токсичності або Fс-рецепторPharmaceuticals, Сан-Дієго, Каліфорнія, та опосоредненого фагоцитозу. Крім того, нелюдські Genentech Inc., Сан-Франціско, Каліфорнія) для моноклональні антитіла можуть впізнаватися людлікування CD20-позитивних В-клітин, в'ялопротіським хазяїном як чужорідний білок; тому повторні каючої або фолікулярної неходжкінської лімфоми, ін'єкції таких чужорідних антитіл можуть привести до індукування імунних реакцій і, в результаті, до Трастузумабу (Herceptin ; Genentech Inc.) для шкідливих алергічних реакцій. У випадку моноклолікування прогресуючого раку молочної залози нальних антитіл миші це часто називають реакці(Grillo-Lopez, A.-J., et al., Semin. Oncol. 26:66-73 єю людських анти-мишачих антитіл, або реакцією (1999); Goldenberg, Μ.Μ., Clin. Ther. 21:309-18 "НАМА". Крім того, ці "чужорідні" антитіла можуть (1999)), Гемтузумабу (Mylotarg , Celltech/Wyethбути атаковані імунною системою хазяїна, так що Ayerst) для лікування рецидивного гострого мієловони будуть практично нейтралізовані ще до того, їдного лейкозу, та Алемтузумабу (CAMPATH , як досягнуть цільової ділянки. Millenium Pharmaceuticals/Schering AG) для лікуІнший описаний підхід до покращення здатновання В-клітинного хронічного лімфоцитарного сті моноклональних антитіл миші забезпечувати лейкозу. Успіх цих засобів укладається не тільки в ефективне лікування В-клітинних розладів складаїх ефективності, але також у їх високих показниках вся у кон'югації радіоактивної мітки або токсину з безпечності (Grillo-Lopez, A.J., et al., Semin. Oncol. антитілом, так що мітка або токсин локалізувалися 26:66-73 (1999); Goldenberg, M.M., Clin. Ther. на ділянці пухлини. Наприклад, вищезгадане анти2/:309-18 (1999)). Незважаючи на досягнення при тіло 1F5 було "помічене" йодом-131 ("131І"), після застосуванні цих засобів, останнім часом виник чого було оцінене його розподілення в організмах великий інтерес до отримання ще вищої активносдвох пацієнтів. Див. Еагу, J.F. et al., "Imaging and ті специфічних антитіл, ніж та, що звичайно досяTreatment of B-Cell Lymphoma" J. Nuc. Med. гається за допомогою терапії некон'югованими 31/8:1257-1268 (1990); див. також Press, O.W. et mAb. Іншим антитілом, відомим своєю специфічніal., "Treatment of Refractory Non-Hodgkin's стю до CD20 людини, є моноклональне антитіло Lymphoma with Radiolabeled MB-1 (Anti-CD37) миші, B-Ly1. (Poppema, S. and Visser, L., Biotest Antibody" J. Clin. Onc. 7/8:1027-1038 (1989) (вказаBulletin 3: 131-139 (1987)). но, що в одного пацієнта, якого лікували 131ІРезультати низки досліджень дозволяють міченим 1F-5, була досягнута "часткова реакція"); припустити, що Fc-рецептор-залежні механізми Goldenberg, D.Μ. et al., "Targeting, Dosimetry and суттєво сприяють дії цитотоксичних антитіл проти Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with пухлин та показують, що оптимальне антитіло Iodine-131-Labeled LL2 Monoclonal Antibody" J. Clin. проти пухлин буде зв'язуватися переважно з актиOnc. 9/4:548-564 (1991) (вказано, що в трьох з воваційними Fc-рецепторами та, у мінімальній мірі, з сьми пацієнтів, які отримували багатократні ін'єкінгібіторним партнером Fc RIIB (Clynes, R.A., et al., ції, розвилася НАМА-реакція); Appelbaum, F. R. Nature Medicine 6(4):443-446 (2000); Kalergis, A.M., "Radiolabeled Monoclonal Antibodies in the and Ravetch, J.V., J. Exp. Med. 195(12):1653-1659 Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma" Hem/Onc. (June 2002). Наприклад, результати, щонайменше, Clinics of N.A. 5/5:1013-1025 (1991) (оглядова статодного дослідження показують, що, зокрема, ретя); Press, O.W. et al. "Radiolabeled-Antibody цептор Fc RIIIa тісно пов'язаний з ефективністю Therapy of B-Cell Lymphoma with Autologous Bone терапії антитілами (Cartron, G., et al.,Blood Marrow Support". New England J. Med. 329/17:121999(3):754-757 (Лютий, 2002)). Це дослідження по12223 (1993) (мічене йодом-131 aErra-CD20 антиказує, що пацієнти, гомозиготні на Fc RIIIa, мають тіло IF5 та Bl); та Kaminski, Μ. G. et al. кращу реакцію на Ритуксимаб, ніж гетерозиготні "Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphoma with 131I пацієнти. Автори дійшли висновку, що найкраща 9 91823 10 Anti-Bl (Anti-CD20) Antibody". New England! Med. Олігосахаридний компонент може суттєво по329/7(1993) (мічене йодом-131 анти-CD20 антитіло гіршувати властивості, що зумовлюють ефективB1; тут далі - "Kaminski"). Токсини (тобто, хіміотеність терапевтичного глікопротеїну, включаючи рапевтичні засоби, такі як доксорубіцин або мітофізичну стабільність, стійкість до дії протеаз, взаміцин С) також кон'югували з антитілами. Див., ємодію з імунною системою, фармакокінетику та наприклад, опубліковану заявку РСТ WO 92/07466 специфічну біологічну активність. Такі властивості (опублікована 14.05.92). можуть залежати не тільки від присутності або Химерні антитіла, що містять частини антитіл вісутності, але також від конкретної структури олідвох або більше різних видів (наприклад, миші та госахаридів. Можуть бути узагальнені деякі залежлюдини) були розроблені у якості альтернативи до ності між структурою олігосахариду та глікопротеї"кон'югованих" антитіл. Наприклад, у Liu, A.Y. et новою функцією. Наприклад, певні олігосахаридні al., "Production of a Mouse-Human Chimeric структури опосереднюють швидке виведення гліMonoclonal Antibody to CD20 with Potent Fcкопротеїну з кров'яного току шляхом взаємодій зі Dependent Biologic Activity" J. Immun. 139/10:3521специфічними вуглевод-зв'язуючими білками, у 3526 (1987), описане химерне антитіло митой час як інші можуть зв'язуватися антитілами та ші/людини, спрямоване проти антигену CD20. Див. ініціювати небажані імунні реакції (Jenkins et al., також РСТ публікацію WO 88/04936. Наприклад, Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)). Клітини ссавців є переважними хазяями для ритуксимаб (RITUXAN ), химерне анти-CD20 анпродукування терапевтичних глікопротеїнів, затитіло, було ухвалене для лікування неходжкінсьвдяки їх здатності глікозилювати білки у найбільш кої лімфоми. сумісній формі, придатній для застосування у люЗ урахуванням експресії CD20 В-клітинними дини (Cumming et al., Glycobiology 7:115-30 (1991); лімфомами, цей антиген може виступати у якості Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)). мішені для "цілеспрямування" на такі лімфоми. По Бактерії дуже рідко глікозилюють білки, і, подібно суті, це цілеспрямування може бути узагальнене до інших типів загальноприйнятних хазяїв, таких як таким чином: антитіла, специфічні до антигена клітини дріжджів, ниткоподібних грибів, комах та CD20 на поверхні В-клітин, вводять пацієнтові. Ці рослин, створюють моделі глікозилювання, пов'яанти-CD20 антитіла специфічно зв'язуються з анзані з швидким виведенням з кровообігу, небажатигеном CD20 (здогадно) як нормальних, так і злоними імунними взаємодіями, а у деяких специфічякісних В-клітин, і антитіло, зв'язане з CD20 на них випадках - зниженою біологічною активністю. поверхні клітин, приводить до руйнування та вичеСеред клітин ссавців, за останні два десятиріччя рпання онкогенних В-клітин. Крім того, хімічні занайчастіше використовуються клітини яєчника соби, цитотоксини або радіоактивні засоби можуть китайського хом'яка (СНО). На додаток до утвобути безпосередньо або опосереднено прикріплені рення придатних моделей глікозилювання, ці клідо анти-CD20 антитіла таким чином, щоб засіб тини дають можливість стійкого вироблення генеселективно "доставлявся" до CD20-антигентично стабільних, високопродуктивних клональних експресуючих В-клітин. Для обох цих підходів гоклітинних ліній. Їх можна культивувати до високих ловною метою є руйнування пухлини. Конкретний щільностей у простих біореакторах із використанпідхід буде залежати від конкретного анти-CD20 ням безсироваткового середовища, і вони забезантитіла, що застосовується. Таким чином, очевипечують можливість розвитку безпечних та відтводно, що різні підходи до цілеспрямування антигена рюваних біопроцесів. Інші найчастіше CD20 можуть суттєво відрізнятися. використовувані тваринні клітини включають кліАнтитіло ритуксимаб (RITUXAN ) є генетично тини нирки золотистого хом'ячка (ВНK), клітини сконструйованим химерним людським моноклонамієломи миші NS0 та SP2/0. Нещодавно також льним антитілом, яке містить постійний домен мибуло досліджене продукування з трансгенних тваші 1, що спрямоване проти антигену CD20 людирин (Jenkins et al., Nature Biotechnol 14:975-81 ни. Це химерне антитіло містить постійні домени (1996)). людини 1 та має назву "С2В8" у патенті США № Усі антитіла містять вуглеводні структури у 5736137 (Andersen et al.), опублікованому консервативних положеннях константних областей 17.04.1998, що належить IDEC Pharmaceuticals важких ланцюгів, причому кожний ізотип має відCorporation. RITUXAN ухвалено для лікування мінний масив N-зчеплених вуглеводних структур, пацієнтів з рецидивуючою або ретрагуючою в'ялоякі змінним чином впливають на збирання, секрепротікаючою або фолікулярною, CD20цію або функціональну активність білків (Wright, A., позитивною, В-клітинною неходжкінською лімфоand Morrison, S.L., Trends Biotech. 15:26-32 (1997)). мою. In vitro дослідження механізму дії показали, Структура прикріпленого N-зчепленого вуглеводу що RITUXAN виявляє цитотоксичність, залежну суттєво змінюється в залежності від міри обробки і від людського комплементу (CDC) (Reff et al., може включати високоманозні, багатократно розBlood 83(2): 435-445 (1994)). Крім того, він виявляє галужені, а також двоантенарні складні олігосахазначну активність у дослідах з визначення антитіриди (Wright, Α., and Morrison, S.L., Trends Biotech. ло-залежної клітинної цитотоксичності (ADCC). 15:26-32 (1997)). Звичайно відбувається гетероВиявилося, що RITUXAN має антипроліферативгенна обробка стержневих олігосахаридних струкну активність у дослідах на приєднання тимідину тур, прикріплених на специфічному сайті глікозита обмежену здатність безпосередньо індукувати лювання, так що навіть моноклональні антитіла апоптоз, у той час як CD20-антитіла не мають таіснують у вигляді різноманітних глікоформ. Подібких властивостей (Maloney et al., Blood 88 (10): ним чином, було показано, що між клітинними ліні637а (1996)). ями спостерігаються значні відмінності у глікозиГлікозилювання антитіл 11 91823 12 люванні антитіл, і деякі відмінності спостерігаютьафінності зв'язування з Fc-рецептором та ефектося навіть для однієї клітинної лінії, вирощеної в рної функції, автори даного винаходу розробили різних умовах культивування (Lifely, M.R. et al., спосіб продукування таких АВМ. Між іншим, цей Glycobiology 5(8):813-22 (1995)). спосіб забезпечує продукування рекомбінантних, Одним зі способів отримання суттєвого підвихимерних антитіл або химерних фрагментів антищення ефективності, при підтриманні простого тіл. Ефективність цих АВМ додатково посилена процесу продукування та потенціальному виклюшляхом конструювання профілю глікозилювання ченні суттєвих небажаних побічних ефектів, є поFc-області антитіла. силення природних, клітинно-опосереднених ефеВідповідно, в одному з аспектів даний винахід кторних функцій моноклональних антитіл шляхом стосується виділеного полінуклеотиду, що вклюконструювання їх олігосахаридного компонента, як чає: (а) послідовність, вибрану з групи, яка склаописано в Umana, P. et al., Nature Biotechnol. дається з: SEQ ID No:5, SEQ ID No:6 та SEQ ID 77:176-180 (1999) та патенті США № 6602684, поNo:7. (CDRs VH-1); (b) послідовність, вибрану з грувний вміст яких включений в цю заявку у вигляді пи, яка складається з: SEQ ID No:21, SEQ ID No:22 посилання. Антитіла lgG1-типу, що найчастіше та SEQ ID No:23. (CDRs VH-2); та SEQ ID No:24. В застосовуються в імунотерапії раку, є глікопротеїіншому аспекті даний винахід стосується виділенонами, що мають консервативний N-зчеплений сайт го полінуклеотиду, що включає SEQ ID No:8, SEQ глікозилювання в Asn297 у кожному СН2-домені. ID No:9 та SEQ ID No:10. (CDRs VL). В одному з Два комплексні двоантенарні олігосахариди, прикваріантів здійснення будь-який з цих полінуклеоріплені до Asn297, сховані між СН2-доменами та тидів кодує злитий поліпептид. утворюють великі контакти з поліпептидним ланВ наступному аспекті даний винахід стосуєтьцюгом, і їх присутність є важливою для опосередся виділеного полінуклеотиду, що включає SEQ ID нення антитілом ефекторних функцій, наприклад, No:3 В іншому аспекті даний винахід стосується антитіло-залежної клітинної цитотоксичності виділеного полінуклеотиду, що включає SEQ ID (ADCC) (Lifely, M.R., et al., Glycobiology 5:813-822 No:4. В наступному аспекті даний винахід стосу(1995); Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163:59-76 ється виділеного полінуклеотиду, що включає пос(1998); Wright, A. and Morrison, S.L., Trends лідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ Biotechnol. 15:26-32 (1997)). ID No:29; SEQ ID No:31; SEQ ID No:33; SEQ ID Автори даного винаходу раніш вже продемонNo:35; SEQ ID No:37; SEQ ID No:39; SEQ ID No:41; стрували, що надмірна експресія у клітинах яєчниSEQ ID No:43; SEQ ID No:45; SEQ ID No:47; SEQ ID No:49; SEQ ID No:51; SEQ ID No:53; SEQ ID ка китайського хом'яка (СНО) (1,4)-ΝNo:55; SEQ ID No:57; SEQ ID No:59; SEQ ID No:61; ацетилглюкозамінілтрансферази III ("GnTIII"), гліSEQ ID No:63; SEQ ID No:65; SEQ ID No:67; SEQ козилтрансферази, що каталізує утворення симетID No:69; та SEQ ID No:71. В іншому аспекті даний рично розрізаних олігосахаридів, суттєво підвищує винахід стосується виділеного полінуклеотиду, що in vitro ADCC-активність анти-нейробластомного включає SEQ ID No:75. В одному з варіантів здійсхимерного моноклонального антитіла (chCE7), що нення такі полінуклеотиди кодують злиті поліпепвиробляється сконструйованими СНО-клітинами тиди. (Див. Umafia, P. et al., Nature Biotechnol. 77:176-180 Даний винахід також стосується виділеного (1999); та міжнародну публікацію WO 99/54342, полінуклеотиду, що включає послідовність, яка вміст яких включений в цю заявку у вигляді посимає, щонайменше, 80% ідентичності з SEQ ID лання). Антитіло chCE7 належить до великого No:3, при цьому згаданий виділений полінуклеотид класу некон'югованих mAbs, які мають високу кодує злитий поліпептид. У додатковому аспекті афінність та специфічність до пухлин, але надто даний винахід стосується виділеного полінуклеомалу ефективність для клінічного застосування у тиду, що включає послідовність, яка має, щонайвипадку продукування у стандартних промислових менше, 80% ідентичності з SEQ ID No:4, при цьому клітинних лініях, що не містять ферменту GnTIII згаданий виділений полінуклеотид кодує злитий (Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 77:176-180 поліпептид. Даний винахід також стосується виді(1999)). Те дослідження було першим, в якому леного полінуклеотиду, що включає послідовність, було показано, що великі підвищення ADCCяка має, щонайменше, 80% ідентичності з посліактивності можуть бути отримані шляхом конструдовністю, вибраною з групи, яка складається з ювання антитіло-продукуючих клітин, які експреSEQ ID No:29; SEQ ID No:31; SEQ ID No:33; SEQ сують GnTIII, що також приводить до підвищення ID No:35; SEQ ID No:37; SEQ ID No:39; SEQ ID частки зв'язаних з константною областю (Fc), сиNo:41; SEQ ID No:43; SEQ ID No:45; SEQ ID No:47; метрично розрізаних олігосахаридів, включаючи SEQ ID No:49; SEQ ID No:51; SEQ ID No:53; SEQ симетрично розрізані нефукозильовані олігосахаID No:55; SEQ ID No:57; SEQ ID No:59; SEQ ID риди, вище рівнів, виявлених у природних антитіNo:61; SEQ ID No:63; SEQ ID No:65; SEQ ID No:67; лах. SEQ ID No:69; та SEQ ID No:71, при цьому згадаЗалишається потреба у вдосконалених тераний виділений полінуклеотид кодує злитий поліпепевтичних підходах до цілеспрямування на антиптид. У додатковому аспекті даний винахід стосуген CD20 для лікування В-клітинних лімфом у ється виділеного полінуклеотиду, що включає приматів, включаючи, але не тільки, людей. послідовність, яка має, щонайменше, 80% ідентиКороткий виклад винаходу чності з SEQ ID No:75, при цьому згаданий виділеДізнавшись про величезний терапевтичний ний полінуклеотид кодує злитий поліпептид. потенціал антиген-зв'язуючих молекул (АВМ), що Даний винахід також стосується полінуклеотимають специфічність зв'язування з антитілом миші ду, що включає SEQ ID No:11 (весь важкий ланB-Ly1 і є глікоконструйованими для посилення 13 91823 14 цюг), або полінуклеотидів, що мають 80%, 85%, довність Fc-області антитіла, або її фрагмент, з 90%, 95% або 99% ідентичності з SEQ ID No:11. біологічного виду, відмінного від миші. Даний винахід також стосується полінуклеотиду, Даний винахід також стосується вектора ексщо включає SEQ ID No:12 (весь легкий ланцюг), пресії, що включає будь-який з виділених полінукабо полінуклеотидів, що мають 80%, 85%, 90%, леотидів, описаних вище, та клітини-хазяїна, яка 95% або 99% ідентичності з SEQ ID No:12. містить такий вектор експресії. В наступному аспеДаний винахід також стосується виділеного кті даний винахід стосується клітини-хазяїна, що полінуклеотиду, що кодує химерний поліпептид, включає будь-який з виділених полінуклеотидів, який має послідовність SEQ ID No:1. В одному з описаних вище. варіантів здійснення полінуклеотид містить посліВ одному з аспектів даний винахід стосується довність, що кодує поліпептид, який має послідоввиділеного поліпептиду, що включає: (а) послідовність SEQ ID No:1; та послідовність, що кодує поність, вибрану з групи, яка складається з: SEQ ID ліпептид, який має послідовність Fc-області No:15, SEQ ID No:16 та SEQ ID No.:17. (CDRs VH-1); антитіла, або її фрагмент, з біологічного виду, від(b) послідовність, вибрану з групи, яка складається мінного від миші. Даний винахід також стосується з: SEQ ID No:25, SEQ ID No:26 та SEQ ID No:27 виділеного полінуклеотиду, що кодує химерний (CDRs VH-2); та SEQ ID No:28, при цьому згаданий поліпептид, який має послідовність, вибрану з груполіпептид є злитим поліпептидом. В іншому аспепи, яка складається з SEQ ID No:30; SEQ ID No:32; кті даний винахід стосується виділеного поліпепSEQ ID No:34; SEQ ID No:36; SEQ ID No:38; SEQ тиду, що включає SEQ ID No:18, SEQ ID No:19 та ID No:40; SEQ ID No:42; SEQ ID No:44; SEQ ID SEQ ID No:20. (CDRs VL), при цьому згаданий поNo:46; SEQ ID No:48; SEQ ID No:50; SEQ ID No:52; ліпептид є злитим поліпептидом. SEQ ID No:54; SEQ ID No:56; SEQ ID No:58; SEQ Даний винахід також стосується химерного ID No:60; SEQ ID No:62; SEQ ID No:64; SEQ ID поліпептиду, що включає послідовність SEQ ID No:66; SEQ ID No:68; SEQ ID No:70; та SEQ ID No:1 або її варіант. Даний винахід також стосуєтьNo:72. В одному з варіантів здійснення полінуклеся химерного поліпептиду, що включає послідовотид містить послідовність, що кодує поліпептид, ність SEQ ID No:2 або її варіант. В одному з варіаякий має послідовність, вибрану з групи, яка склантів здійснення будь-який з цих поліпептидів також дається з SEQ ID No:30; SEQ ID No:32; SEQ ID містить Fc-область людини. Даний винахід також No:34; SEQ ID No:36; SEQ ID No:38; SEQ ID No:40; стосується химерного поліпептиду, що включає SEQ ID No:42; SEQ ID No:44; SEQ ID No:46; SEQ послідовність, вибрану з групи, яка складається з ID No:48; SEQ ID No:50; SEQ ID No:52; SEQ ID SEQ ID No:30; SEQ ID No:32; SEQ ID No:34; SEQ No:54; SEQ ID No:56; SEQ ID No:58; SEQ ID No:60; ID No:36; SEQ ID No:38; SEQ ID No:40; SEQ ID SEQ ID No:62; SEQ ID No:64; SEQ ID No:66; SEQ No:42; SEQ ID No:44; SEQ ID No:46; SEQ ID No:48; ID No:68; SEQ ID No:70; та SEQ ID No:72; та посліSEQ ID No:50; SEQ ID No:52; SEQ ID No:54; SEQ довність, що кодує поліпептид, який має послідовID No:56; SEQ ID No:58; SEQ ID No:60; SEQ ID ність Fc-області антитіла, або її фрагмент, з біолоNo:62; SEQ ID No:64; SEQ ID No:66; SEQ ID No:68; гічного виду, відмінного від миші. SEQ ID No:70; та SEQ ID No:72, або її варіант. ДаВ наступному аспекті даний винахід стосуєтьний винахід також стосується химерного поліпепся виділеного полінуклеотиду, що кодує химерний тиду, що включає послідовність SEQ ID No:76 або поліпептид, який має послідовність SEQ ID No:2. В її варіант. В одному з варіантів здійснення будьодному з варіантів здійснення полінуклеотид місякий з цих поліпептидів також містить Fc-область тить послідовність, що кодує поліпептид, який має людини. послідовність SEQ ID No:2; та послідовність, що В іншому аспекті даний винахід стосується покодує поліпептид, який має послідовність Fcліпептиду, що включає послідовність, отриману з області антитіла, або її фрагмент, з біологічного антитіла миші B-Ly1, та послідовність, отриману з виду, відмінного від миші. В наступному аспекті ксеногенного поліпептиду, а також антигенданий винахід стосується виділеного полінуклеозв'язуючої молекули, що включає такий поліпептиду, що кодує химерний поліпептид, який має тид. В одному з варіантів здійснення антигенпослідовність SEQ ID No:76. В одному з варіантів зв'язуюча молекула являє собою антитіло. У перездійснення полінуклеотид містить послідовність, важному варіанті здійснення антитіло є химерним. що кодує поліпептид, який має послідовність SEQ В іншому переважному варіанті здійснення антитіID No:76; та послідовність, що кодує поліпептид, ло є гуманізованим або приматизованим. який має послідовність Fc-області антитіла, або її У додатковому аспекті даний винахід стосуфрагмент, з біологічного виду, відмінного від миші. ється виділеного поліпептиду, що включає SEQ ID Даний винахід також стосується виділеного No:13 або її варіант. В іншому аспекті даний винаполінуклеотиду, який включає послідовність, що хід стосується виділеного поліпептиду, що вклюкодує поліпептид, який має VН-область антитіла чає SEQ ID No:14. миші B-Ly1, або її функціональні варіанти, та посВ іншому аспекті даний винахід стосується лідовність, що кодує поліпептид, який має посліАВМ, що здатна конкурувати з антитілом миші Bдовність Fc-області антитіла, або її фрагмент, з Ly1 за зв'язування з CD20 та є химерною. В однобіологічного виду, відмінного від миші. В наступму з варіантів здійснення АВМ являє собою антиному аспекті даний винахід стосується виділеного тіло або його фрагмент. В іншому варіанті здійсполінуклеотиду, який включає послідовність, що нення АВМ являє собою рекомбінантне антитіло, кодує поліпептид, який має VL-область антитіла що включає область, яка має аміникислотну посмиші B-Ly1, або її функціональні варіанти, та послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ лідовність, що кодує поліпептид, який має посліID No:1; SEQ ID No:30; SEQ ID No:32; SEQ ID 15 91823 16 No:34; SEQ ID No:36; SEQ ID No:38; SEQ ID No:40; включає введення терапевтично ефективної кільSEQ ID No:42; SEQ ID No:44; SEQ ID No:46; SEQ кості АВМ за даним винаходом суб'єкту-людині, ID No:48; SEQ ID No:50; SEQ ID No:52; SEQ ID що потребує такого лікування. У переважному ваNo:54; SEQ ID No:56; SEQ ID No:58; SEQ ID No:60; ріанті здійснення захворювання лікують шляхом SEQ ID No:62; SEQ ID No:64; SEQ ID No:66; SEQ введення АВМ, що є химерним антитілом або хиID No:68; SEQ ID No:70; та SEQ ID No:72. В іншому мерним фрагментом антитіла. варіанті здійснення АВМ являє собою рекомбінанВ наступному аспекті даний винахід стосуєтьтне антитіло, що включає VL-область, яка має аміся клітини-хазяїна, сконструйованої для експресії, никислотну послідовність, вибрану з групи, яка щонайменше, однієї нуклеїнової кислоти, що кодує складається з SEQ ID No:2 та SEQ ID No:76. У наполіпептид, який має активність GnTllI у кількості, ступному варіанті здійснення АВМ являє собою достатній для модифікації олігосахаридів у Fcрекомбінантне антитіло, що є приматизованим. У області, продукованої клітиною-хазяїном, при цьонаступному варіанті здійснення АВМ являє собою му АВМ здатна конкурувати з антитілом миші Bрекомбінантне антитіло, що є гуманізованим. В Ly1 за зв'язування з CD20 і є химерною. В одному іншому варіанті здійснення АВМ являє собою рез варіантів здійснення поліпептид, що має активкомбінантне антитіло, що включає Fc-область люність GnTIII, є злитим поліпептидом. В іншому вадини. У наступному варіанті здійснення будь-яка з ріанті здійснення АВМ, продукована клітиноюАВМ, описаних вище, може бути кон'югована з хазяїном, є антитілом або фрагментом антитіла. В такою групою, як токсин або радіоактивна мітка. наступному варіанті здійснення АВМ містить обДаний винахід також стосується АВМ за даним ласть, еквівалентну Fc-області IgG людини. винаходом, при цьому АВМ включає модифіковані Даний винахід також стосується виділеного олігосахариди. В одному з варіантів здійснення полінуклеотиду, який включає, щонайменше, одну модифіковані олігосахариди мають знижене фукообласть, що визначає комплементарність (CDR), з зилювання порівняно з немодифікованими олігоантитіла миші B-Ly1, або її варіант чи усічену фосахаридами. В інших варіантах здійснення модирму, яка містить, як мінімум, залишки, що визнафіковані олігосахариди є гібридними або чають специфічність для згаданої області, що викомплексними. У наступному варіанті здійснення значає комплементарність, при цьому згаданий АВМ має підвищену частку нефукозильованих виділений полінуклеотид кодує злитий поліпептид. олігосахаридів або симетрично розрізаних нефуПереважно, такі виділені полінуклеотиди кодують козильованих олігосахаридів у Fc-області згаданої злитий поліпептид, що є антиген-зв'язуючою молемолекули. В одному з варіантів здійснення симеткулою. В одному з варіантів здійснення полінуклерично розрізані нефукозильовані олігосахариди є отид містить три області, що визначають комплегібридними. У наступному варіанті здійснення симентарність, з антитіла миші B-Ly1, або їх варіанти метрично розрізані нефукозильовані олігосахариабо усічені форми, які містять, як мінімум, залишди є комплексними. В одному з варіантів здійсненки, що визначають специфічність для кожної зі ня, щонайменше, 20% олігосахаридів у Fc-області згаданих трьох областей, що визначають комплезгаданого поліпептиду є нефукозильованими або ментарність. В іншому варіанті здійснення полінусиметрично розрізаними нефукозильованими. У клеотид кодує повну варіабельну область легкого більш переважних варіантах здійснення, щонайабо важкого ланцюга химерного (наприклад, гумаменше, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, нізованого) антитіла. Даний винахід також стосу70% або 75% або більше олігосахаридів є нефукоється поліпептидів, що кодуються такими полінукзильованими або симетрично розрізаними нефулеотидами. козильованими. В іншому варіанті здійснення даний винахід Даний винахід також стосується полінуклеотистосується молекули, що з'єднується з антигеном, ду, що кодує будь-яку з АВМ, описаних вище, а яка включає, щонайменше, одну область, що витакож векторів експресії та клітин, що включають значає комплементарність, з антитіла миші B-Ly1, такий полінуклеотид. або її варіант чи усічену форму, яка містить, як Даний винахід також стосується способу промінімум, залишки, що визначають специфічність дукування АВМ, що здатна конкурувати з антитідля згаданої області, що визначає комплементарлом миші B-Ly1 за зв'язування з CD20 і є химерність, і яка включає послідовність, отриману з ксеною; при цьому згаданий спосіб включає: (а) ногенного поліпептиду. В одному з варіантів здійскультивування клітини-хазяїна, що включає полінення антиген-зв'язуюча молекула містить три нуклеотид, що кодує АВМ за даним винаходом, у області, що визначають комплементарність, з анпевному середовищі в умовах, які забезпечують титіла миші B-Ly1, або їх варіанти або усічені фоекспресію згаданого полінуклеотиду, що кодує рми, які містять, як мінімум, залишки, що визначазгадану АВМ; та (b) видобування згаданої АВМ з ють специфічність для кожної зі згаданих трьох кінцевої культури. областей, що визначають комплементарність. В В іншому аспекті даний винахід стосується іншому аспекті антиген-зв'язуюча молекула місфармацевтичної композиції, що включає АВМ за тить варіабельну область легкого або важкого лавинаходом. Передбачається, що фармацевтичні нцюга антитіла. В одному з особливо корисних композиції можуть додатково містити фармацевваріантів здійснення антиген-зв'язуюча молекула тично прийнятний носій, допоміжну речовину або являє собою химерне, наприклад, гуманізоване, їх комбінацію. антитіло. Даний винахід також стосується способів В наступному аспекті даний винахід стосуєтьвироблення таких антиген-зв'язуючих молекул та ся способу лікування захворювання, що піддаєтьїх застосування у лікуванні захворювань, включася лікуванню шляхом вичерпання В-клітин. Спосіб ючи В-клітинні лімфоми. 17 91823 18 Даний винахід є першим відомим випадком має активність GnTIII, в умовах, що забезпечують конструювання анти-CD20 антитіла II типу, що має вироблення згаданої АВМ та модифікацію олігосапідвищені ефекторні функції, такі як ADCC, при харидів, присутніх у Fc-області згаданої АВМ; та збереженні потужної здатності викликати апоптоз. (b) виділення згаданої АВМ; при цьому згадана Відповідно, даний винахід стосується сконструйоАВМ здатна конкурувати з антитілом миші B-Ly1 за ваного анти-CD20 антитіла II типу, що має у резв'язування з CD20 та є химерною. В одному з зультаті згаданого конструювання підвищену варіантів здійснення поліпептид, який має активADCC-активність без втрати потужної здатності ність GnTIII, являє собою злитий поліпептид, певикликати апоптоз. В одному з варіантів здійсненреважно такий, що включає каталітичний домен ня були сконструйовані анти-CD20 антитіла II типу GnTIII та домен локалізації Гольджі ксеногенного зі зміненою моделлю глікозилювання у Fc-області. Гольджі-резидентного поліпептиду, вибраного з В окремому варіанті здійснення змінене глікозигрупи, яка складається з домену локалізації манолювання включає підвищений рівень симетрично зидази II, домену локалізації (1,2)-Νрозрізаних комплексних залишків у Fc-області. В ацетилглюкозамінілтрансферази І ("GnTI"), домену іншому окремому варіанті здійснення змінене глілокалізації манозидази І, домену локалізації (1,2)козилювання включає знижений рівень фукозних N-ацетилглюкозамінілтрансферази II ("GnTII") та залишків у Fc-області. В іншому варіанті здійснендомену локалізації 1-6 внутрішньої фукозилтрання анти-CD20 антитіла II типу піддали поліпептидсферази. Переважно, домен локалізації Гольджі ному конструюванню. Даний винахід також стосувибирають з манозидази II або GnTI. ється способів вироблення таких сконструйованих В наступному аспекті даний винахід стосуєтьантитіл II типу та способів застосування таких анся способу модифікації профілю глікозилювання титіл у лікуванні різних В-клітинних розладів, анти-CD20 АВМ, продукованої клітиною-хазяїном, включаючи В-клітинні лімфоми. що включає введення в клітину-хазяїна, щонаймеКлітина-хазяїн за даним винаходом може бути нше, однієї нуклеїнової кислоти або вектора ексвибрана з групи, що включає, наприклад, клітину пресії за даним винаходом. В одному з варіантів СНО, клітину BHK, клітину NSO, клітину SP2/0, здійснення АВМ являє собою антитіло або фрагклітину мієломи YO, клітину мієломи миші Р3Х63, мент антитіла та переважно включає Fc-область клітину PER, клітину PER.C6 або клітину гібридоімуноглобуліну. В альтернативі, поліпептид являє ми. В одному з варіантів здійснення клітина-хазяїн собою злитий білок, що включає область, еквіваза даним винаходом додатково містить трансфеклентну Fc-області IgG людини. тований полінуклеотид, що включає полінуклеоВ одному з аспектів даний винахід стосується тид, що кодує VL-область антитіла миші B-Ly1 або рекомбінантного химерного антитіла, або фрагмеїї варіанти, та послідовність, що кодує область, нта антитіла, що здатне конкурувати з антитілом еквівалентну Fc-області імуноглобуліну людини. В миші В-Ly1 за зв'язування з CD20 та має знижене іншому варіанті здійснення клітина-хазяїн за дафукозилювання. ним винаходом додатково містить трансфектоваВ іншому аспекті даний винахід стосується ний полінуклеотид, що включає полінуклеотид, способу модифікації глікозилювання рекомбінанткодуючий VН-область антитіла миші B-Ly1 або її ного антитіла або фрагмента антитіла за даним варіанти, та послідовність, що кодує область, еквівинаходом з використанням злитого поліпептиду, валентну Fc-області імуноглобуліну людини. що має активність GnTIII і включає домен локаліВ іншому аспекті даний винахід стосується клізації Гольджі ксеногенного Гольджі-резидентного тини-хазяїна, яка виробляє АВМ, що показує підполіпептиду. В одному з варіантів здійснення злиті вищену афінність зв'язування з Fc-рецептором поліпептиди за даним винаходом містять каталітита/або підвищену ефекторну функцію в результаті чний домен GnTIII. В іншому варіанті здійснення модифікації її олігосахаридів. В одному з варіантів домен локалізації Гольджі вибирають з групи, яка здійснення, зокрема, підвищеною є афінність зв'яскладається з домену локалізації манозидази II, зування з рецептором Fc RIIIA. Ефекторна функдомену локалізації (1,2)-Nція, передбачена тут, може бути вибрана з групи, ацетилглюкозамінілтрансферази І ("GnTI"), домену яка включає, наприклад, підвищену Fcлокалізації манозидази І, домену локалізації (1,2)опосереднену клітинну цитотоксичність; підвищене Ν-ацетилглюкозамінілтрансферази II ("GnTII"), та зв'язування з клітинами NK; підвищене зв'язування домену локалізації 1-6 внутрішньої фукозилтранз макрофагами; підвищене зв'язування з поліморсферази. Переважно, домен локалізації Гольджі фно-ядерними клітинами; підвищене зв'язування з вибирають з манозидази II або GnTI. моноцитами; підвищене пряме сигналізування, що В одному з варіантів здійснення спосіб за даіндукує апоптоз; підвищене дозрівання дендритних ним винаходом спрямований на вироблення рекоклітин; та підвищене праймування Т-клітин. мбінантного химерного антитіла або фрагмента У наступному варіанті здійснення клітинаантитіла, з модифікованими олігосахаридами, при хазяїн за даним винаходом містить, щонайменше, цьому згадані модифіковані олігосахариди мають одну нуклеїнову кислоту, що кодує поліпептид, знижене фукозилювання порівняно з немодифікоякий має активність GnTIII, оперативно зчеплену з ваними олігосахаридами. За даним винаходом ці конститутивним промоторним елементом. модифіковані олігосахариди можуть бути гібридВ іншому аспекті даний винахід стосується ними або комплексними. В іншому варіанті здійсспособу продукування АВМ у клітині-хазяїні, який нення спосіб за даним винаходом спрямований на включає: (а) культивування клітини-хазяїна, сконсвироблення рекомбінантного химерного антитіла труйованої для експресії, щонайменше, одного або фрагмента антитіла, що має збільшену частку полінуклеотиду, що кодує злитий поліпептид, який симетрично розрізаних нефукозильованих оліго 19 91823 20 сахаридів у Fc-області згаданого поліпептиду. В іншому аспекті даний винахід стосується фармаодному з варіантів здійснення симетрично розріцевтичної композиції, що включає злитий білок, зані нефукозильовані олігосахариди є гібридними. вироблений будь-яким зі способів за даним винаВ іншому варіанті здійснення симетрично розрізані ходом, та фармацевтично прийнятний носій. нефукозильовані олігосахариди є комплексними. В Даний винахід також стосується способу лікунаступному варіанті здійснення спосіб за даним вання захворювання, що піддається лікуванню винаходом спрямований на вироблення рекомбішляхом вичерпання В-клітин, який включає ввенантного химерного антитіла або фрагмента антидення терапевтично ефективної кількості рекомбітіла, що має, щонайменше, 20% олігосахаридів у нантного химерного антитіла або фрагмента антиFc-області згаданого поліпептиду, які є симетричтіла, виробленого будь-яким зі способів за даним но розрізаними та нефукозильованими. У перевавинаходом, суб'єкту-людині, що потребує такого жному варіанті здійснення, щонайменше, 30% олілікування. госахаридів у Fc-області згаданого поліпептиду є Короткий опис графічних матеріалів симетрично розрізаними та нефукозильованими. В Фіг.1. Нуклеотидна (SEQ DO No:3) та амінокиіншому переважному варіанті здійснення, щонайслотна послідовність (SEQ ID No:1) VН-області менше, 35% олігосахаридів у Fc-області згаданого антитіла миші B-Ly1. поліпептиду є симетрично розрізаними та нефукоФіг.2. Нуклеотидна (SEQ ID No:4) та амінокисзильованими. лотна послідовність (SEQ ID No:2) VL-області анВ наступному аспекті даний винахід стосуєтьтитіла миші B-Ly1. ся рекомбінантного химерного антитіла або фрагФіг.3. Зв'язування Ритуксимабу (О) та chмента антитіла, що показує підвищену афінність B_Ly1 ( ) з CD20 на клітинах В-лімфоми лінії Raji. зв'язування з Fc-рецептором та/або підвищену Фіг.4. Вичерпання В-клітин Ритуксимабом (О) ефекторну функцію в результаті модифікації його та ch-B_Ly1 ( ) у цільній крові трьох різних класів олігосахаридів. В одному з варіантів здійснення, генотипу Fc RIIIa-158V/F: (А) цільній крові від дозокрема, підвищеною є афінність зв'язування з Fcнора F/F, гомозиготного на рецептор з нижчою активуючим рецептором. У наступному варіанті афінністю; (В) цільній крові від донора F/V, гетероздійснення Fc-рецептор являє собою Fс зиготного на рецептор з афінністю; та (С) цільній активуючий рецептор, зокрема, рецептор Fc RIIIA. крові від донора V/V, гомозиготного на рецептор з Ефекторна функція, передбачена у даному винавищою афінністю. ході, може бути вибрана з групи, яка включає, наФіг.5. Нуклеотидна (SEQ ID No:11) та амінокиприклад, підвищену Fc-опосереднену клітинну слотна послідовність (SEQ ID No:13) важкого ланцитотоксичність; підвищене зв'язування з клітинацюга химерного анти-CD20 антитіла. ми NK; підвищене зв'язування з макрофагами; Фіг.6. Нуклеотидна (SEQ ID No:12) та амінокипідвищене зв'язування з поліморфно-ядерними слотна послідовність (SEQ ID No:14) легкого ланклітинами; підвищене зв'язування з моноцитами; цюга химерного анти-CD20 антитіла. підвищене пряме сигналізування, що індукує апопФіг.7. CDR нуклеотидної та амінокислотної потоз; підвищене дозрівання дендритних клітин; та слідовностей антитіла миші B-Ly1. (А) Розраховані підвищене праймування Т-клітин. CDR для VН-області. (В) Розраховані CDR VLВ іншому аспекті даний винахід стосується реобласті. комбінантного химерного антитіла або фрагмента Фіг.8. Профіль MALDI-TOF глікоконструйоваантитіла, що має специфічність зв'язування з анного химерного антитіла B-Ly1. (А) Таблиця, що титілом миші В-Ly1 та містить Fc-область, і сконспоказує процентне співвідношення специфічних труйоване з підвищеною ефекторною функцєію, піків; (В) Спектр для глікоконструйованого химеряке виробляють будь-яким зі способів за даним ного антитіла B-Ly1; (С) Спектр для глікоконструвинаходом. йованого химерного антитіла B-Ly1, обробленого В іншому аспекті даний винахід стосується Endo-H. злитого білка, що включає поліпептид, який має Фіг.9. Зв'язування різних гуманізованих антипослідовність SEQ ID No:1, та область, еквіваленCD20 антитіл з В-клітинами лінії Raji. Відмінності тну Fc-області імуноглобуліну, і сконструйований з між конструктом В-НН2 та конструктами B-HL8 та підвищеною ефекторною функцєію, який виробB-HL11 містяться у каркасних областях 1 та 2, при ляють будь-яким зі способів за даним винаходом. цьому всі три CDR ідентичні. B-HL8 та B-HL11 В іншому аспекті даний винахід стосується включають послідовності FR1 та FR2, отримані з злитого білка, що включає поліпептид, який має класу VH3 людини, тоді як повний каркас В-НН2 послідовність SEQ ID No:2 та область, еквівалентотриманий з VH1 людини. B-HL11 є похідним Вну Fc-області імуноглобуліну, і сконструйований з HL8 з однією мутацією GlulGln, при цьому Gln є підвищеною ефекторною функцєію, який виробамінокислотним залишком у конструкті В-НН2. Це ляють будь-яким зі способів за даним винаходом. означає, що заміна GlulGin не змінює ані афінносВ одному з аспектів даний винахід стосується ті, ані інтенсивності зв'язування. Інші відмінності фармацевтичної композиції, що включає рекомбіміж В-НН2 та B-HL8 включають 14 залишків FR, нантне химерне антитіло, вироблене будь-яким зі один або більше з яких будуть впливати на харакспособів за винаходом, та фармацевтично прийнтер зв'язування цього антитіла з антигеном. ятний носій. В іншому аспекті даний винахід стосуФіг.10. Зв'язування гуманізованого анти-CD20 ється фармацевтичної композиції, що включає антитіла BHL4-KV1 на цільових Т-клітинах лінії фрагмент рекомбінантного химерного антитіла, Raji. Конструкт B-HL4 отримано з антитіла В-НН2 вироблений будь-яким зі способів за даним винашляхом заміни FR1 у В-НН2 на FR1 послідовності ходом, та фармацевтично прийнятний носій. В VH1_45 зародкової лінії людини. Цей конструкт 21 91823 22 показує сильно знижену антиген-зв'язуючу здатли за Calcein-утриманням відносно детергентного ність, незважаючи на присутність інших амінокислізису (100%) та лізису без Аb (0%). Антитіла, що лот лише в трьох положеннях всередині FR1. Ці використовувалися: С2В8 (химерна, неглікоконстзалишки розташовані у положеннях 2, 14 та 30, руйована форма); BHH2-KVl-wt (гуманізована, незгідно з нумерацією Kabata. З цих трьох положень, глікоконструйована форма BHH2-KV1); BHH2-KV1положення 30 здається таким, що спричиняє найGE (гуманізована, глікоконструйована форма більший вплив, оскільки є частиною визначення BHH2-KV1). Хотіа області CDR1. Фіг.17. MALDI/TOF-MS профіль PNGaseFФіг.11. Порівняння характеристик зв'язування вивільнених Fc-олігосахаридів немодифікованого, В-HН1, В-НН2, В-НН3 та батьківського антитіла Bнеглікоконструйованого BHH2-KV1-гуманізованого Ly1. Дані показують, що всі Аb мають приблизно антитіла lgG1 B-Ly1 проти CD20 людини. однакову величину ЕС50, але конструкт В-HН1 Фіг.18. MALDI/TOF-MS профіль PNGaseFзв'язується з нижчою інтенсивнісвивільнених Fc-олігосахаридів глікоконструйованотю/стехіометричним співідношенням, ніж варіанти го BHH2-KV1g1-гуманізованого антитіла lgG1 BВ-НH2 та В-НН3. В-НН1 можна відрізнити від ВLy1 проти CD20 людини. Глікоконструювання проНН2 та В-HН3 за його частково людськими обласводили шляхом коекспресії у клітинах-хазяях генів тями CDR1 та CDR2 (визначення Kabata), а також антитіла та гена, що кодує фермент з каталітичполіморфізмом Ala/Thr у положенні 28 (нумерація ною активністю -1,4-NKabata). Це показує, що або положення 28, або ацетилглюкозамінілтрансферази III (GnT-III). повна CDR1 та/або повна CDR2 важливі для взаФіг.19. MALDI/TOF-MS профіль PNGaseFємодії антитіло/антиген. вивільнених Fc-олігосахаридів глікоконструйованоФіг.12. Порівняння B-HL1, В-НН1 та батьківсьго BHH2-KV1g2-гуманізованого антитіла lgG1 Bкого антитіла B-Ly1. Дані показують відсутність Ly1 проти CD20 людини. Глікоконструювання пробудь-якої активності зв'язування у конструкті Bводили шляхом коекспресії у клітинах-хазяях генів HL1 та приблизно вдвічі нижчу інтенсивантитіла та генів, що кодують фермент з каталітиність/стехіометричне співідношення зв'язування Вчною активністю -1,4-NНН1 порівняно з B-Ly1. Як B-HL1, так і В-НН1 скоацетилглюкозамінілтрансферази III (GnT-III) та нструйовані на основі акцепторних каркасів, отрифермент з каталітичною активністю -манозидази маних з класу VH1 людини. Крім інших відмінносII Гольджі. тей, положення 71 (нумерація Kabata) конструкта Фіг.20. Зв'язування неглікоконструйованих та B-HL1 є найбільш разючою відмінністю, що покаглікоконструйованих антитіл з рецептором людини зує його можливе значення для зв'язування з анFc RIIIa, присутнім на поверхні рекомбінантних тигеном. клітин CHO-CD16. Фіг.13. Флюороцитометричне дослідження Фіг.21. Апоптоз клітин Ζ-138 MCL, спричинений здатності зв'язування анти-CD20 антитіла з його нe-Fc-конструйованими та Fc-конструйованими антигеном. Результати показали, що конструкти Bанти-CD20 антитілами. Подробиці дослідження: HL2 та B-HL3 не виявляють CD20-зв'язуючої акти5 105 клітин/лунку висіяли у 24-лункові пластини вності. (5 105 клітин/мл) у культуральне середовище. У Фіг.14. Апоптоз клітин Z-138 MCL, спричинений лунки додали 10 мг відповідного Ab, PBS у негатианти-CD20 антитілами. вному контрольному досліді. Зразки інкубували Фіг.15. Апоптоз, спричинений анти-CD20 антипротягом ночі (16 годин), забарвили AnnV-FITC та тілами. Подробиці дослідження: 5 105 клітин/лунку аналізували за допомогою FACS. Дослідження 5 висіяли у 24-лункові пластини (5 10 клітин/мл) у проводили у трьох екземплярах. Антитіла, що висередовище культури. У лунки додали 10 мг відпокористовувалися: С2В8=ритуксимаб (химерна, відного Ab, PBS у негативному контрольному доснеглікоконструйована форма, що відповідає комеліді або 5 мМ камптотецину (СРТ) у позитивному рційній формі); BHH2-KV1 (гуманізоване, неглікоконтрольному досліді. Зразки інкубували пр отягом конструйоване - профіль глікозилювання див. ночі (16 годин), забарвили AnnV-FITC (флуоресФіг.6); BHH2-KV1g1 (гуманізоване, глікоконструйоцинізотіоианат) та аналізували за допомогою ване - профіль глікозилювання див. Фіг.7); BHH2FACS. Дослідження проводили в трьох паралельKV1g2 (гуманізоване, глікоконструйоване - проних дослідах. (*): Сигнал для PBS віднімали (досфіль глікозилювання див. Фіг.8). Примітка: це дослід з PBS дав 8% та 2% AnnV-позитивних клітин лідження не включає жодних додаткових ефекторPR-1 та Z-138, відповідно). У дослідженні викорисних клітин, тільки цільові та антитіло або товували такі антитіла: С2В8 (химерне, неглікококонтрольні досліди. (*): Сигнал для PBS віднімали. нструйоване); BHH2-KV1 (гуманізоване, неглікокоДетальний опис винаходу нструйоване). Примітка: це дослідження не Терміни, що використовуються тут, є загальвключає жодних додаткових ефекторних клітин, ноприйнятними у відповідній науковій області, яктільки цільові та антитіло, або контрольні досліди. що не обумовлене інше, як описано нижче. Фіг.16. Знищення цільових клітин анти-CD20 Термін антитіло тут стосується повної молекуантитілами з імунними ефекторними клітинами. ли антитіла, включаючи моноклональні, поліклоПодробиці дослідження: вичерпання В-клітин у нальні та мультиспецифічні (наприклад, біспецинормальній цільній крові при інкубації протягом фічні) антитіла, а також фрагменти антитіл, що ночі та аналіз на CD19+/CD3+ за допомогою включають Fc-область та зберігають специфічFACS. ADCC з використанням РВМС у якості ефеність зв'язування, та злиті білки, що включають кторів, 4 години інкубації, співвідношення ефекобласть, еквівалентну Fc-області імуноглобуліну тор/ціль 25:1, знищення цільових клітин вимірювата зберігають специфічність зв'язування. Також 23 91823 24 цей термін включає гуманізовані, приматизовані та ацетилглюкозамініл-трансфераза (EC 2.4.1.144), химерні антитіла. згідно з номенклатурою Комітету з Номенклатури Термін Fc-область тут стосується С-кінцевої Міжнародного Союзу з Біохімії та Молекулярної області важкого ланцюга IgG. Хоча межі FcБіології (NC-IUBMB), у вимірах за допомогою певобласті важкого ланцюга IgG можуть трохи варіюного біологічного аналізу, при наявності або відсуватися, Fc-область важкого ланцюга IgG людини тності залежності від дози. У випадку, коли залежзвичайно визначають як таку, що простягається ність від дози існує, вона не обов'язково повинна від амінокислотного залишку в положенні Cys226 бути ідентична відповідній залежності для GnTIII, до карбоксильного закінчення. але повинна бути по суті подібною до дозозалежВираз область, еквівалентна Fc-області імуноності для даної активності порівняно з GnTIII (тобглобуліну, тут стосується природних алельних то, досліджуваний поліпептид буде показувати варіантів Fc-області імуноглобуліну, а також варіабільшу активність, або максимум у 25 разів меншу, нтів, що мають зміни, які приводять до заміщень, переважно, максимум у 10 разів меншу активність, приєднань або делецій, але суттєво не зменшують та найбільш переважно, максимум у 3 рази меншу здатності імуноглобуліну опосереднювати ефектоактивність порівняно з GnTIII). рні функції (такі як антитіло-залежна клітинна циВираз варіант (або аналог) тут стосується пототоксичність). Наприклад, одна або більше аміноліпептиду, що відрізняється від конкретно описакислот можуть бути делетовані з N-закінчення або ного поліпептиду за даним винаходом амінокислоС-закінчення Fc-області імуноглобуліну без суттєтними інсерціями, делеціями та заміщеннями, вої втрати біологічної функції. Такі варіанти моствореними шляхом використання, наприклад, жуть бути вибрані за загальними правилами, відотехнологій рекомбінантних ДНК. Варіанти АВМ за мими в біотехнології, так щоб спричиняти даним винаходом включають химерні, приматизомінімальний ефект на активність (див., наприклад, вані або гуманізовані антиген-зв'язуючі молекули, Bowie, J.U. et al., Science 247:1306-10 (1990)). в яких один або декілька амінокислотних залишків Вираз антиген-зв'язуюча молекула у даному модифіковані шляхом заміщення, приєднення описі стосується, у самому широкому сенсі, молета/або делеції таким чином, що це суттєво не кули, що специфічно зв'язується з антигенною девпливає на афінність зв'язування з антигеном (натермінантою. Зокрема, антиген-зв 'язуюча молекуприклад, CD20). Керівництво з визначення, які ла, що зв'язується з CD20 - це молекула, яка амінокислотні залишки можуть бути заміщені, приспецифічно зв'язується з клітинною поверхнею єднані або делетовані без погіршення активності, неглікозильованого фосфопротеїну довжиною що представляє інтерес, може бути знайдене 35000 Дальтон, що звичайно називають антигеном шляхом порівняння послідовності конкретного пообмеженої диференціації В-лімфоцитів людини ліпептиду з послідовностями гомологічних пептиВр35, із загальноприйнятним позначенням CD20. дів та мінімізації кількості змін в амінокислотній "Специфічно зв'язується" означає, що зв'язування послідовності, що проводяться в областях високої є селективним до антигена, і його можна відрізнигомологічності (консервативних областях), або ти від небажаних або неспецифічних взаємодій. шляхом заміни амінокислот консенсусною посліВираз злитий та химерний по відношенню до довністю. поліпептидів, таких як АВМ, тут стосується поліпеВ альтернативі, рекомбінантні варіанти, що птидів, що включають амінокислотні послідовності, кодують такі самі або подібні поліпептиди, можуть отримані з двох або більше ксеногенних поліпепбути синтезовані або селекціоновані шляхом викотидів, таких як частини антитіл з різних біологічних ристання "надмірності" у генетичному коді. Можуть видів. Наприклад, для химерних АВМ неантигенбути введені різноманітні заміщення кодонів, такі зв'язуючі компоненти можуть бути отримані з різяк "німі" зміни, які утворюють різноманітні рестрикноманітних видів, включаючи приматів, таких як ційні сайта, для оптимізації клонування у плазміду шимпанзе, та людей. Константна область химерабо вірусний вектор або експресії у певній проканої АВМ, найбільш переважно, є по суті ідентичріотичній або еукаріотичній системі. Мутації у поною константній області природного людського лінуклеотидній послідовності можуть бути відоантитіла; варіабельна область химерного антитібражені у поліпептиді або доменах з інших ла, найбільш переважно, є по суті ідентичною вапептидів, що додаються до поліпептиду для моріабельній області рекомбінантного анти-CD20 дифікації властивостей будь-якої частини поліпепантитіла, що має амінокислотну послідовність ватиду, для зміни характеристик, таких як лігандріабельної області антитіла миші B-Ly1. Гуманізозв'язуючі афінності, міжланцюгові афінності або вані антитіла є особливо переважною формою швидкість розпаду/кругообігу. злитого або химерного антитіла. Переважно, амінокислотні "заміщення" є реВираз поліпептид, що має "активність GnTIII" у зультатом заміни амінокислоти іншою амінокислоданому описі стосується поліпептидів, що здатні тою, що має подібні структурні та/або хімічні власкаталізувати приєднання залишку Nтивості, тобто, консервативних амінокислотних замін. "Консервативні" амінокислотні заміщення ацетилглюкозаміну (GlcNAc) у -1-4 містку до можуть бути здійснені на основі подібності полярзчепленого манозиду триманозильної основи Νності, заряду, розчинності, гідрофобності, гідрофізчеплених олігосахаридів. Такі поліпептиди вклюльності та/або амфіпатичної природи задіяних чають злиті поліпептиди, що виявляють фермензалишків. Наприклад, неполярні (гідрофобні) амітативну активність, подібну, але не обов'язково нокислоти включають аланін, лейцин, ізолейцин, ідентичну, до активності (1,4)-Nвалін, пролін, фенілаланін, триптофан та метіонін; ацетилглюкозамінілтрансферази IIІ, також відомої полярні нейтральні амінокислоти включають гліяк -1,4-манозил-глікопротеїн 4- -N 25 91823 26 цин, серин, треонін, цистеїн, тирозин, аспарагін та ласті як важкого, так і легкого ланцюга поліпептиглутамін; позитивно заряджені (основні) амінокисдів. Така особлива область була описана у Kabat лоти включають аргінін, лізин та гістидин, а негаet al., U.S. Dept. of Health and Human Services, тивно заряджені (кислотні) амінокислоти включа"Sequences of Proteins of Immunological Interest" ють аспарагінову кислоту та глутамінову кислоту. (1983) та Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 "Ісерції" або "делеції" переважно охоплюють діа(1987); обидва з цих джерел включені у дану заявпазон ~1-20 амінокислот, більш переважно 1-10 ку у вигляді посилання. В цих джерелах визначенамінокислот. Допустиме відхилення може бути ня включають перекриття або підмножини аміновизначене експериментально шляхом систематикислотних залишків при порівнянні їх між собою. чного здійснення ісерцій, делецій або заміщень Тим не менше, застосування кожного з цих визнаамінокислот у молекулі поліпептиду з використанчень по відношенню до CDR антитіла або її варіаням технологій рекомбінантних ДНК та аналізу нтів у даному винаході вважається таким, що знаотриманих рекомбінантних варіантів на активність. ходиться у рамках цього терміну. Відповідні Вираз гуманізовані у даному описі стосується амінокислотні залишки, що обмежують області антиген-зв'язуючої молекули, що отримана з неCDR згідно з кожним з наведених вище джерел, людської антиген-зв'язуючої молекули, наприклад, показані нижче у Таблиці 1 для порівняння. Точні антитіла миші, яка зберігає або по суті зберігає номери залишків, що обмежують кожну конкретну антиген-зв'язуючі властивості батьківської молекуCDR, можуть відрізнятися у залежності від посліли, але є менш імуногенною для людей. Це може довності та розміру CDR. Фахівець у даній технобути досягнуто різноманітними способами, вклюлогії може простим шляхом визначити, які залишки чаючи (а) пересадку повних нелюдських варіабескладають будь-яку конкретну CDR, маючи амінольних доменів у людські константні області для кислотну послідовність варіабельної області антиотримання химерних антитіл, (b) пересадку лише тіла. нелюдських CDR у людський каркас та константні області із збереженням або без збереження клюТаблиця 1 чових каркасних залишків (наприклад, таких, що є важливими для збереження достатньої афінності Визначення CDR1 зв'язування з антигеном або функцій антитіла), або (с) трансплантація повних нелюдських варіаKabat Chothia AbM бельних доменів, але "маскування" їх людиноподіVНCDR1 31-35 26-32 26-35 бною секцією, шляхом заміни поверхневих залишVHCDR2 50-65 52-58 50-58 ків. Такі способи описані у Jones et al., Morrison et VHCDR3 95-102 95-102 95-102 al., Proc. Natl. Acad. Sci, 81:6851-6855 (1984); VLCDR1 24-34 26-32 Morrison та Оі, Adv. Immunol, 44:65-92 (1988); VLCDR2 50-56 50-52 Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); VLCDR3 89-97 91-96 Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994), усі з яких пов1 Нумерація всіх визначень CDR у Табл. 1 відністю включені в дану заявку у вигляді посилання. повідає нумераційним методикам, викладеним Загалом, існує 3 області, що визначають комплеу Kabat et al. (див. нижче). ментарність, або CDR, (CDR1, CDR2 та CDR3) у кожному з варіабельних доменів важкого та легкоKabat із співробітниками також визначили сисго ланцюгів антитіла, фланковані чотирма каркастему нумерації для послідовностей варіабельних ними підобластями (тобто, FR1, FR2, FR3 та FR4) доменів, що придатна для будь-якого антитіла. у кожному з варіабельних доменів важкого та легЗвичайний фахівець у цій технології може недвокого ланцюгів антитіла: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3значно застосувати цю систему "нумерації Kabata" CDR3-FR4. Опис гуманізованих антитіл можна до будь-якої послідовності варіабельного домену, знайти, наприклад, у патенті США № 6632927 та в не покладаючись на будь-які експериментальні опублікованій патентній заявці США № дані за межами самої послідовності. "Нумерація 2003/0175269, що повністю включені в дану заявку Kabata" у даному описі стосується системи нумеу вигляді посилання. рації, що викладена у Kabat et al., U.S. Dept. Health Подібним чином, вираз приматизовані у даноand Human Services, "Sequences of Proteins of му описі стосується антиген-зв'язуючої молекули, Immunological Interest" (1983). Якщо не обумовлеотриманої з антиген-зв'язуючої молекули біологічне інше, посилання на нумерацію специфічних ного виду, що не є приматом, наприклад, антитіла положень амінокислотних залишків у АВМ відповімиші, яка зберігає або по суті зберігає антигендають системі нумерації Kabata. Послідовності у зв'язуючі властивості батьківської молекули, але є переліку послідовностей (тобто, SEQ ID No:1-SEQ менш імуногенною для приматів. ID No:78) не є нумерованими за системою нумеУ випадку, коли існує два або більше визнарації Kabata. чень терміну, що застосовується та/або признаний Під нуклеїновою кислотою або полінуклеотиу відповідній галузі науки, вважається, що визнадом, що має нуклеотидну послідовність, напричення терміну, який використовується у даному клад, щонайменше, на 95% "ідентичну" еталонній описі, включає всі такі значення, якщо не обумовнуклеотидній послідовності за даним винаходом, лене інше. Одним з прикладів є застосування терслід розуміти нуклеотидну послідовність полінукміну "область, що визначає комплементарність" леотиду, що є ідентичною до еталонної послідов("CDR"), який описує несуміжні антиген-приєднуючі ності за виключенням того, що полінуклеотидна сайта, що знаходяться у межах варіабельної об 27 91823 28 послідовність може включати до п'яти точечних співпадають/вирівнюються із запитуваною послімутацій на кожні 100 нуклеотидів еталонної нукледовністю, розраховують для корекції процента отидної послідовності. Інакше кажучи, для отриідентичності вручну. мання полінуклеотиду, що має нуклеотидну посліНаприклад, об'єктну послідовність з 90 основ довність, щонайменше, на 95% ідентичну вирівнюють із запитуваною послідовністю зі 100 еталонній нуклеотидній послідовності, до 5% нукоснов для визначення процента ідентичності. У 5'леотидів у еталонній послідовності можуть бути закінчення об'єктної послідовності присутні деледелетовані або заміщені іншим нуклеотидом, або ції, тому FASTDB-вирівнювання не показує співпапевна кількість нуклеотидів, до 5% загальної кільдання/вирівнювання перших 10 основ у 5'кості нуклеотидів у еталонній послідовності, мозакінчення. Ці 10 непарних основ представляють жуть бути інсертовані в еталонну послідовність. 10% послідовності (кількість основ у 5'- та 3'Запитувана послідовність може бути повною посзакінчень, що не співпадають/загальна кількість лідовністю, показаною на Фіг.24 або Фіг.25. основ у запитуваній послідовності), тому 10% відНа практиці, чи є будь-яка певна молекула нунімають від процента ідентичності, розрахованого клеїнової кислоти або поліпептиду, щонайменше, за програмою FASTDB. Якщо 90 основ, що залина 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% шилися, показали точне співпадання, тоді кінцевий ідентичною нуклеотидній послідовності або поліпроцент ідентичності складає 90%. В іншому прикпептидній послідовності за даним винаходом, моладі об'єктну послідовність з 90 основ порівнюють же бути визначено традиційними способами з виз запитуваною послідовністю зі 100 основ. Цього користанням відомих комп'ютерних програм. разу делеції є внутрішніми делеціями, тому у 5'Переважний спосіб визначення найкращого загаабо 3'-закінчень об'єктної послідовності немає осльного співпадання між запитуваною послідовніснов, що не співпадають/вирівнюються із запитуватю (послідовністю за даним винаходом) та об'єктною послідовністю. В цьому випадку процент іденною послідовністю, що також називають тичності, розрахований за FASTDB, не потребує глобальним вирівнюванням послідовностей, може корекції вручну. Знов-таки, лише основи у 5'- або бути визначений з використанням комп'ютерної 3'-закінчень об'єктної послідовності, що не співпапрограми FASTDB на основі алгоритма Brutlag et дають/вирівнюються із запитуваною послідовнісal., Comp. Арр. Biosci. (5:237-245 (1990)). При вирітю, коригують вручну. В рамках даного винаходу внюванні послідовностей, запитувана та об'єктна ніяких інших корекцій вручну не проводять. послідовності обидві є ДНК-послідовностями. РНКПід поліпептидом, що має амінокислотну поспослідовність можна порівнювати, перетворивши лідовність, наприклад, щонайменше, на 95% "іденU на Т. Результатом згаданого глобального вирівтичну" запитуваній амінокислотній послідовності за нювання послідовностей буде процент ідентичносданим винаходом, слід розуміти амінокислотну ті. Переважні параметри, що використовуються послідовність об'єктного поліпептиду, що є ідентипри FASTDB вирівнюванні ДНК-послідовностей чною запитуваній послідовності, за виключенням для розрахунку процента ідентичності, включають: того, що об'єктна поліпептидна послідовність може Матриця=одинична, k-кортеж=4, штраф за невключати до п'яти амінокислотних змін на кожні ствпадання=1, штраф за сполучення=30, довжина 100 амінокислот запитуваної амінокислотної посгрупи рандомізації=0, межа відсікання=1, штраф за лідовності. Інакше кажучи, щоб отримати поліпеппропуск=5, штраф за розмір пропуску 0.05, розмір тид, що має аміникислотну послідовність, щонайвікна=500 або довжині об'єктної нуклеотидної посменше, на 95% ідентичну запитуваній лідовності, в залежності від того, що коротше. амінокислотній послідовності, до 5% амінокислотЯкщо об'єктна послідовність коротше запитуних залишків в об'єктній послідовності можуть бути ваної послідовності за рахунок 5'-або 3'-делецій, а інсертовані, делетовані або заміщені іншою аміноне за рахунок внутрішніх делецій, корекція резулькислотою. Ці зміни еталонної послідовності можуть татів повинна бути проведена вручну. Це зумоввідбуватися в амінотермінальних або карбоксителене тим, що програма FASTDB не враховує 5'-та рмінальних положеннях еталонної амінокислотної 3'-усічення об'єктної послідовності при розрахунку послідовності або в будь-якому місці між цими тепроцента ідентичності. Для об'єктних послідовносрмінальними положеннями, украплюючись або тей, усічених у 5'- або 3'-закінчень по відношенню окремо між залишками в еталонній послідовності, до запитуваної послідовності, процент ідентичносабо в одній або більше суміжних групах всередині ті коригують шляхом розрахунку кількості основ еталонної послідовності. запитуваної послідовності, що є 5'- та 3'На практиці, визначення наявності будь-якого закінченнями об'єктної послідовності, які не співпевного поліпептиду, щонайменше, на 80%, 85%, падають/вирівнюються, у вигляді проценту від за90%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% ідентичного гальної кількості основ запитуваної послідовності. еталонному поліпептиду, можна провести традиСпівпадання/вирівнювання нуклеотиду, визначаційними способами з використанням відомих комють за результатами вирівнювання послідовносп'ютерних програм. Переважний спосіб визначентей FASTDB. Тоді цей процент віднімають від проня найкращого загального співпадання між центу ідентичності, розрахованого за програмою запитуваною послідовністю (послідовністю за даFASTDB с використанням вказаних вище параменим винаходом) та об'єктною послідовністю, що трів, і отримують кінцевий процент ідентичності. також називають глобальним вирівнюванням посСаме цю скориговану величину використовують в лідовностей, може бути визначений з використанрамках даного винаходу. Лише основи, що знахоням комп'ютерної програми FASTDB на основі алдяться за межами 5'- та 3'-основ об'єктної послідогоритму Brutlag et al., Comp. Арр. Biosci. (5:237-245 вності, як показує вирівнювання FASTDB, які не (1990)). При вирівнюванні послідовностей запиту 29 91823 30 вана та об'єктна послідовності є або обидві нуклецьому випадку процент ідентичності, розраховаотидними послідовностями, або обидві амінокисний за FASTDB, не потребує корекції вручну. Зновлотними послідовностями. Результатом згаданого таки, лише положення залишків у N- та Сглобального вирівнювання послідовностей буде закінчень об'єктної послідовності, як показує виріпроцент ідентичності. Переважні параметри, що внювання FASTDB, що не співпадавикористовуються при амінокислотному вирівнюють/вирівнюються із запитуваною послідовністю, ванні FASTDB, включають: Матриця=РАМ, kкоригують вручну. У рамках даного винаходу нікортеж=2, штраф за неспівпадання=1, штраф за яких інших корекцій вручну не проводять. сполучення=30, довжина групи рандомізації=0, У даному винаході нуклеїнова кислота, що "гімежа відсікання=1, розмір вікна=довжині послідовбридизується в жорстких умовах" з послідовністю ності, штраф за пропуск=5, штраф за розмір пронуклеїнової кислоти за даним винаходом, стосупуску 0,05, розмір вікна=500 або довжині об'єктної ється полінуклеотиду, що гібридизується в резульамінокислотної послідовності, у залежності від таті інкубації протягом ночі при 42°С у розчині, що того, що коротше. містить 50% формаміду, 5х SSC (750 мМ NaCl, 75 Якщо об'єктна послідовність коротше запитумМ цитрату натрію), 50 мМ фосфату натрію (рН ваної послідовності за рахунок N-та С7,6), 5х розчину Денхардта, 10% декстрану сультермінальних делецій, а не внутрішніх делецій, фату та 20мкг/мл денатурованої, деградованої корекція результатів повинна бути проведена врушляхом гідродинамічного зсуву ДНК з молок лосочну. Це зумовлене тим, що програма FASTDB не севих, з наступною промивкою фільтрів у 0,1х SSC враховує N- та С-термінальні усічення об'єктної при ~65°С. послідовності при розрахунку глобального проценВираз домен локалізації Гольджі тут стосуєтьта ідентичності. Для об'єктних послідовностей, ся амінокислотної послідовності Гольджіусічених у N- та С-закінчень по відношенню до резидентного поліпептиду, що відповідає за закрізапитуваної послідовності, процент ідентичності плення цього поліпептиду на місці всередині комкоригують шляхом розрахунку кількості залишків плексу Гольджі. Як правило, домени локалізації запитуваної послідовності, що є N- та Смістять амінотермінальні "хвости" ферменту. закінченнями об'єктної послідовності, які не співВираз ефекторна функція тут стосується таких падають/вирівнюються з відповідним об'єктним біологічних активностей, що можуть бути віднесені залишком, у вигляді проценту від загальної кількодо Fc-області (Fc-області нативної послідовності сті основ запитуваної послідовності. Співпаданабо Fc-області варіантної амінокислотної послідоня/вирівнювання залишку визначають за резульвності) антитіла. Приклади ефекторних функцій татами вирівнювання послідовностей FASTDB. антитіла включають, наприклад, афінність зв'язуТоді цей процент віднімають від проценту ідентичвання з Fc-рецептором, антитіло-залежна клітинна ності, розрахованого за програмою FASTDB з вицитотоксичність (ADCC), антитіло-залежний клікористанням вказаних вище параметрів, та отритинний фагоцитоз (ADCP), секреція цитокінів, опомують кінцевий процент ідентичності. Саме цю середнене імунним комплексом поглинання антискориговану величину використовують в рамках генів антиген-презентуючими клітинами, даунданого винаходу. Лише залишки до N- та Срегуляція клітинних поверхневих рецепторів тощо. закінчень об'єктної послідовності, що не співпадаВирази конструювати, сконструйований, консють/вирівнюються із запитуваною послідовністю, труювання та конструювання глікозилювання у враховують для корекції процента ідентичності даному описі стосуються будь-яких маніпуляцій з вручну. Тобто, розглядають лише ті положення моделлю глікозилювання природного або рекомбізалишків запитуваної послідовності, що знахонантного поліпептиду або фрагмента поліпептиду. дяться поза найвіддаленішими N- та СКонструювання глікозилювання включає метаболітермінальними залишками об'єктної послідовності. чне конструювання механізму глікозилювання кліНаприклад, об'єктну послідовність з 90 амінотини, включаючи генетичні маніпуляції зі шляхами кислот них зали шків вирівнюють з запитуваною синтезу олігосахаридів для досягнення зміненого послідовністю зі 100 залишків для визначення глікозилювання глікопротеїнів, що експресуються в процента ідентичності. У N-закінчення об'єктної клітинах. Крім того, конструювання глікозилювання послідовності присутні делеції, тому FASTDBвключає вплив на глікозилювання за допомогою вирівнювання не показує співпаданмутацій та клітинного середовища. ня/вирівнювання перших 10 залишків у NВираз клітина-хазяїн тут стосується будь-якого закінчення. Ці 10 непарних залишків представлятипу клітинної системи, що може бути сконструйоють 10% послідовності (кількість залишків у N- та вана з метою вироблення поліпептидів та антигенС-закінчень, що не співпадають/загальна кількість зв'язуючих молекул за даним винаходом. В однозалишків у запитуваній послідовності), тому 10% му з варіантів здійснення сконструйовано клітинувіднімають від процента ідентичності, розраховахазяїна, що забезпечує продукування антигенного за програмою FASTDB. Якщо 90 основ, що зв'язуючої молекули з модифікованими глікофорзалишилися, показали точне співпадання, тоді мами. У переважному варіанті здійснення антигенкінцевий процент ідентичності складає 90%. В інзв'язуюча молекула являє собою антитіло, фрагшому прикладі об'єктну послідовність з 90 залишмент антитіла або злитий білок. У деяких варіанків порівнюють із запитуваною послідовністю зі 100 тах здійснення клітини-хазяї піддають додатковій залишків. Цього разу делеції є внутрішніми делеобробці таким чином, щоб забезпечити підвищені ціями, тому у N- та С-закінчень об'єктної послідоврівні експресії одного або більше поліпептидів, що ності немає основ, що не співпадамають GnTIII-активність. Клітини-хазяї включають ють/вирівнюються із запитуваною послідовністю. В культивовані клітини, наприклад, культивовані 31 91823 32 клітини ссавців, такі як клітини СНО, клітини BHK, 3) аналіз проводять за таким протоколом: клітини NS0, клітини SP2/0, клітини мієломи ΥΟ, і) клітини РВМС виділяють із використанням клітини мієломи миші Р3Х63, клітини PER, клітини стандартних методик центрифугування у градієнті PER.C6 або клітини гібридоми, клітини дріжджів, щільності та суспендують при концентрації 5 10б клітини комах, рослинні клітини та багато інших, а клітин/мл у середовищі клітинної культури RPMI; також клітини, що містяться всередині тканин траіі) цільові клітини вирощують стандартними нсгенних тварин, трансгенних рослин або культиспособами культивування тканин, збирають у фазі вованих рослин або тварин. експонентного росту при життєздатності вище ніж Вираз Fc-опосереднена клітинна цитотоксич90%, промивають у середовищі клітинної культури ність тут стосується антитіло-залежної клітинної RPMI, вводять мітку 100 мікрокюрі 51Сr, двічі процитотоксичності та клітинної цитотоксичності, опомивають середовищем клітинної культури та песередненої розчинним Fc-злитим білком, що місресуспендують у середовищі клітинної культури тить Fc-область людини. Це імунний механізм, що при щільності 105 клітин/мл; веде до лізису "цільових клітин антитіла" "імуноеііі) 100 мкл кінцевої суспензії цільових клітин, фекторними клітинами людини", при цьому: описаної вище, вносять у кожну лунку 96-лункової Імуноефекторні клітини людини являють сопластини мікротитратору; бою популяцію лейкоцитів, що мають Fciv) готують серію розведень антитіла від 4000 рецептори на своїй поверхні, за допомогою яких нг/мл до 0,04 нг/мл у середовищі клітинної культувони зв'язуються з Fc-областю антитіл або Fcри, та 50 мкл отриманих розчинів антитіла додазлитих білків та виконують ефекторні функції. Така ють у цільові клітини у 96-лунковій пластині мікропопуляція може включати, наприклад, мононуклетитратору, досліджуючи у трьох паралельних арні клітини периферичної крові (РВМС) та/або дослідах різні концентрації антитіла, що охоплюприродні кіллерні (NK) клітини. ють весь діапазон концентрацій, вказаний вище; Цільові клітини антитіла являють собою клітиν) для контрольних дослідів максимального ни, що зв'язуються антитілами або Fc-злитими вивільнення (MR) у 3 додаткові лунки пластини, білками. Антитіла або Fc-злиті білки зв'язуються з що містять мічені цільові клітини, додають 50 мкл цільовими клітинами через N-закінчення білкової 2% (об./об.) водного розчину неіонного детергента частини, зчепленого з Fc-областю. (Nonidet, Sigma, St. Louis), замість розчину антитіВираз підвищена Fc-опосереднена клітинна ла (пункт iv); цитотоксичність у даному описі стосується підвиvi) для контрольних дослідів спонтанного вивіщення кількості або "цільових клітин антитіла", льнення (SR) у 3 додаткові лунки пластини, що підданих лізису за даний проміжок часу, при даній містять мічені цільові клітини, додають 50 мкл секонцентрації антитіла або Fc-злитого білка у серередовища клітинної культури RPMI замість розчидовищі, що оточує цільові клітини, за механізмом ну антитіла (пункт iv); Fc-опосередненої клітинної цитотоксичності, виvii) потім 96-лункову пластину мікротитратору значеної вище, та/або зниження концентрації анцентрифугують при 50 g протягом 1 хвилини та титіла або Fc-злитого білка у середовищі, що отоінкубують протягом 1 години при 4°С; чує цільові клітини, необхідної для досягнення viii) 50 мкл суспензії у РВМС (пункт і) додають лізису даної кількості "цільових клітин антитіла" за у кожну лунку для отримання співвідношення ефеданий проміжок часу за механізмом Fcкторнихгцільових клітин 25:1 та вміщують пластиопосередненої клітинної цитотоксичності. Підвини в інкубатор в атмосфері 5% СО2 при 37°С на 4 щення Fc-опосередненої клітинної цитотоксичності години; стосується клітинної цитотоксичності, опосереднеіх) з кожної лунки збирають супернатант, що ної тим самим антитілом або Fc-злитим білком, не містить клітин, та оцінюють експериментально продукованим тим самим типом клітин-хазяїв, з вивільнену радіоактивність (ER) з використанням використанням тих самих стандартних способів гамма-лічильника; вироблення, очистки, складання рецептури та х) процент специфічного лізису розраховують зберігання, відомих фахівцям, але не продуковадля кожної концентрації антитіла за формулою ним клітинами-хазяями, сконструйованими для (ER-MR)/(MR-SR) 100, де ER - середня оцінена експресії глікозилтрансферази GnTIII способами, радіоактивність (див. пункт іх) для цієї концентрації наведеними у даному описі. антитіла, MR - середня оціненарадіоактивність Під антитілом, що має підвищену антитіло(див. пункт іх) для контрольних дослідів MR (див. залежну клітинну цитотоксичність (ADCC) у данопункт v), a SR - середня оцінена радіоактивність му описі слід розуміти антитіло, що має підвищену (див. пункт іх) для контрольних дослідів SR (див. ADCC, виявлену будь-яким придатним способом, пункт vi); відомим звичайним фахівцям у цій галузі. Одним із 4) "підвищену ADCC" визначають або як підзагальноприянятних in vitro аналізів на ADCC є вищення максимального проценту специфічного такий: лізису, що спостерігається у діапазоні досліджених 1) аналіз використовує цільові клітини, що віконцентрацій антитіла, та/або як зниження концендомі як такі, що експресують цільовий антиген, трації антитіла, необхідної для досягнення полоякий впізнається антиген-зв'язуючою областю анвини максимального проценту специфічного лізититіла; су, що спостерігається у діапазоні досліджених 2) аналіз використовує мононуклеарні клітини концентрацій антитіла. Підвищення ADCC стосупериферичної крові (РВМС) людини, виділені з ється ADCC, виміряної за допомогою описаного крові випадково вибраного здорового донора, у вище аналізу, опосередненої тим самим антитілом якості ефекторних клітин; або Fc-злитим білком, продукованим тим самим 33 91823 34 типом клітин-хазяїв, з використанням тих самих снення, полінуклеотид містить три області, що стандартних способів вироблення, очистки, склавизначають комплементарність, з антитіла миші Bдання рецептури та зберігання, відомих фахівцям, Ly1, або їх варіанти або усічені форми, які містять, але не продукованим клітинами-хазяями, сконстяк мінімум, залишки, що визначають специфічність руйованими для надмірної експресії глікозилтрандля кожної з трьох областей, які визначають комсферази GnTIII. плементарність. В іншому з варіантів здійснення В одному з аспектів даний винахід стосується полінуклеотид кодує повну варіабельну область антиген-зв'язуючих молекул, що мають специфічлегкого або важкого ланцюга химерного (наприність зв'язування антитіла миші B-Ly1, та відкриття клад, гуманізованого) антитіла. Даний винахід татого факту, що їх ефекторна функція може бути кож стосується поліпептидів, що кодуються такими посилена за рахунок зміни глікозилювання. В одполінуклеотидами. ному з варіантів здійснення, антиген-зв'язуюча В іншому варіанті здійснення даний винахід молекула являє собою химерне антитіло. У перестосується молекули, що з'єднується з антигеном, важному варіанті здійснення даний винахід стосуяка включає, щонайменше, одну область, що виється химерного антитіла, або фрагмента антитізначає комплементарність, з антитіла миші B-Ly1, ла, що включає CDR, показані на Фіг.7. Зокрема, у або її варіант чи усічену форму, що містить, як переважному варіанті здійснення даний винахід мінімум, залишки, що визначають специфічність стосується виділеного полінуклеотиду, що вклюдля згаданої області, яка визначає комплементарчає: (а) послідовність, вибрану з групи, яка скланість, та яка включає послідовність, отриману з дається з: SEQ ID No:5, SEQ ID No:6 та SEQ ID ксеногенного поліпептиду. В одному з варіантів No:7. (CDRs VH-1); та (b) послідовність, вибрану з здійснення антиген-зв'язуюча молекула містить групи, яка складається з: SEQ ID No:21, SEQ ID три області, що визначають комплементарність, з No:22 та SEQ ID No:23. (CDRs VH-2); та SEQ ID антитіла миші B-Ly1, або їх варіанти або усічені No:24. В іншому переважному варіанті здійснення форми, що містять, як мінімум, залишки, які визнаданий винахід стосується виділеного полінуклеочають специфічність для кожної зі згаданих трьох тиду, що включає SEQ ID No:8, SEQ ID No:9 та областей, що визначають комплементарність. В SEQ ID No:10. (CDRs VL). В одному з варіантів іншому аспекті антиген-зв'язуюча молекула місздійснення будь-який з цих полінуклеотидів кодує тить варіабельну область легкого або важкого лазлитий поліпептид. нцюга антитіла. В одному з особливо корисних В іншому варіанті здійснення антигенваріантів здійснення антиген-зв'язуюча молекула зв'язуюча молекула містить VН-домен антитіла являє собою химерне, наприклад, гуманізоване, миші B-Ly1, показаний на Фіг.1, або його варіант; антитіло. Даний винахід також стосується способів та немишачий поліпептид. В іншому переважному вироблення таких антиген-зв'язуючих молекул та варіанті здійснення даний винахід стосується анїх застосування у лікуванні захворювань, включатиген-зв'язуючої молекули, що включає VL-домєн ючи В-клітинні лімфоми. антитіла миші В-Ly1, показаний на Фіг.1, або його Відомо, що у терапевтичній ефективності анваріант; та немишачий поліпептид. ти-CD20 антитіл задіяні декілька механізмів, вклюВ іншому аспекті даний винахід стосується анчаючи антитіло-залежну клітинну цитотоксичність тиген-зв'язуючих молекул, що включають одну або (ADCC), комплемент-залежну цитотоксичність більше усічених CDR антитіла BLy-1. Такі усічені (CDC) та індукування затримки росту або апоптоCDR будуть містити, як мінімум, амінокислотні зу. Наприклад, більшість експериментальних досзалишки, що визначають специфічність для даної ліджень показують, що ритуксимаб працює за звиCDR. "Залишок, що визначає специфічність" означайними ефекторними механізмами, що можуть чає такі залишки, що безпосередньо приймають бути кількісно оцінені пробами на CDC та ADCC. участь у взаємодії з антигеном. Як правило, лише Подібним чином, було показано, що резистентблизько 1/5-1/3 залишків у даній CDR приймають ність різних клітин лімфоми до ритуксимабу in vivo участь у зв'язуванні з антигеном. Залишки, що виє функцією їх чутливості до CDC in vitro. У протизначають специфічність для певної CDR, можуть лежність цьому, механізм дії in vivo іншого антитібути ідентифіковані, наприклад, розрахунком міла, що було ухвалене для терапевтичного застожатомних контактів шляхом тривимірного модесування, В1, не потребує активності ані лювання та визначенням варіабельності послідовкомплементу, ані природних кіллерних (NK) клітин. ності при даному положенні залишка способами, Натомість, ефективність В1 in vivo зумовлена його описаними у роботі Padlan et al., FASEB J. здатністю індукувати потужний апопотоз. 9(1):133-139 (1995), вміст якої повністю включений Загалом, анти-CD20 моноклональні антитіла у дану заявку у вигляді посилання. можна розділити на дві відмінні категорії за їх меВідповідно, даний винахід також стосується ханізмом знищення клітин лімфоми. Aнти-CD20 виділеного полінуклеотиду, що включає, щонайантитіла І типу для знищення цільових клітин гоменше, одну область, що визначає комплементаловним чином використовують комплемент, а анрність, з антитіла миші B-Ly1, або її варіант або титіла II типу працюють за іншими механізмами, усічену форму, яка містить, як мінімум, залишки, головним чином викликаючи апоптоз. Ритуксимаб що визначають специфічність для згаданої областа 1F5 є прикладами анти-CD20 антитіл І типу, а ті, яка визначає комплементарність, при цьому В1 є прикладом антитіла II типу. Див., наприклад, згаданий виділений полінуклеотид кодує злитий Cragg, M.S. and Glennie, M.J., Blood 103(7):2738поліпептид. Переважно, такі виділені полінуклео2743 (квітень 2004); Teeling, J.L. et al., Blood тиди кодують злитий поліпептид, що є антиген104(6):1793-1800 (вересень 2004), повний вміст зв'язуючою молекулою. В одному з варіантів здійяких включений в дану заявку у вигляді посилання. 35 91823 36 Даний винахід є першим відомим випадком поліцистронному) векторі. Тоді вони можуть бути конструювання анти-CD20 антитіла II типу, що має очищені та зібрані in vitro у повне антитіло; метопідвищені ефекторні функції, такі як ADCC, при дології проведення такого збирання описані. Див., збереженні потужної здатності викликати апоптоз. наприклад, Scharff, M., Harvey Lectures 69:125 Відповідно, даний винахід стосується сконструйо(1974). Також описані параметри реакції in vitro ваного анти-CD20 антитіла II типу, що має в редля утворення IgG-антитіл зі скорочених виділених зультаті згаданого конструювання підвищену легких та важких ланцюгів. Див., наприклад, Sears ADCC-активність без втрати потужної здатності et al., Biochem. 16(9):2016-25 (1977). індукувати апоптоз. В одному з варіантів здійсненВ особливо переважному варіанті здійснення ня були сконструйовані анти-CD20 антитіла II типу химерна АВМ за даним винаходом являє собою зі зміненою моделлю глікозилювання у Fc-області. гуманізоване антитіло. Способи гуманізації нелюдВ окремому варіанті здійснення змінене глікозиських антитіл відомі в науці. Наприклад, гуманізолювання включає підвищений рівень симетрично вані АВМ за даним винаходом можуть бути отрирозрізаних комплексних залишків у Fc-області. У мані способами, описаними у патенті США № іншому окремому варіанті здійснення змінене глі5225539, Winter, патенті США № 6180370, Queen козилювання включає знижений рівень фукозних et al., або патенті США № 6632927, Adair et al., залишків у Fc-області. Див. опубліковану патентну повний вміст кожного з яких включений в дану зазаявку США № 2004 0093621, Shitara et al., повний явку у вигляді посилання. Переважно, гуманізовавміст якої включений в дану заявку у вигляді посине антитіло має один або більше амінокислотних лання. В іншому варіанті здійснення анти-CD20 залишків, введених в нього з джерела, що не є антитіла II типу були піддані поліпептидному конслюдським. Ці нелюдські амінокислотні залишки труюванню, як описано у патенті США № 6737056 часто називають "імпортними" залишками, які звиPresta або в опублікованій патентній заявці США чайно беруть з "імпортних" варіабельних доменів. № 20040185045 (Macrogenics) або в опублікованій Гуманізація по суті може бути проведена способом патентній заявці США № 20040132101 (Xencor), Winter та співробітників (Jones et al., Nature, повний вміст яких включений в дану заявку у ви321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, гляді посилання. Даний винахід також стосується 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, способів вироблення таких сконструйованих анти239:1534-1536 (1988)), шляхом заміщення послітіл II типу та способів застосування таких антитіл у довностей гіперваріабельної області на відповідні лікуванні різних В-клітинних розладів, включаючи послідовності людського антитіла. Відповідно, такі В-клітинні лімфоми. "гуманізовані" антитіла є химерними антитілами Химерне антитіло миші/людини вже було опи(патент США № 4816567), в яких суттєво менше, сане. Див., наприклад, Morrison, S.L. et al., PNAS ніж повний варіабельний домен людини, заміщено 11:6851-6854 (листопад 1984); публікація патенту на відповідну послідовність з біологічного виду, Європи № 173494; Boulianna, G.L, at al., Nature відмінного від людини. На практиці гуманізовані 312:642 (грудень 1984); Neubeiger, M.S. et al., антитіла звичайно є людськими антитілами, в яких Nature 314:268 (березень 1985); публікація патенту деякі залишки гіперваріабельної області та, можЄвропи № 125023; Tanetal., J. Immunol. 135:8564 ливо, деякі FR-залишки заміщені залишками з (листопад 1985); Sun, L.K et al., Hybridoma 5(1):517 аналогічних сайтів антитіл гризунів. Об'єктні гума(1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066-1074 нізовані анти-CD20 антитіла будуть містити конс(1986). Див. загалом Muron, Nature 312:597 (грутантні області людського імуноглобуліну. день 1984); Dickson, Genetic Engineering News 5(3) Вибір людських варіабельних доменів, легких (березень 1985); Marx, Science 229:455 (серпень та важких, для використання у гуманізованих ан1985); та Morrison, Science 229:1202-1207 (веретитілах є дуже важливим для зниження антигенносень 1985). Robinson et al., у публікації РСТ № сті. Згідно з так званим способом "найкращої відWO/88104936 описують химерне антитіло з консповідності", послідовність варіабельного домену тантною областю людини та варіабельною обласантитіла гризуна піддають скринінгу проти цілої тю миші, що має специфічність до певного епітопу бібліотеки відомих послідовністей людських варіаCD20; мишача частина химерного антитіла в робельних доменів. Тоді людську послідовність, що є боті Робінсона отримана з моноклонального антинайближчою до послідовності гризуна, приймають тіла миші 2Н7 (гамма 2b, каппа). Тоді як у роботі як людську каркасну область (FR) для гуманізовазазначено, що описане химерне антитіло є "осноного антитіла (Sims et al., J. Immunol, 151:2296 вним кандидатом" для лікування В-клітинних роз(1993); Chothia et al., J. Mol Biol, 196:901 (1987)). ладів, цю заяву можна розглядати не більше як Інший спосіб відбору людської каркасної послідовпропозицію для фахівців перевірити справедлиності включає порівняння послідовності кожної вість такого твердження стосовно цього антитіла, індивідуальної підобласті повного каркасу гризуна зокрема, тому що в роботі відсутні будь-які дані, (тобто, FR1, FR2, FR3, та FR4) або певної комбіякі б підтверджували його терапевтичну ефективнації індивідуальних підобластей (наприклад, FR1 ність, а найважливіше, дані досліджень з використа FR2) проти бібліотеки відомих послідовністей танням вищих ссавців, таких як примати або люди. людських варіабельних областей, які відповідають Методології вироблення химерних антитіл цій каркасній підобласті (що визначається, наприописані в літературі. Наприклад, легкий та важкий клад, за нумерацією Kabata), та вибір людської ланцюги можуть бути експресовані окремо, з викопослідовності для кожної підобласті або комбінації, ристанням, наприклад, легкого ланцюга імуноглощо є найближчою до послідовності гризуна (Leung, буліну та важких ланцюгів імуноглобуліну в окрепублікація патентної заявки США № мих плазмідах або в одному (наприклад, 2003/0040606А1, опублікована 27.02.2003). Інший 37 91823 38 спосіб використовує певну каркасну область, гим, щоб забезпечити накопичення антитіла пухотриману з консенсусної послідовності всіх людсьлиною і, на відміну від 131І, 90Υ є чистим бетаких антитіл певної підгрупи легких або важких ланвипромінювачем високої енергії без супроводжуюцюгів. Той самий каркас може бути використаний чого гамма-випромінення при його розпаді, з роздля декількох різних гуманізованих антитіл (Carter повсюдженням у тканині від 100 до 1000 клітинних et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); діаметрів. Крім того, мінімальна величина прониPresta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)). каючої радіації дає можливість амбулаторного Також важливо, щоб антитіло було гуманізозастосування 90Y-мічених антитіл. На додаток, для ване із збереженням високої афінності до антигену знищення клітин не потрібне поглинання міченого та інших сприятливих біологічних властивостей. антитіла клітиною, і локальне випромінювання Для досягнення цієї мети, згідно з переважним іонізуючої радіації буде летальним для сусідніх способом, гуманізовані антитіла отримують шляпухлинних клітин, що не містять цільового антигехом аналізу батьківских послідовностей та різнону. манітних концептуальних гуманізованих продуктів Ефективні однократні лікувальні дози (тобто, з використанням тривимірних моделей батьківских терапевтично ефективні кількості) 90Y-мічених анта гуманізованих послідовностей. Тривимірні моти-CD20 антитіл складають діапазон від ~5 до ~75 делі імуноглобулінів широко доступні та знайомі mСі, більш переважно від ~10 до ~40 mСі. Ефекфахівцям. Також доступні комп'ютерні програми, тивні однократні лікувальні дози 131І-мічених антищо ілюструють та відображають можливі тривиміCD20 антитіл, що не приводять до абляції кісткорні конформаційні структури вибраних послідовнового мозку, складають діапазон від ~5 до ~70 mСі, стей кандидатних імуноглобулінів. Розгляд цих більш переважно від ~5 до ~40 mСі. Ефективні відображень дає можливість аналізу ймовірної однократні абляційні лікувальні дози (тобто такі, ролі залишків у функціонуванні послідовностей що можуть викликати необхідність аутологічної кандидатних імуноглобулінів, тобто, аналізу залитрансплантації кісткового мозку) 131І-мічених антишків, що впливають на здатність кандидатного CD20 антитіл складають діапазон від ~30 до -600 імуноглобуліну зв'язуватися з його антигеном. ТаmСі, більш переважно від ~50 до менш ніж ~500 ким шляхом можуть бути вибрані FR-залишки з mСі. У зв'язку з химерним анти-CD20 антитілом, реципієнтної та імпортної послідовностей та об'євнаслідок довшого напівперіоду циркуляції порівднані з отриманням бажаної характеристики антиняно з мишачими антитілами, ефективні однократіла, наприклад, підвищеної афінності до цільовотні лікувальні дози 131І-мічених химерних антиго антигену (антигенів). Як правило, залишки CD20 антитіл, що не приводять до абляції кісткогіперваріабельної області безпосередньо та найвого мозку, складають діапазон від ~5 до ~40 mCi, більш суттєво задіяні в механізмах антигенбільш переважно менше ніж ~30 mСі. Критерії візв'язування. дображення, наприклад, для 111Іn-мітки, звичайно В іншому варіанті здійснення сконструйовані складають менше ніж ~5 mСі. Лікування міченими антиген-зв'язуючі молекули за даним винаходом, анти-CD20 антитілами може також проводитися у що мають підвищену афінність зв'язування, наприрежимі однократної лікувальної обробки або багаклад, способами, описаними в опублікованій патетократних лікувальних обробок. Внаслідок присутнтній заявці США № 2004/0132066, Balint et al., ності радіонуклідного компоненту, перед лікуванповний вміст якої включений в дану заявку у виням бажано зібрати периферичні стовбурові гляді посилання. клітини ("PSC") або кістковий мозок ("ВМ") для В одному з варіантів здійснення антигенпацієнтів, що зазнають потенціально смертельну зв'язуюча молекула за даним винаходом кон'юготоксичність кісткового мозку від радіації. ВМ та/або вана з додатковою групою, такою як радіоактивна PSC збирають з використанням стандартних техмітка або токсин. Такі кон'юговані АВМ можуть нологій, а тоді очищають та заморожують для мобути вироблені різноманітними способами, добре жливого зворотного вливання. Крім того, найбільш відомими фахівцям. переважно провести для пацієнта перед лікуванУ даному винаході можуть бути застосовані ріням діагностичне дозиметричне дослідження з зноманітні радіонукліди, і фахівці мають можливикористанням діагностичного міченого антитіла вість легко визначити, який радіонуклід є найбільш (наприклад, з міткою 111Іn), щоб пересвідчитися, 131 придатним в різних обставинах. Наприклад, І є що терапевтичне мічене антитіло (наприклад, з добре відомим радіонуклідом, що застосовують використанням 90Y) не утворить небажаних накодля цільової імунотерапії. Проте клінічна кориспичень у будь-якому нормальному органі або тканість 131І може бути обмежена декількома факіранині. ми, включаючи: восьмиденний фізичний період У переважному варіанті здійснення даний винапіврозпаду; дегалогенування йодованого антитінахід стосується виділеного полінуклеотиду, який ла як в крові, так і на ділянках пухлин; та характевключає послідовність, що кодує поліпептид, який має аміникислотну послідовність, представлену ристики випромінення (наприклад, великий нижче в Табл. 3. Даний винахід також стосується компонент), що можуть бути субоптимальними для виділеної нуклеїнової кислоти, що включає послілокалізованого відкладення дози у пухлині. З поядовність, щонайменше, на 80%, 85%, 90%, 95%, вою покращених хелатуючих засобів, можливості 96%, 97%, 98% або 99% ідентичну нуклеотидній прикріплення метал-хелатуючих груп до білків збіпослідовності, що представлена нижче в Табл. 2. льшили можливості застосування інших радіонукВ іншому варіанті здійснення даний винахід стосулідів, таких як 111Іn та 90Υ. 90Υ забезпечує декілька ється виділеної нуклеїнової кислоти, яка включає переваг при застосуванні в радіоімунотерапії: 64послідовність, що кодує поліпептид, який має амігодинний період напіврозпаду 90Υ є достатньо дов 39 91823 40 никислотну послідовність, щонайменше, на 80%, що кодує поліпептид, який має амінокислотну пос85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% ідентичну лідовність будь-якого з конструктів, представлених амінокислотній послідовності, представленій в в Табл. 3, з консервативними амінокислотними Табл. 3. Даний винахід також стосується виділеної заміщеннями. нуклеїнової кислоти, яка включає послідовність, 41 91823 42 43 91823 44 45 91823 46 47 91823 48 49 91823 50 51 91823 52 53 91823 54 55 В іншому переважному варіанті здійснення даний винахід стосується виділеного полінуклеотиду, що включає послідовність, яка кодує поліпептид, що має амінокислотну послідовність, показа 91823 56 ну на Фіг.1 або Фіг.2. Даний винахід також стосується виділеної нуклеїнової кислоти, що включає послідовність, щонайменше, на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% ідентичну нуклеоти 57 91823 58 дній послідовності, показаній на Фіг.5 або Фіг.6. В В одному з варіантів здійснення один або деіншому варіанті здійснення даний винахід стосукілька полінуклеотидів, що кодують АВМ за даним ється виділеної нуклеїнової кислоти, що включає винаходом, можуть бути еспресовані під контропослідовність, яка кодує поліпептид, що має амілем конститутивного промотора, або, в альтернаникислотну послідовність, щонайменше, на 80%, тиві, регульованої системи експресії. Придатні 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% ідентичну регульовані системи експресії включають, наприамінокислотній послідовності за Фіг.5 або Фіг.6. клад, тетрациклін-регульовану систему експресії, Даний винахід також стосується виділеної нуклеїекдизон-індуцибельну систему експресії, систему нової кислоти, що включає послідовність, яка коекспресії Lac-Switch, глюкокортикоїд-індуцибельну дує поліпептид, що має амінокислотну послідовсистему експресії, температуро-індуцибельну ність за будь-якою з Фіг.1, Фіг.2, Фіг.5 або Фіг.6 з промоторну систему та металлотіонеїнову металконсервативними амінокислотними заміщеннями. індуцибельну систему експресії. Якщо декілька В іншому варіанті здійснення даний винахід різних нуклеїнових кислот, що кодують АВМ за стосується вектора експресії та/або клітиниданим винаходом, містяться у системі клітинихазяїна, які містять один або більше виділених хазяїна, деякі з них можуть експресуватися під полінуклеотидів за даним винаходом. контролем конститутивного промотора, а інші ексЗагалом, будь-який тип культивованих клітинпресуються під контролем регульованого промоних ліній може бути використаний для експресії тора. Максимальний рівень експресії вважають АВМ за даний винаходом. У переважному варіанті найвищим можливим рівнем стабільної експресії здійснення клітини СНО, клітини BHK, клітини NS0, поліпептиду, що не спричиняє значного шкідливоклітини SP2/0, клітини мієломи ΥΟ, клітини мієлого ефекту на швидкість росту клітини, та визначами миші P3X63, клітини PER, клітини PER.C6 або ють шляхом повторюваного експериментування. клітини гібридоми, інші клітини ссавців, клітини Рівні експресії визначають загальновідомими сподріжджів, клітини комах або клітини рослин викособами, включаючи аналіз методом вестернристовують у якості початкових клітинних ліній для блотінгу з використанням антитіла, специфічного вироблення сконструйованих клітин-хазяїв за дадо АВМ, або антитіла, специфічного до пептидного ним винаходом. тагу, злитого з АВМ; та методом нозерн-блотінгу. Терапевтична ефективність антигенВ альтернативі, полінуклеотид може бути операзв'язуючих молекул за даним винаходом може тивно зчеплений з геном-репортером; рівні ексбути посилена шляхом продукування їх у клітиніпресії химерної АВМ, що має по суті специфічність хазяїні, що додатково екпресує полінуклеотид, зв'язування антитіла миші B-Ly1, визначають виміякий кодує поліпептид, що має активність GnTIII. У рюванням сигналу, співвіднесеного з рівнем експереважному варіанті здійснення поліпептид, що пресії гена-репортера. Ген-репортер може бути має активність GnTIII, є злитим поліпептидом, що транскрибований разом з нуклеїновою кислотою включає домен локалізації Гольджі Гольджі(кислотами), що кодує згаданий злитий поліпепрезидентного поліпептиду. В іншому переважному тид, у вигляді єдиної молекули мРНК; їх відповідні варіанті здійснення експресія АВМ за даним винакодуючи послідовності можуть бути зчеплені або ходом у клітині-хазяїні, що екпресує полінуклеоза допомогою сайта внутрішньої посадки рибосотид, який кодує поліпептид, що має активність ми (IRES) або за допомогою кеп-незалежного енGnTIII, приводить до отримання АВМ з підвищехансера трансляції (СІТЕ). Ген-репортер може ною афінністю зв'язування з Fc-рецепторами та бути трансльований разом із, щонайменше, одніпідвищеною ефекторною функцією. Відповідно, в єю нуклеїновою кислотою, що кодує химерну АВМ, одному з варіантів здійснення даний винахід стояка має по суті специфічність антитіла миші B-Ly1, сується клітини-хазяїна, що включає (а) виділену так що утворюється єдиний поліпептидний ланцюг. нуклеїнову кислоту, яка включає послідовність, що Нуклеїнові кислоти, що кодують АМВ за даним кодує поліпептид, який має активність GnTIII; та (b) винаходом, можуть бути оперативно зчеплені з виділений полінуклеотид, що кодує АВМ за даним геном-репортером під контролем одного промотовинаходом, таку як химерне, приматизоване або ра, так що нуклеїнова кислота, що кодує злитий гуманізоване антитіло, що зв'язується з CD20 люполіпептид, та ген-репортер транскрибуються в дини. У переважному варіанті здійснення поліпепмолекулу РНК, яка в альтернативі може бути тид, що має активність GnTIII, є злитим поліпептисплайсована на дві окремі РНК-посередники дом, який включає каталітичний домен GnTIII, а (мРНК); одна з результуючих мРНК транслюється домен локалізації Гольджі являє собою домен лов згаданий репортерний білок, а інша транслюєтькалізації манозидази II. Способи вироблення таких ся в згаданий злитий поліпептид. злитих поліпептидів та використання їх для виробСпособи, добре відомі фахівцям даної галузі, лення антитіл з підвищеною ефекторною функцією можуть бути використані для конструювання векописані у тимчасовій патентній заявці США № торів експресії, що містять кодуючу послідовність 60/495142, повний вміст якої включений в дану АВМ, яка має по суті зв'язування специфічність заявку у вигляді посилання. В іншому переважнозв'язування антитіла миші B-Ly1, разом з відповідму варіанті здійснення химерна АВМ являє собою ними сигналами контролю транскрипції/трансляції. химерне антитіло або фрагмент антитіла, що має Ці способи включають in vitro технології рекомбізв'язуючу специфічність антитіла миші B-Ly1. В нантних ДНК, синтетичні технології та in vivo рекоособливо переважному варіанті здійснення химермбінацію/генетичну рекомбінацію. Див., наприклад, не антитіло містить Fc людини. В іншому переважтехнології, описані у Maniatis et al., MOLECULAR ному варіанті здійснення антитіло є приматизоваCLONING A LABORATORY MANUAL, Cold Spring ним або гуманізованим. Harbor Laboratory, N.Y. (1989) та Ausubel et al., 59 91823 60 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR нсформовані відповідними кодуючими нуклеїноBIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley вими кислотами, які контролюються відповідними Interscience, N.Y. (1989). елементами контролю експресії (наприклад, проРізноманітні системи експресії "хазяїн-вектор" мотором, енхансером, послідовностями, термінаможуть бути використані для експресії кодуючої торами транскріпції, сайтами поліаденілювання послідовності АВМ за даним винаходом. Переважтощо), та маркером, що селектується. Після ввено, клітини ссавців використовують у якості систем дення чужорідної ДНК сконструйовані клітини моклітин-хазяїв, трансфектованих векторами експрежуть бути залишені на 1-2 дні для росту у збагачесії рекомбінантних плазмідних ДНК або космідних ному середовищі, а тоді перенесені у селекційне ДНК, що містять кодуючу послідовність білка, яка середовище. Маркер, що селектується, у рекомбіпредставляє інтерес, та кодуючу послідовність нантній плазміді надає резистентності до селекції злитого поліпептиду. Найбільш переважно, у якоста забезпечує можливість селекції клітин, що статі системи клітини-хазяїна використовують клітини більно інтегрували плазміду в свої хромосоми та СНО, клітини BHK, клітини NS0, клітини SP2/0, ростуть з утворенням фокусів, які, у свою чергу, клітини мієломи YO, клітини мієломи миші P3X63, можуть бути клоновані та розширені у клітинні ліклітини PER, клітини PER.C6 або клітини гібридонії. ми, інші клітини ссавців, клітини дріжджів, клітини Можуть бути застосовані різні системи селеккомах або клітини рослин. Деякі приклади систем ції, включаючи, наприклад, гени тимідин-кінази експресії та способи селекції описані у наступних (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), гіпоксантинджерелах та посиланнях, вказаних там: Borth et al., гуанінфосфорибозилтрансферази (Szybalska & Biotechnol. Bioen. 71(4):266-73 (2000-2001), у Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 Werner et al., Arzneimittelforschung/Drug Res. (1962)) та аденін-фосфорибозилтрансферази 48(8):870-80(1998), у Andersen та Krammen, Curr. (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)) вірусу простого Op. Biotechnol. 13:117-123 (2002), у Chadd та герпесу, що можуть бути застосовані у клітинах tk , Chamow, Curr. Op. Biotechnol. 12:188-194 (2001), та hgprt або aprt , відповідно. Крім того, резистенту Giddings, Curr. Op. Biotechnol. 12: 450-454 (2001). ність до антиметаболітів може бути використана В альтернативних варіантах здійснення можуть як основа для селекції на гени dhfr, що надає ребути застосовані інші системи еукаріотичних клізистентності до метотрексату (Wigler et al., Natl тин-хазяїв, включаючи клітини дріжджів, трансфоAcad. Sci. USA 77:3567 (1989); O'Hare et al., Proc. рмовані векторами експресії рекомбінантних дріжNatl Acad. Sci. USA 78:1521 (1981)); gpt, що надає джів, що містять кодучу послідовність ABM за резистентності до мікофенолокислоти (Mulligan & даним винаходом; системи клітин комах, інфіковаBerg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); ні векторами експресії рекомбінантних вірусів (наneo, що надає резистентності до аміноглікозиду Gприклад, бакуловірусу), що містять кодучу послі418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol 150:1 довність химерної АВМ, що має по суті (1981)); та hygro, що надає резистентності до гідспецифічність зв'язування антитіла миші B-Ly1; роміцину (Santerre et al., Gene 30:141 (1984)). Несистеми клітин рослин, інфіковані векторами ексщодавно були описані додаткові гени, що селекпресії рекомбінантних вірусів (наприклад, мозаїчтуються, зокрема trpB, що дає клітинам ного вірусу кольорової капусти, CaMV; мозаїчного можливість використовувати індол замість трипвірусу тютюну, TMV) або трансформовані вектотофану; hisD, що дає клітинам можливість викорирами експресії рекомбінантних плазмід (напристовувати гістинол замість гістидину (Hartman & клад, плазміди Ті), що містять кодучу послідовMulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55:8047 (1988)); ність АВМ за даним винаходом; або системи система глутамін-синтази; та ODC (орнітинтваринних клітин, інфіковані векторами експресії декарбиксилаза), що надає резистентності до інгірекомбінантних вірусів (наприклад, аденовірусу, бітора орнітин-декарбиксилази, 2-(дифторметил)вірусу коров'ячої віспи), включаючи клітинні лінії, DL-орнітин, DFMO (McConlogue, in: Current сконструйовані таким чином, щоб містити багато Communications in Molecular Biology, Cold Spring копій ДНК, що кодує химерну АВМ, яка має по суті Harbor Laboratory ed. (1987)). специфічність зв'язування антитіла миші B-Ly1, Даний винахід також стосується способу моабо стабільно ампліфікованої (CHO/dhfr), або недифікації профілю глікозилювання АВМ за даним стабільно ампліфікованої у подвійних малих хровинаходом, що продукується клітиною-хазяїном, мосомах (наприклад, мишачих клітинних лініях). В який включає експресію в згаданій клітині-хазяїні одному з варіантів здійснення, вектор, що включає нуклеїнової кислоти, що кодує АВМ за даним виполінуклеотид(и), який кодує АВМ за даним винанаходом, та нуклеїнової кислоти, що кодує поліпеходом, є поліцитронним. Крім того, в одному з ваптид з активністю GnTIII, або вектора, який вклюріантів здійснення АВМ, описана вище, являє сочає такі нуклеїнові кислоти. Переважно, бою антитіло або фрагмент антитіла. У модифікований поліпептид являє собою IgG або переважному варіанті здійснення АВМ являє софрагмент антитіла, що включає Fc-область. В бою гуманізоване антитіло. особливо переважному варіанті здійснення даного Для способів за даним винаходом стабільна винаходу АВМ являє собою гуманізоване антитіло експресія є загалом переважною над перехідною або фрагмент антитіла. експресією, оскільки звичайно вона забезпечує Модифікована ABM, що продукується клітибільш відтворювані результати та є більш придатною-хазяїном за даним винаходом, в результаті ною для крупномасштабного виробництва. Замість модифікації показує підвищену афінність зв'язувикористання векторів експресії, що містять вірусні вання з Fc-рецептором та/або підвищену ефектоджерела реплікації, клітини-хазяї можуть бути трарну функцію. В особливо переважному варіанті