Спосіб одержання ліпідів

Реферат: Винахід належить до способу одержання ліпіду або суміші ліпідів з вихідного органічного матеріалу, який містить полісахарид, вибраного з групи, що включає целюлозу, геміцелюлозу, крохмаль, усі ці речовини разом, будь-яку суміш цих речовин або вуглеводних продуктів їх розкладу, або некрохмальний полісахарид і передбачає: a) по-перше, обробляють вихідний матеріал речовиною, вибраною з групи, яка включає: і) воду, іі) кислоту та ііі) луг, b) після чого розділяють осад та фільтрат, а осад, одержаний від такої обробки, піддають механічному або термомеханічному подрібненню як такий або у присутності води, кислоти або лугу, розділяють одержані таким чином осад та фільтрат, або ж піддають одержаний таким чином осад ще одному або кільком оброблянням згідно з будь-яким з етапів і), іі) або ііі), та/або подрібнюванню і UA 101637 C2 (12) UA 101637 C2 с) вводять мікроорганізм, що продукує ліпід, у контакт з одержаним таким чином фільтратом, або з кількома одержаними фільтратами, або осадами, або будь-якою одержаною з них комбінацією та, за бажанням, і з вихідним матеріалом, у культуральному середовищі, завдяки чому клітини мікроорганізму починають виробляти ліпід, і d) виділяють ліпіди. UA 101637 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід стосується способу одержання ліпіду або суміші ліпідів з органічної сировини згідно з обмежувальною частиною п. 1 формули. Винахід також стосується застосування ліпіду або суміші ліпідів, одержаних цим способом, як біопалива згідно з п. 17, а також біопалива за п. 18. Крім того, винахід стосується способу очистки міських стічних вод згідно з п. 19. Передумови створення винаходу Відомо, що застосування транспортних палив, вироблених з викопної сировини, набуло велетенських масштабів і що споживання продовжує зростати. Через те адекватність, вплив на довкілля та аспект тривалого розвитку, що стосується викопних енергоресурсів, цілком зрозуміло перетворилися на суттєві глобальні виклики. Це спричинює зростаючий інтерес до відновлюваних альтернативних джерел сировини для транспортних палив. Кроком у напрямку виробництва палив з відновлюваних природних ресурсів стала спроба принаймні частково замінити викопну сировину органічною. Навіть при такому підході виникають проблеми, які важко розв'язати. При сучасних розмірах споживання викопних палив навіть часткова їх заміна потребуватиме неосяжних обсягів органічної сировини. Вже неодноразово зазначалося, що однобічне широкомасштабне споживання органічних ресурсів або відведення для цієї цілі величезних масивів ораної землі має шкідливі наслідки для природної біорозмаїтості та для балансу виробництва продовольства, й ця обставина важко піддається вирішенню. Перетворення органічних матеріалів у форму, придатну для одержання палива, дуже енергомістке й утруднене з точки зору технології. Особливо придатним для вироблення транспортних палив може бути органічний жир, наприклад, триацилгліцерин, який містить набагато більше енергії, ніж відповідні вуглеводи або спирти. Більш того, він є добре відомий і може перетворюватися на компоненти палива, наприклад, дизельне паливо, біодизель або відновлюване дизельного палива, шляхом відносно ефективних хімічних реакцій. Однак обмежуючим фактором є мізерність запасів природної жирової сировини. З існуючих ресурсів можна виробити хіба що малу частку потрібного біопалива. Отже, для збільшення ресурсів жирів треба різко розширити посіви жироносних рослин. Така величезна зміна структури посівів на користь олійних рослин, у свою чергу, сильно відіб'ється на світовому ринку продовольства. Ця потреба, поки що на рівні намірів вже проявляється у різкому зростанні цін на харчові продукти та корми. Сумарні ресурси природних відновлюваних органічних мас є досить значні – у перерахунку на вміст вуглецю вони значно перевищують світове споживання мінеральних транспортних палив. Втім, основна частка цих відновлюваних мас, близько 60 %, складається з речовин, які містять велику кількість кисню, а тому їх паливна цінність надто низька. Відомі технології показують, що перетворення відносно низькоенергетичних вуглеводів на більш ефективні сполуки, що містять більше відновлених вуглеводних ланцюгів, як у теорії, так і у відомих практичних застосуваннях, як от газифікація, вимагає надто багато енергії (R. Agrawal, N. R. Singh, F. H. Ribeiro and W. N. Delgass 2007. "Sustainable fuel for the transportation sector", PNAS 104: 4828-4833, та WO 2006/117317), отже, вихід цільових сполук залишається низьким. Подібна проблема має місце у відомих біотехнологічних процесах перетворення гексозного цукру, що містяться у вуглеводах, на високоенергетичні сполуки. Прикладом є виробництво спиртів, зокрема, етанолу, описане, серед інших, у публікаціях US 2002/0185447, US 5637502 та WO 03/038067. У заявці US 2004/0231661 описується обробляння матеріалу, який містить лігноцелюлозу, шляхом водно-кислотної екстракції та гідролізу з одержанням ксилози та глюкози, які можуть використовуватися для виробництва етанолу. У патенті US 5,221,357 йдеться про обробляння матеріалу, який містить геміцелюлозу та целюлозу, кислотним гідролізом, а тверду фазу піддають механічному оброблянню та кислотному гідролізу з одержанням моносахаридів, а саме пентозних та гексозних цукрів, які йдуть на виробництво етанолу. У патенті США описується обробляння лушпинок насіння кукурудзи для відокремлення моносахаридів шляхом кислотного та/або лужного й ферментативного гідролізу. У деяких патентах пропонується одержання ліпідів з різних органічних матеріалів за допомогою мікробної ферментації. Згідно з US 4,368,056 вуглеводи, які присутні у невеличкій кількості у промислових стоках, застосовують при ферментації бутанолу, а мікробні гліцериди, що утворюються при ферментації, спрямовують у виробництво біодизелю. У роботі Дай та ін. (Dai, C. Tao, J., Xie, F., Dai, Y. and Zhao, M. Biodiesel generation from oleagenous yeast Rhodotorula glutinis with xylose assimiating capacity. Afr. J. Biotechnol. Vol 6 (18), pp. 2130-2134, 19 September 2007) йдеться про екстракцію вуглеводів з відходів різних рослин (кукурудзяні стеблі, листя дерев, рисова солома) шляхом подрібнення та обробляння кислотою, а одержані при цьому фільтрати та промивні води слугують сировиною для вироблення ліпідів за допомогою дріжджів Rhodotorula. Одержаний таким чином ліпід йде на виробництво біодизелю. Ангербауер 1 UA 101637 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 та ін. (Angerbauser, C., Sierbenhofer, M. Mittelbach, M. and Guebtz, G.M. Conversion of sludge into lipids by Lipomyces starkeyi for biodiesel production. Bioresource Technology 99(2008) 3051-3056), у свою чергу, описують обробляння шламу стічних вод лугом та кислотою, його застосування у виробленні ліпіду за допомогою дріжджів Lipomyces з наступним перероблянням на біодизель. До низки проблем, з якими стикаються у вищенаведених способах, належить та обставина, що вихід цукрів, які можуть бути перероблені мікроорганізмами, лишається низьким, а наявність біоматеріалів, що слугують сировиною у цих способах, не є достатньою для великомасштабного виробництва. Очевидно, ані ці способи, ані їх сировинна база не придатні для серйозного виробництва біопалива. Отже, існує нагальна потреба у нових технологічних вирішеннях, зокрема, великомасштабних, які дозволили б переробляти глобальні ресурси відновлюваних органічних вуглеводів на речовини з підвищеним вмістом енергії, незалежно від їх хімічного та структурного складу. Особливий наголос робиться на те, як ефективно перетворювати вуглеводи, що містяться у різних органічних матеріалах, на сполуки з підвищеним вмістом енергії, більш придатні для використання у транспортних паливах. Сутність винаходу Метою цього винаходу є знаходження нового вирішення завдання перетворення органічних біоматеріалів на сполуки з підвищеним вмістом енергії. Зокрема, метою цього винаходу є знаходження вирішення проблеми перетворення вуглеводних компонентів органічних біоматеріалів на ліпід, придатний для виробництва біодизелю. Точніше, спосіб згідно з винаходом відрізняється змістом відмітної частини п. 1 формули. Застосування згідно з винаходом, у свою чергу, відрізняється змістом п. 17, а біопаливо – змістом п. 18. Спосіб очистки міських стічних вод згідно з винаходом відрізняється змістом п. 19. Цей винахід оснований на спостереженні, що при оброблянні біомаси різними способами для одержання фракцій целюлози та геміцелюлози популяції мікроорганізмів поширюються у цих фракціях усе частіше по мірі їх розкладу. Несподівано було встановлено, що у зазначених вуглеводних фракціях ростуть також мікроорганізми, що містять фермент АТФ-цитратліазу (EC 2.3.3.8, раніше EC 4.1.3.8), через яку організми збирають ліпіди, зокрема, триацилгліцерин, до своїх клітин. Виходячи з цього, винахід передбачає відокремлення целюлози та геміцелюлози від решти компонентів біоматеріалу з наступним гідролізом, причому продукти гідролізу є придатні для вирощування мікроорганізмів, які збирають ліпіди, а утворений таким чином ліпід слугує сировиною для виробництва біодизелю. Згідно з описом винаходу, вуглеводи, придатні для споживання синтезуючими ліпід мікроорганізмами, можна одержувати з органічної сировини з різних джерел, та/або можна одержувати вуглеводні фракції, з яких мікроорганізми синтезуватимуть ліпіди. Згідно з винаходом, такі матеріали можна одержувати, зокрема, з біоматеріалів, які містять геміцелюлозу, целюлозу, крохмаль або некрохмальні полісахариди. До вуглеводів, придатних для використання мікроорганізмами, належать, зокрема, моно- та олігосахариди, що містять як гексози, так і пентози. Вуглеводи також можуть бути у полімерній формі, якщо обрані такі синтезуючі ліпід мікроорганізми, що здатні переробляти полімерні вуглеводи. Деревина у різних формах на даний час становить найбільший ресурс відновлюваної біомаси, що її можна виділяти. Дерево використовується у величезних обсягах, зокрема, шляхом механічного або термомеханічного обробляння або інших процесів, як виготовлення деревинної маси, причому у цих процесах утворюється безліч дрібних потоків, які містять вуглеводи. Такі бічні відгалуження деревообробної промисловості створюють дуже мало доданої вартості, а у багатьох випадках лягають тягарем на собівартість продукції, бо становлять навантаження на довкілля, яке доводиться усувати. З точки зору технології такі бічні потоки є чималою проблемою. Вони займають великі обсяги, але мають, як правило, низький вміст вуглеводів. Будучи розбавленими водними розчинами вуглеводів, вони навряд чи придатні для процесів, де намагаються утилізувати вуглеводи з розчинів хімічними методами. Відповідно мета цього винаходу також полягає у знаходженні вирішення проблеми, як утилізувати великомасштабні бічні потоки деревообробки, які містять біоматеріал, котрий зараз потребує дорогих прийомів очистки або за відомих технологій лишається взагалі невикористаним, становлячи при цьому величезне потенційне джерело енергії. У способі згідно з винаходом оброблянню піддають вихідний органічний матеріал, який містить целюлозу, геміцелюлозу, крохмаль, усі ці речовини, різні суміші цих речовин або продуктів їх розкладу, або, можливо, крохмаль або некрохмальні вуглеводи як такі або пов'язані з целюлозними чи геміцелюлозними матеріалами. Вихідний матеріал можна піддавати 2 UA 101637 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 попередній механічній, термомеханічній, фізичній, хімічному, біологічному оброблянню або комбінації таких оброблянь, або ж можна використовувати його у незмінному вигляді. Якщо матеріал містить вуглеводи у полімерній формі, його бажано обробляти водою, або кислотою, або лугом, або їх комбінацією. Після такого попереднього обробляння згідно з винаходом суміш розділяють на фільтрат та тверду фазу, або осад (фіг.1) й виділяють фільтрат або обидві фракції. Доцільно проводити повторне обробляння вихідного матеріалу водою, кислотою або лугом, та змішувати фільтрати між собою після відокремлення осаду. Фільтрат, одержаний при лужному оброблянні, як такий або після повторного переробляння, як описано вище, у кращому варіанті подають до суміші, де проводять кислотне обробляння вихідного матеріалу з метою збільшення виходу розчинного моносахариду. Будь-який з фільтратів чи осадів, одержаних при таких обробляннях, або комбінації вихідного матеріалу з фільтратами чи осадами, або комбінації фільтратів та осадів використовують для одержання одноклітинного ліпіду після можливого попереднього обробляння, наприклад, нейтралізації, знебарвлювання та фільтрації. Фільтрати також можна змішувати, розбавляти або концентрувати для досягнення бажаного вмісту моносахариду та поживного середовища для мікроорганізмів, які виробляють одноклітинний ліпід. При кожному оброблянні вихідного матеріалу утворюється осад змінної композиції у залежності від того, у якому середовищі проводять обробляння - водному, кислотному або лужному. Для збільшення виходу цукру осади краще піддати механічному подрібненню, сухому або у присутності води, кислоти або лугу, знову одержуючи фільтрат та осад. З фільтрату, або осаду, або з якоїсь їх суміші виробляють одноклітинний ліпід, або за бажанням обробляють осад, краще міцною кислотою. При кислотному оброблянні знову утворюються фільтрат та осад, причому фільтрат, або осад, або їх суміш можна подавати на вироблення одноклітинного ліпіду. Осад можна обробляти кислотою ще більшої концентрації з одночасним подрібненням. Утворені внаслідок такого обробляння фільтрат, або осад, або їх комбінацію використовують для одержання одноклітинного ліпіду. Осад можна також видаляти й спалювати або використовувати у виробництві біопалива чи його прекурсора іншими способами. Будь-яку фракцію фільтрату, або осаду, або вихідного матеріалу можна використовувати як таку або у різних сполученнях при одержанні одноклітинного ліпіду. Осади, одержані на вищеописаних етапах процесу, можна знову піддавати оброблянню прийомами, які описані тут вище або далі. Для підвищення виходу цукру бажано обробляти осад кислотою або лугом більшої концентрації, ніж на попередніх етапах. Далі, між різними етапами процесу можна здійснювати ферментні обробляння або мікробні ферментації. Винахід також стосується способу, у якому використані кислоти та луги повертають до процесу. Також винахід стосується способу, у якому відновлюють одноклітинну біомасу як цільовий матеріал за винаходом, з виділенням вироблених ліпідів. З осадів різних етапів способу можна одержувати товарні компоненти. Фільтрати, у свою чергу, можна використовувати в інших мікробних процесах, крім вироблення ліпіду. Спосіб згідно з винаходом вирішує проблему, як поступово перетворювати моносахариди гексози та пентози, що містяться у вуглеводах біомаси, на менші фракції, які містять більшу кількість мономерних цукрів, що їх мікроорганізми здатні більш ефективно використовувати для вироблення ліпіду. На будь-якому етапі процесу, де нерозчинну речовину відокремлюють від розчинної, утворюючи осад та фільтрат, цукри - гексози та пентози, що містяться у фільтраті, можуть слугувати для вироблення одноклітинного ліпіду як такі або після відповідного обробляння, як суміші фільтратів. Крім того, фільтрати, а також осади або сполучення осадів та фільтратів, можуть бути сировиною для вироблення одноклітинного ліпіду. Корінна перевага винаходу полягає в тому, що він дозволяє використовувати прості процеси та операції, широко застосовані у промисловості, забезпечуючи енергозбереження та екологічну чистоту, для одержання енергомісткої хімічної речовини – ліпіду, із бідних на енергію сполук біологічного походження, наприклад, моносахаридів - гексоз та пентоз - або їх олігомерів, а також їх сумішей. У способі згідно з винаходом особливо важливим є те, що завдяки механічному або термомеханічному подрібненню завжди розкривається нова поверхня органічного матеріалу, завдяки чому його можна піддавати повторному оброблянню водою, кислотою або лугом з іншою концентрацією, й забезпечується такий розподіл осаду та розчину, з якого можна вилучити, зокрема з розчину, значно більше цукрів, придатних для одержання ліпіду за допомогою мікробів. Після багатьох розділень розчину та осаду значно підвищується вихід цукрів - гексоз та 3 UA 101637 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пентоз - для механічного або термомеханічного подрібнення у порівнянні з однофазним гідролізом. У способі згідно з винаходом при об'єднанні фільтратів, одержаних кислотним та лужним оброблянням, або при об'єднанні фільтратів з осадами потоки, утворені під час різних оброблянь, нейтралізують один одного. Таким чином, фільтрати, осади або їх сполучення можуть використовуватися як такі, без коригування кислотності, або принаймні зменшується потреба у такому коригуванні. Можливість сполучати кілька різних біомас або біомаси з різних джерел між собою також є перевагою. Треба особливо відзначити на користь гнучкості способу те, що одержані цукри, з яких виробляється ліпід, придатні повністю або частково для мікробіологічного одержання інших сполук, наприклад, спиртів. Ще більшою перевагою винаходу є те, що на додаток до утилізації основних або бічних потоків механічного або термомеханічного обробляння деревини, він придатний для утилізації інших біоматеріалів, з яких вилучаються вуглеводи, у виробництві ліпідів. Далі винахід стосується способу утворення ліпіду або суміші ліпідів із суміші, яка, згідно із способом, утворена шляхом повторного обробляння волокнистої маси, створеної під час термомеханічного, кислотного або лужного обробляння. До інших видів органічної сировини, що важко піддаються промисловому оброблянню й можуть згідно з винаходом перероблятися на гексози й пентози або олігомери, утворені ними, для мікробіологічного одержання ліпідів, належать, наприклад, вторинне волокно, одержане, наприклад, з макулатури з газетного паперу, бурякова м'якоть цукрового виробництва, полова та солома від збіжжя, наприклад, вівса, та інші подібні відходи рослинництва, тирса, очищена деревна маса, солома та торф, зокрема, злегка розкладений торф. Також органічними матеріалами, що досі не піддавалися утилізації, можуть бути болотна або підводна біомаса, біомаса з водозбірників целюлозних виробництв, активний мул муніципальних очисних споруд та інші органічні побутові відходи, що йдуть на звалища або спалюються. Ці органічні матеріали можна обробляти, чергуючи різні варіанти способу таким чином, що вуглеводи, які містяться у цих матеріалах, стають придатними для перероблення мікроорганізмами на одноклітинну біомасу та ліпід. Наприклад, побутові стоки можна переробляти запропонованим способом, причому перевагою у цьому випадку буде знищення шкідливих мікробів у ході обробляння. Суттєве значення у винаході має та обставина, що біоматеріал, який містить вуглеводи, незалежно від походження, обробляють так, що утворюються мономерні цукри - гексози та/або пентози - або їх олігомери. У кращому випадку об'єднують два або більше оброблянь. Оскільки спосіб згідно з винаходом призначений для великомасштабного виробництва біопалива, сировиною для нього можуть одночасно слугувати кілька різних джерел біомаси, з яких утворюється клітинна маса мікроорганізмів, що виробляють ліпід. Компоненти, придатні для вироблення ліпіду мікроорганізмами, можна одержувати незалежно від складу, кількості та структури біомаси. Значною перевагою цього винаходу є те, що цукри одержуються з високим виходом і витрати хімікатів, необхідних для коригування кислотності, можна скоротити. У порівнянні з існуючим рівнем техніки цей винахід становить проривну технологію, бо сполучує перетворення матеріалів, які містять целюлозу та геміцелюлозу, на корисні цукри гексози та пентози. При цьому винахід дозволяє також утилізувати моносахариди, що містяться у крохмальних та некрохмальних полісахаридах цих біоматеріалів, у корисні цукри для одержання одноклітинних ліпідів. Промислове втілення винаходу підкреслюється тим, що він дозволяє використовувати як матеріали з відновлюваних природних джерел, так і бічні потоки, що виникають у промисловості або у побуті. Спосіб згідно з винаходом може використовуватися регульованим чином для обробляння матеріалів, що містять целюлозу та геміцелюлозу, утворюючи з них прекурсори одноклітинних ліпідів, з яких безпечні мікроорганізми можуть виробляти одноклітинні ліпіди. Далі винахід описується більш детально за допомогою доданих креслень та докладного опису. Короткий опис креслень Фіг. 1 зображує основні етапи здійснення способу згідно з винаходом. Фіг. 2 показує використання цукрів - гексоз та пентоз - як таких або у сполученнях для вироблення клітинної маси та ліпіду. На фіг. 3 показане зростання дріжджів та вироблення ліпіду у культуральному середовищі, до якого додають суміш як джерело вуглецю для одержання ліпіду, причому суміш утворюють з полови лужним оброблянням та гідролізом одержаного фільтрату 10 % кислотою. На фіг. 4 показане зростання дріжджів у культуральному середовищі, до якого додають пентозу промислового виробництва як джерело вуглецю. 4 UA 101637 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Докладний опис винаходу "Вуглеводи" – це органічні молекули, зокрема, альдегід, кислотна або кето група з доданням кількох гідроксильних груп. До вуглеводів також належать сполуки, які описуються термінами моносахарид, олігосахарид, полісахариди, цукор, целюлоза, геміцелюлоза, крохмаль та некрохмальні вуглеводи. "Целюлоза" – полісахарид з довгим ланцюгом, первісна структура якого складається з полімеру, утвореного β-1-4-зв'язками глюкози. "Крохмаль" - полісахарид з довгим ланцюгом, що складається головним ином з α-1-4 та α-16 глюкозних одиниць. "Використовувані цукри" – такі, у котрих мікроорганізми здатні розмножуватися, і з яких мікроорганізми можуть виробляти ліпід або спирти. "Геміцелюлоза" – група сполук, що складається з кількох різних гексоз та пентоз, як от галактоза, маноза, глюкоза, ксилоза та арабіноза. "Моносахарид" – мономерна одиниця вуглеводів (C-H2O)n, яка звичайно містить 3-9 атомів вуглецю й має стереохімічні розбіжності в одному або кількох атомах вуглецю. До них належать такі гексози, як глюкоза, галактоза, маноза, фруктоза з 6 атомами вуглецю, й такі пентози, як ксилоза, рибоза та арабіноза з 5 атомами вуглецю. "Олігосахарид" – вуглеводень, утворений двома або більше моносахаридами за допомогою О-глікозидних зв'язків. "Пентоза" – моносахарид з п'ятьма атомами вуглецю. "Гексоза" – моносахарид з шістьма атомами вуглецю. "Гідроліз" – руйнування вуглець-вуглецевих, вуглець-кисневих, вуглець-азотних або вуглецьсірчаних зв'язків під дією води, кислоти або лугу, незалежно від участі води у реакції. При ферментному гідролізі відповідні реакції каталізуються ферментами. Наприклад, гідролізом є реакція, у якій руйнується О-глікозидний зв'язок між моносахаридами вуглеводів або пептидний зв'язок між амінокислотами білків. "Обробляння водою – кислотою або лугом" у даному контексті означає, що органічний матеріал або похідний від нього продукт екстрагують, піддають механічному або термомеханічному оброблянню або комбінації таких оброблянь у присутності води, кислоти або лугу. Кислота – це хімічна речовина, молекула або іон, здатна віддавати іон водню (протон), а луг – це речовина, молекула або іон, здатна приймати іон водню (протон), згідно з кислотноосновною теорією Бренстеда-Лоурі. (Brønsted-Lowry) До кислот належить також так звана кислота Льюіса (Lewis), здатна приймати пару електронів, а луг Льюїса здатен віддавати пару електронів. За визначенням, активність речовин у ролі кислот або лугів не обмежується водними розчинами. У цьому описі терміни „кислота" та "луг", за визначенням, також стосуються кислотних та лужних каталізаторів. У даному контексті кислотою також є будь-яка кисла фаза, здатна діяти як кислота у газоподібному, рідкому або твердому стані. Відповідно луг – це будьяка лужна фаза, здатна діяти як луг у газоподібному, рідкому або твердому стані, наприклад, водний розчин. "Вихідний органічний матеріал" у цьому описі – будь-яка органічна матерія, створена живим організмом. Вихідний органічний матеріал також називається біоматеріалом. Зокрема, вихідний органічний матеріал містить полісахарид. "Полісахарид" – це вуглеводний полімер, утворений з моносахаридів, який може також містити й інші сполуки. До полісахаридів належать, зокрема, целюлоза, геміцелюлоза та крохмаль, а також, наприклад, альгінати, глюкан, інулін та гуміарабік. З інших полісахаридів можна ще навести манан. Вихідний матеріал може містити полісахариди як такі або у суміші, або ж продукти їх розкладу. "Некрахмальний полісахарид" – вуглеводень, у молекулярній структурі якого відсутні або рідко зустрічаються характерні для крохмалю α-1-4 зв'язки. Це, наприклад, глюкан, альгінат, інулін та гуміарабік. Також до некрахмальних полісахаридів належать геміцелюлоза та целюлоза, а ще, наприклад, вуглеводні полімери, присутні у водоростях. "Культурна рослина" – рослина, посаджена або посіяна з навмисною метою у спеціально підготований грунт. Термін "ліпід" стосується жирної речовини, до складу молекули якої входить аліфатичний вуглеводний ланцюг, яка розчиняється в органічних розчинниках, але погано у воді. У цьому винаході ліпідами, які утворюються в мікроорганізмах, головним чином є три-, диабо моноацилгліцерини, або стерол-ефіри, але у клітинах можуть утворюватися також інші ліпіди, а саме фосфоліпіди, вільні жирні кислоти, стероли, поліпреноли, сфінголіпіди, гліколіпіди та дифосфатиділгліцерин. Цей винахід може знайти застосування у виробництві біодизелю або відновлюваного дизельного палива. 5 UA 101637 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Згідно з директивою ЄС 2003/30/EY, "біодизель" – це метилефір, одержаний з рослинної або тваринної олії, який відповідає за якістю дизельному паливу та може використовуватися як біопаливо. Відновлюване дизельне паливо – це гідрогенізований ліпід тваринного, рослинного або мікробного походження, причому мікробний ліпід може вироблятися бактеріями, дріжджами, пліснявами, водоростями або іншими мікроорганізмами. Вихідним матеріалом у способі за винаходом можуть бути целюлоза, геміцелюлоза та біомаса, головним чином деревна маса, можливо з вмістом в'яжучих, одержана механічними, термомеханічними та іншими фізичними методами або хімічними, ферментними та мікробіологічними методами, або об'єднаннями цих методів. Також матеріалами при здійсненні способу без будь-яких змін можуть бути рослинні матеріали, що містять крохмаль, наприклад, картопля, їх частини, насіння культурних рослин, кукурудзи та рису відповідно, цукрові буряки та бурякова м'якоть із вмістом некрохмальних полісахаридів. Придатні також є частини рослин, які містять некрохмальні полісахариди, як β-глюкан. Спосіб також передбачає використання в якості вихідних матеріалів вуглеводів, наприклад, альгінату, що походять з одноклітинних організмів. До складу зазначених вихідних матеріалів можуть також входити у різних кількостях білок та ліпід, які також можуть бути вихідними матеріалами для зростання мікроорганізмів, що синтезують ліпід, та вироблення ліпіду. Вихідним матеріалом у способі згідно з винаходом може бути, наприклад, вторинна волокниста маса, одержана з газетної макулатури, бурякова м'якоть та полова збіжжя, наприклад, вівса, тирса, очищена деревна маса, торф та солома. До інших вихідних матеріалів, придатних для способу за винаходом, належать наприклад, мікробна маса, як от одноклітинна біомаса, болотна або підводна біомаса, у тому числі водорості та мікроводорості, біомаса з водозбірників целюлозних виробництв, активний мул муніципальних очисних споруд та інші органічні побутові відходи, що містять біологічний компонент і зараз спалюються, компостуються або переробляються іншим чином так, що вуглець, який міститься у відходах, виділяється в атмосферу у вигляді двоокису вуглецю. Спосіб згідно з кращим варіантом здійснення винаходу містить принаймні один етап, на якому фільтрат або комбінацію фільтратів, осад або комбінацію осадів, одержаних з органічного матеріалу відповідно до способу, сам органічний матеріал або будь-яку комбінацію з перелічених матеріалів подають до суміші, у якій відбувається вироблення ліпіду. Можна обирати інші варіанти здійснення способу у залежності від того, який вміст моносахаридів переважає у фільтраті чи комбінації фільтратів, або в осаді, комбінації осадів, або у комбінації фільтратів чи осадів для вирощування мікроорганізму та вироблення ліпіду. Так, фільтрати або осади обирають з-поміж одержаних оброблянням біоматеріалів речовиною, у кращому випадку обраною з групи, що включає: i) воду, ii) кислоту та iii) лугу з наступним розділенням осаду, що містить волокна, та фільтрату без вмісту волокон. За бажанням осад один або кілька разів піддають оброблянню будь-яким з реагентів (i), (ii) або (iii), а одержаний осад у кращому варіанті піддають механічному або термомеханічному подрібненню й розділяють осад та фільтрат. У залежності від застосованого біоматеріалу та бажаного моносахариду біоматеріал обробляють водою, кислотою або лугом, краще кислотою або лугом, як правило, водним розчином кислоти або лугу. За потреби таке обробляння можна повторювати кілька разів. Один і той самий біоматеріал можна послідовно обробляти кількома різними розчинами, додаючи до води сполуки, що сприяють розділенню та гідролізу вуглеводів. Вихідні матеріали, що входять до групи І у доданому переліку, можна на першому етапі обробляти водою або, якщо бажано підсилити дієвість обробляння, сумішшю води з кислотою. Біоматеріали групи ІІ на першому етапі краще обробляти кислотою. Біоматеріали групи ІІІ на першому етапі краще обробляти лугом. Після розділення фільтрату та осаду останній можна повторно обробити кислотою. Група I Біоматеріали, що походять з механічного, термомеханічного, ферментного або мікробіологічного обробляння деревини або комбінації цих оброблянь, або з культурних рослин. Група II Вторинна волокниста маса, бурякова м'якоть, полова, солома, висівки, зернові гранули, цілі культурні рослини, термомеханічна целюлоза, деревно-волокниста маса середньої щільності або вихідний матеріал, що містить крохмаль або некрохмальні полісахариди. 6 UA 101637 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Група III Тирса, очищена деревна маса, полова, солома та деревоподібні частини рослин, термомеханічна целюлоза, деревно-волокниста маса середньої щільності, бурякова м'якоть, культурні рослини, які містять крохмаль у різних кількостях. Обробляння можна підсилити, додаючи, наприклад, один або кілька ферментів до діючого розчину, краще розчину на водній основі. Між різними етапами процесу можна також проводити ферментні обробляння або мікробні ферментації. На наступному етапі мікроорганізм, що продукує ліпід, вводять до контакту з будь-яким фільтратом, або осадом, або їх комбінацією у культуральному середовищі, дають клітинам мікроорганізму виробляти ліпід та виділяють ліпід. Осад з вмістом волокон, одержаний на вищеописаних етапах обробляння біоматеріалу, краще піддавати механічному подрібненню й розділяти осад з вмістом волокон та фільтрат, який їх не містить. Крім того, осад з вмістом волокон після механічного подрібнення можна обробляти міцною кислотою, а потім розділяти осад з вмістом волокон та фільтрат, який їх не містить. Також можна після кислотного обробляння повертати осад на механічне подрібнення або, як зазначалося вище, використовувати його у мікробному виробленні ліпіду. Крім того, біоматеріал можна підкислювати та піддавати механічному чи термомеханічному подрібненню, розділяючи осад з вмістом волокон та фільтрат, який їх не містить. Фільтрат, або осад, або їх комбінацію, одержані на будь-якому з вищеописаних етапів, можна додавати до культурального середовища мікроорганізмів, які виробляють ліпід. Як правило, сумарний вміст цукрів у фільтратах становить 0,5-10 мас. %. З них цукри, придатні для одержання біомаси та ліпідів, становлять принаймні 0,5 мас. %, краще принаймні 3 мас. %, оптимально 4-5 мас. %. Наприклад, шляхом подрібнення та повторної екстракції з біоматеріалу можна витягти додаткову кількість цукрів і таким чином довести їх вміст до зручнішого рівня. Тим не менш, вміст цукрів у фільтраті головним чином становить менше 30 мас. %, звичайно менше 20 мас. %. Мікроорганізми, здатні продукувати ліпід, можна вирощувати таким чином, щоб вони спочатку виробляли біомасу, а потім ліпід, або ж одночасно біомасу та ліпід. У залежності від походження біоматеріалу та способу його обробляння (водою, кислотою, лугом), можна одержувати гексозні моносахариди, пентозні моносахариди або одночасно ті й інші у різних співвідношеннях, як показано на фіг.2. З деяких біоматеріалів виходять головним чином гексозні цукри, з інших - головним чином пентозні. Шляхом підбору мікроорганізму, здатного продукувати ліпід, з фільтрату, чи осаду, чи їх комбінації, які містять переважно гексозні цукри, можна виробляти клітинну масу, а потім використовувати фільтрат, чи осад, чи їх комбінацію, які містять переважно пентозні цукри, для одержання ліпіду з клітинної маси. Або ж ліпіди можна переробляти на клітинну масу з гексоз. З гексоз можна одержувати клітинну масу та ліпіди. Відповідно, шляхом підбору мікроорганізму, здатного продукувати ліпід, з фільтрату, чи осаду, чи їх комбінації, які містять переважно пентозні цукри, можна виробляти клітинну масу, а потім використовувати фільтрат, чи осад, чи їх комбінацію, які містять переважно гексозні цукри, для одержання ліпіду з клітинної маси. Або ж ліпіди можна переробляти на клітинну масу з пентоз, або одержувати з них клітинну масу та ліпіди. І клітинну масу, і ліпіди можна одержувати з суміші пентоз та гексоз. Обробляння біоматеріалу Далі описується обробляння біоматеріалу згідно з кращими варіантами здійснення винаходу. Як правило, об'єднують два або більше оброблянь: Вихідний матеріал краще екстрагувати при температурі 90-100 °C. У кращому варіанті здійснення винаходу для екстракції застосовують 5-10 %-ну мінеральну кислоту, наприклад, сірчану, або органічну кислоту, наприклад, лимонну або оцтову, або ж луг, краще 0,5-2,0M NaOH. Тривалість обробляння може бути різною: краще 1-10 годин, звичайно 2-8 годин, ще краще 2-4 години. З водною екстракцією можна об'єднувати інші види обробляння, наприклад, ферментами, мікроорганізмами, окислювачами чи відновлювачами, або комбінації таких оброблянь. У відповідності до способу осад, утворений при екстракції, можна піддавати механічному подрібненню, краще при температурі 100-210 °C, як правило, 150-200 °C, краще протягом 2-20 хвилин, як правило, 5-11 хвилин. Тиск у кращому варіанті становить 6-8 бар. Одержану масу фільтрують, фільтрат обробляють, як описано вище, щоб зробити його придатним для одержання одноклітинного ліпіду. Осад можна подавати на обробляння міцною кислотою, краще 40-72 %-ною сірчаною кислотою, краще 65-70 %-ною сірчаною кислотою. Обробляння 7 UA 101637 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 звичайно триває 2-8 годин, краще 2-4 години. Спосіб можна здійснювати з будь-якою кислотою, яка забезпечує каталізований протоном гідроліз. Для цього придатними є, наприклад, міцні мінеральні кислоти, фосфорна кислота, сірчана кислота, або оксикислоти сірки, азоту, хлору, брому та йоду. Внаслідок гідролізу виникають фільтрат, який обробляють для одержання одноклітинного ліпіду, та осад, який можна подавати до розбавленого розчину кислоти, краще до 5-10 %-ного розчину сірчаної кислоти, а подрібнення можна здійснювати при температурі 170-200 °C під тиском 6-10 бар протягом 10-20 хвилин. Суміш розділяють на фільтрат та осад, причому перший обробляють для підготовки до одержання одноклітинного ліпіду, а осад можна видалити. Вищеописаний варіант здійснення способу має на меті якомога повне використання вуглеводу, наявного у вихідному матеріалі, для вироблення одноклітинного ліпіду. Однак, починаючи з екстракції вихідного матеріалу, спосіб може реалізовуватися лише у своїх окремих аспектах, наприклад, коли волокнистий матеріал осаду використовують для інших цілей. Спосіб за винаходом відрізняється тим, що у кращому випадку у ньому здійснюють усі наведені вище етапи, але він не обмежується здійсненням усіх операцій, або послідовністю їх виконання, або використанням моносахаридних фракцій, утворених у ході цих операцій, у виробленні одноклітинного ліпіду. До описаного способу можна додати етап, на якому одержані з вихідного матеріалу фракції, що містять моносахарид, використовують для вироблення одноклітинної біомаси або етанолу поряд з ліпідом. Далі описуються деякі кращі варіанти здійснення способу за винаходом. Ці способи є придатні також для інших видів сировини, ніж ті, що представлені в описі. I. Згідно з кращим варіантом здійснення винаходу деревні волокна у вигляді подрібненої деревної маси, термомеханічної целюлози або тирси обробляють таким чином: A. 100 г деревних волокон екстрагують в 1 л води при 90-100 °C протягом 2-4 годин, краще 2 годин. Осад відфільтровують й виділяють розчин. Вихід вуглеводу в розчині становить від 2 % до 5 % у залежності від способу одержання деревних волокон, для термомеханічної деревної маси, одержаної при високій температурі (вище 170 °C), він звичайно становить 4-5 %. B. Для збільшення виходу вуглеводу волокнисту фракцію гідролізують в 1 л 5-10 % кислоти (краще 5 %), pH біля 1 (наприклад, мінеральна кислота), при температурі 90-100 °C 2-4 годин, краще 2 годин. Осад відокремлюють від розчину, розчин виділяють. C. Надлишок кислоти у кращому варіанті декантують з осаду, який знову подрібнюють у дефібраторі (крильчастому або дисковому рафінері). У кращому варіанті осад підігрівають парою протягом 1 хвилини та залишають конденсат у суміші. Температуру підвищують до 150200 °C, краще 170 °C, при тиску 6-8 бар (крильчастий рафінер). Тривалість подрібнення встановлюють у залежності від виду деревини у межах від 2 до 15 хвилин. Осад відфільтровують, розчин виділяють. D. До фракції осаду додають міцну 40-72 % кислоту (сірчану кислоту) й дають відстоятися 24 години, краще 2 години, при температурі оточення. Надлишок кислоти декантують, осад знову подрібнюють у дефібраторі (крильчастому або дисковому рафінері). Краще осад пропарювати протягом 1 хвилини, конденсат при цьому не зливають. Температуру підвищують до 150-200 °C, краще 170 °C, при тиску 6-8 бар (крильчастий рафінер). Тривалість подрібнення встановлюють у залежності від виду деревини у межах від 2 до 15 хвилин. Суміш фільтрують, осад відокремлюють від розчину. Розчин виділяють, а осад використовують як паливо. Фракцію розчину, одержану на будь-якому з попередніх етапів A – D, можна додатково піддавати знебарвлюванню, коригуванню рН та іншим заходам, що сприяють зростанню мікроорганізму, наприклад, збезводнюванню, а одержані розчини можна використовувати у культуральному середовищі мікроорганізму, який продукує ліпід. Послідовністю етапів A – D можна перевести 40-65 % волокнистого матеріалу у вихідній деревинно-волокнистій масі у розчинну форму. Розчиняються такі вуглеводи, як глюкоза, галактоза, маноза, ксилоза та арабіноза у співвідношеннях, які існували між ними у вихідному матеріалі. II. Згідно з іншим кращим варіантом здійснення винаходу використовують 100 г деревних волокон, подрібненої деревної маси, вторинних волокон, термомеханічної целюлози, тирси або механічної деревної маси екстрагують у 1 л 4-8 % розчину лугу, краще 1 M NaOH, при 90-100 °C протягом 2-4 годин, краще 3 годин. Осад відфільтровують при температурі оточення й виділяють обидві фракції. Вихід вуглеводу в розчин становить від 5 % до 8 % у залежності від способу одержання деревних волокон у вихідному матеріалі. Цей розчин краще обробляти однією з наступних операцій: 8 UA 101637 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 A. Розчин у посудині повторно застосовують як такий при екстракції наступної партії волокнистої маси, як описано вище, потім розчин виділяють. B. Розчин гідролізують кислотою за будь-яким з етапів B – D попереднього варіанту з метою обробляння розчинених у ньому лігніну, оліго- та полісахаридів. C. Розчин, повернений згідно з етапом А, використовують на етапі В варіанту 1. Для збільшення виходу моносахариду осад після лужного обробляння краще обробляти одним з наступних прийомів або їх об'єднанням: D. Осад обробляють згідно з будь-яким з етапів B, C, D попереднього варіанту 1 або згідно з ними усіма. Суміш фільтрують, розчин нейтралізують, виділяють осад та розчин. E. Осад після етапу А варіанту ІІ повторно обробляють лугом, краще в умовах подрібнення суміші протягом 2-8 хвилин, краще 6 хвилин, під тиском 4-10 бар, краще 8 бар, при температурі 170 °C. Проводять фільтрацію, нейтралізують та виділяють розчин. Завдяки додатковому подрібненню вихід розчиненого матеріалу підвищується до 27 % вмісту волокон у вихідному матеріалі. Вуглеводний розчин, одержаний на етапах A – E, що містить глюкозу, галактозу, манозу, ксилозу та арабінозу, перетворюють на форму, придатну для вироблення ліпідів мікроорганізмами, шляхом знебарвлювання, коригування рН або збезводнювання, й використовують як культуральне середовище для мікроорганізмів або частину такого середовища, де мікроорганізми виробляють ліпід. III. Згідно з третім кращим варіантом здійснення винаходу деревні волокна, подрібнену деревну масу, термомеханічну целюлозу, тирсу, механічну деревну масу, вторинні волокна (або нейтралізований екстракт, приготований на етапі В вище) гідролізують кислотою міцністю 510 % (краще 5 %), додаючи 1 л цієї кислоти (наприклад, мінеральної) до 100 г матеріалу, що гідролізується, з рН біля 1, при температурі 90-100 °C протягом 2-4, краще 2 годин. Осад відфільтровують. Розчин містить 4-14 % вуглеводів з волокон вихідного матеріалу. Осад можна використовувати як волокнисту масу або піддати додатковому оброблянню для збільшення виходу моносахариду на етапах C або D, або обох цих етапах вищенаведеного першого варіанту. Розчин відокремлюють від осаду, нейтралізують, фільтрують та використовують як такий або після концентрування у культуральному середовищі мікроорганізму, який виробляє ліпід. IV. Згідно з четвертим кращим варіантом здійснення винаходу беруть 100 г деревних волокон, подрібненої деревної маси, термомеханічної целюлози, тирси, механічної деревної маси або осаду з етапів А-С варіанту І чи етапу А варіанту ІІ, додають 5-10 % кислоту з рН біля 1 (наприклад, мінеральну кислоту), дають відстоятися 2-4, краще 2, години. Надлишок кислоти декантують з осаду, який знову подрібнюють у дефібраторі (крильчастому або дисковому рафінері). Краще осад підігрівати парою протягом 1 хвилини та не дають конденсату стекти. Температуру підвищують до 150-200 °C, краще 170 °C, при тиску 6-8 бар (крильчастий рафінер). Тривалість подрібнення встановлюють у залежності від виду деревини у межах від 2 до 15 хвилин. Осад відфільтровують, розчин виділяють. Залишковий осад використовують як паливо або повторно подрібнюють для підвищення виходу моносахариду до розчину. Розчин нейтралізують, фільтрують та використовують як такий або після концентрування таким чином, як описано для варіантів I–III. V. Згідно з п'ятим кращим варіантом здійснення винаходу беруть 100 г деревних волокон, подрібненої деревної маси, термомеханічної целюлози, тирси, механічної деревної маси або осаду з варіантів I–IV, додають міцну 40-72 % кислоту (наприклад, сірчану) й дають відстоятися 2-4, краще 2, години при температурі оточення. Надлишок кислоти декантують, осад знову подрібнюють у дефібраторі (крильчастому або дисковому рафінері). Краще осад підігрівати парою протягом 1 хвилини та не давати конденсату стекти. Температуру підвищують до 150200 °C, краще 170 °C, при тиску 6-8 бар (крильчастий рафінер). Тривалість подрібнення встановлюють у залежності від виду деревини у межах від 2 до 15 хвилин. Суміш вуглеводів фільтрують, осад відокремлюють від розчину. Частина речовин, яка розчинилася, у кількості 4065 % слугує сировиною. Залишковий осад можна використовувати як паливо або повторно подрібнити, щоб збільшити вихід моносахариду. Розчин нейтралізують, фільтрують та обробляють згідно з будь-яким з варіантів I–IV. У альтернативному варіанті міцна 40-72 % сірчана кислота реагує з осадом при температурі оточення протягом 1-3, краще 1,5, години. Після того кислоту розбавляють до 5 % та кип'ятять під атмосферним тиском при 100 °C 4 години. Подальше обробляння - як описано вище. 9 UA 101637 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вироблення ліпіду за допомогою мікроорганізмів Цей винахід дозволяє шляхом об'єднання фільтратів, одержаних на різних етапах, повністю використовувати вуглеводи, що містяться у вихідному матеріалі, як і моносахариди - гексози та пентози - для одержання ліпіду та одноклітинної біомаси за допомогою мікробіологічних процесів. Кожний виділений фільтрат можна після попереднього обробляння, тобто промивки, нейтралізації, знебарвлювання та інших подібних операцій, використовувати як такий або у комбінації з різними водними фракціями для вироблення одноклітинного ліпіду. Завдяки способам обробляння вихідного матеріалу, що становлять складову частину винаходу, останній також є придатний для одержання етанолу. Фільтрат, тобто водну фракцію, або будь-яку комбінацію фільтратів додають до культурального середовища, яке є або було інокульоване мікроорганізмами і де мікроорганізму дозволяють виробляти ліпід. Ліпід виділяють у вигляді маси мікроорганізмів або розділяють цю масу й виводять як ліпід, так і масу мікроорганізмів. Ліпіди можна виділяти відомими прийомами – видаляють їх із клітин або руйнують клітини. Із зруйнованої клітини ліпід можна екстрагувати органічними розчинниками. Способи виділення ліпідів, придатні для винаходу, описані, наприклад, у роботі Z. Jacob: Yeast Lipids: Extraction, Quality Analysis, and Acceptability, Critical Reviews in Biotechnology, 12(5/6); 463-491 (1992). Кращим способом виділення ліпідів є розділення фаз. Перетворювати ліпід, вироблений у мікроорганізмі, на ефіри жирних кислот можливо без попередньої гомогенізації клітин мікроорганізмів та наступної ізоляції жиру. Кращий варіант здійснення винаходу передбачає спосіб утворення ліпіду або суміші ліпідів із суміші вуглеводів, одержаної при оброблянні вихідного органічного матеріалу, що містить гексозні та пентозні цукри у формі мономерів або олігомерів, згідно з яким суміш, що містить вуглеводи, вводять до водного культурального середовища, у якому культивують мікроорганізм, що продукує ліпід, додають до середовища поживні речовини, необхідні для росту, інокулюють середовище зазначеним організмом, культивують організм і дають йому виробляти ліпід, виділяють клітинну масу та відокремлюють ліпід або суміш ліпідів від клітин, або відокремлюють клітини, що містять жир, чи їх складові й використовують їх як такі. Спосіб згідно з винаходом є дуже гнучким відносно мікробіологічного вироблення ліпіду. Фракція, що містить як гексозні, так і пентозні цукри, є природним джерелом вуглецю для багатьох мікроорганізмів, здатних продукувати ліпіди. Отже, перевагою способу є можливість вибору з-поміж широкого кола мікроорганізмів, виходячи, наприклад, з їх продуктивності по ліпідах, виходу біомаси, типу культивування або умов культивування. Інші компоненти мікроорганізму, крім ліпіду, можна використовувати багатьма різними шляхами, що підвищує загальну економічну ефективність способу згідно з винаходом. Кращі шляхи використання позбавленої ліпідів маси мікроорганізмів - гідроліз і повернення до культурального середовища мікроорганізмів, що продукують ліпід, або застосування в якості корму чи поживної речовини. Також можливо виділяти з позбавленої ліпідів маси мікроорганізмів різні компоненти, як от (спеціальні) цукри, фарбники, β-глюкан, стероли, стерольні ефіри або білки. Мікроорганізм обирають з-поміж природних або генетично модифікованих організмів, що накопичують жир, краще дріжджів, плісняв, бактерій та водоростей, краще з-поміж дріжджів та плісняв, оптимально з-поміж дріжджів. Важливо, щоб обраний мікроорганізм був здатний продукувати ліпіди з гексозних або пентозних цукрів або тих і інших. Отже, винахід охоплює усі мікроорганізми, у яких накопичення ліпідів базується на активності АТФ-цитратліази (EC 2.3.3.8), яка міститься у них. Виробляти ліпід згідно з винаходом здатні наступні роди дріжджів: Candida, Yarrowia, Lipomyces, Rhodotorula та Cryptococcus, які включають штами, що синтезують з пентозного цукру ксилози ліпід, як от Candida curvata (D) (Evans, C.T. and Ratledge, 1983. A comparison of the oleaginous yeast, Candida curvata, grown on different carbon sources in continuous and batch culture, Lipids 18 623-629), Rhodotorula gracilis (Yoon, S., Rhim, J., Choi, S., Ryu, D. and Rhee, J. 1982. Effect of Carbon and Nitrogen Sources on Lipid Production of Rhodotorula gracilis, J. Ferment. Technol. 60, 243-246) та Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula graminis, Lipomyces starkeyi, Lipomyces lipofer, Candida lipolytica, Cryptococcus, Cryptococcus albidus, Trichosporon cutaneum та Trichosporon pullulans (Fall, R., Phelps, P. and Spindler, D. 1984, Bioconversion of Xylan to Triglycerides by Oil-Rich Yeasts. Appl. Environ. Mircobiol. 47, 1130-1134), а також штам, який синтезує ліпід з пентозного цукру арабінози - Lipomyces starkeyi (Naganuma, T., Uzuka, Y. and Tanaka K. 1985. Physiological Factors Affecting Total Cell Number and Lipid Content of the Yeast, Lipomyces starkeyi, J. Gen. Appl. Microbiol. 31, 29-37). Відповідно, з родів плісняв, які накопичують жир та придатні для цілей винаходу, можна навести: – Aspergillus 10 UA 101637 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 – Chaetomium – Clodosporidium – Cunninghamella – Emericella – Fusarium – Mortierella – Mucor – Penicillium – Pythium – Rhizopus – Trichoderma Відповідно, з родів бактерій, які накопичують жир та придатні для цілей винаходу, можна навести: – Acinetobacter – Actinobacter – Anabaena – Arthrobacter – Bacillus – Clostridium – Flexibacterium – Micrococcus – Mycobacterium – Nocardia – Nostoc – Oscillatoria – Pseudomonas – Rhodococcus – Rhodomicrobium – Rhodopseudomonas – Shewanella – Streptomyces – Vibrio Відповідно, з родів мікроводоростей, які накопичують жир та придатні для цілей винаходу, можна навести: – Botryococcus – Brachiomonas – Chlamydomonas – Chlorella – Crypthecodinium – Dunaliella – Euglena – Nannochloris – Nannochloropsis – Navicula – Nitzschia – Schizochytrium – Sceletonema – Scenedesmus – Tetraselmis – Thraustochytrium – Ulkenia Згідно з кращим варіантом здійснення винаходу для синтезу ліпідів використовують мікроорганізми, які синтезують ліпіди із вмістом жирних кислот, що становлять 12-65 % сухої маси клітин. За оптимальним варіантом здійснення винаходу безліпідну біомасу, оброблену зручним для мікроорганізму шляхом, використовують як поживні компоненти у культуральному середовищі. Окрім цих компонентів, культуральне середовище можна доповнювати компонентами, яким даний мікроорганізм віддає перевагу. Для вироблення ліпіду мікроорганізм, як правило, потребує, середінших, джерело вуглецю, який у цьому винаході видобувається з вихідного матеріалу, джерело азоту, наприклад, неорганічну соль амонію (як от сульфат амонію) або 11 UA 101637 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 органічне джерело азоту (як амінний азот, екстракт дріжджів або гідролізована клітинна маса) та джерело поживних мікроелементів, як от джерело фосфату, сульфату, хлориду, вітамінів або катіонів (наприклад, джерело іонів Mg, K, Na, Ca, Fe або Cu), причому ці компоненті можна додавати до середовища у разі потреби. При застосуванні способу згідно з винаходом концентрація ліпіду в клітинах становить у кращому випадку 40 мас. %, оптимально 65 мас. %. Виробництво біопалива Ефір жирної кислоти, який міститься у виробленому мікроорганізмом ліпіді, можна переробляти на біопаливо будь-яким відомим способом. Кращим способом є переетерифікація із спиртами з коротким ланцюгом, краще з метанолом, для одержання спиртового ефіру жирної кислоти. Забруднені бічні потоки, що утворюються у виробництві біодизелю або відновлюваного дизелю під час переетерифікації, містять спиртові сполуки, наприклад, гліцерин або солі неетерифікованих жирних кислот, і важко піддаються енергоефективному використанню, можна повертати до вироблення одноклітинного ліпіду, який використовується як такий або може перероблятися на інші гліцероліпідні матеріали біологічного походження. Переваги винаходу До переваг винаходу належить та обставина, що для його здійснення потрібна нескладна апаратура, з ним пов'язані відомі технології виробництва та експлуатації. Масштаби виробництва за способом згідно з винаходом нічим не обмежуються, їх можна легко розширяти чи звужувати у залежності від вмісту вуглеводів та наявної кількості сировини. Здійснення способу при виробленні ліпіду не потребує енергомісткого нагрівання, роботи під тиском або інших хімічних каталізаторів, крім кислот, лугів або ферментів. Спосіб вимагає лише тих хімікатів, які можуть включатися до внутрішнього циклу згідно з винаходом, або обробляння таких біоматеріалів. Також немає потреби у коштовному видаленні води з оброблюваних розчинів цукрів, оскільки розбавлені розчини вуглеводів цілком придатні для використання у культуральному середовищі мікроорганізму, ба й самі слугують таким середовищем. Загальна економічна ефективність способу ще зростає за рахунок того, що утворена у ньому безліпідна біомаса, крім внутрішнього циклу, має ще багато інших застосувань, наприклад, у виробництві таких органічних продуктів, як корми або сировина для кормів, або як додаткове культуральне середовище для зростання мікроорганізмів. Спосіб також дозволяє одержувати одноклітинну біомасу та етанол. Переваги багатоетапного обробляння біомаси згідно з винаходом полягають у більш повному гідролізі органічних матеріалів, а відтак кращій утилізації органічного матеріалу при виробленні одноклітинного ліпіду у порівнянні з відомою технологією. Далі, фільтрати або осади, одержані при кислотному та лужному оброблянні, нейтралізують один одного, зменшуючи таким чином витрати хімікатів на нейтралізацію. У відомих рішеннях описуються способи одержання етанолу, які містять мікробіологічні етапи, де сировиною слугують матеріали, що містять вуглеводи як такі або перетворені на моносахариди. У заявці US 2002/0185447 та патенті US 5637502 також йдеться про способи обробляння вуглеводів, наприклад, лугами або кислотами, з наступною спиртовою ферментацією. Щодо мікробіологічної обробляння, обидва способи обмежені лише одержанням етанолу з використанням гексозного цукру, утвореного з полісахаридів. У заявці US 2003/0096385 за допомогою мікроорганізмів одержують прениловий спирт (геранилові та фарнезилові похідні спирту). У заявці WO 03/038067 описано спосіб, де модифікація генома грибкового мікроорганізму дає організм, здатний переробляти пентозні цукри. Цей винахід також стосується лише виробництва етанолу. Цей винахід пропонує нове вирішення щодо використання більш поширених бічних потоків термомеханічних процесів обробляння деревини, зокрема, тих, що мають місце у целюлознопаперовій промисловості, перш за все, як сировини для транспортного палива. Винахід дозволяє скоротити біологічне навантаження від вуглеводних бічних потоків виробництва деревної маси, а відтак енерговитрати на очищення стоків. Більш конкретно, спосіб вироблення ліпіду за винаходом створює екологічно чисте вирішення проблеми одержання сировини для виробництва транспортного палива, біодизелю або відновлюваного дизелю, наприклад, з розбавлених водних розчинів термомеханічної або механічної переробки деревини, що містять вуглеводи. Спосіб також пропонує альтернативні вирішення для використання інших вихідних матеріалів. Згідно із способом вихідними матеріалами можуть бути вторинна волокниста маса, наприклад, типографський папір, пакувальні матеріали та подібні матеріали, що містять целюлозу. Отже, у порівнянні з відомим рівнем техніки цей винахід більшою мірою відповідає 12 UA 101637 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 принципам сталого розвитку, бо збільшує наявність ліпідної сировини і знижує попит на органічний ліпід з інших джерел. Через те зростає доступність сировини для біопалива з відновлюваних природних ресурсів, а собівартість виробництва палива скорочується до рівня, який влаштовує споживачів. Щодо повноти утилізації вихідного матеріалу, винахід не обмежується лише повним використанням наявних вуглеводів. Спосіб також містить етапи, що дозволяють виділяти ліпідні компоненти з екстрактивної фракції деревини. При оброблянні вихідного матеріалу водою до фільтрату виділяється ліпідний компонент, який можна вилучити з водного розчину відомими прийомами. Внаслідок кислотного обробляння вихідного матеріалу ліпіди в екстрактивній фракції виділяють вільні жирні кислоти, які вилучають з фільтрату у вигляді нерозчинних солей ++ лужноземельних металів, зокрема, солей Ca , і які після відокремлення осаду переетерифікуються на спиртові ефіри. Відповідно лужна екстракція вихідного матеріалу дає в екстрактивній фракції солі жирних кислот, які є розчинними, а тому змішуються з фільтратом. ++ Згідно з винаходом такі солі переводять у нерозчинну форму, наприклад, у сіль Ca , й відокремлюють осад від водної фази для одержання спиртових ефірів жирних кислот. Наступні приклади лише ілюструють винахід і ніяким чином не можуть обмежувати його обсяг. Також винахід ніяким чином не обмежується застосованими штамами мікробів. Винахід можна здійснювати не лише за допомогою зазначених штамів, але й інших штамів того самого виду або роду, або штамів інших видів або родів, або генетично модифікованих штамів мікробів. Мікроорганізми, що виробляють ліпід, є досить поширені, й їх можна знайти у кількох колекціях штамів, наприклад, ATCC, DSM та інших. Мікроорганізми, що виробляють ліпід, та процеси одержання ліпідів із застосуванням мікроорганізмів (у тому числі водоростей) описані у літературі, наприклад, у роботах: Single Cell Oils, eds. Z. Cohen and C. Ratledge, AOCS Press, 2005 та Microbial Lipids, eds. C. Ratledge and S.G. Wilkinson, vol. 1 and 2, Academic Press, 1988. Приклади Приклад 1 По 100 г деревних волокон, подрібненої деревини, термомеханічної целюлози, тирси та механічної деревної маси витримують в 1 л киплячої води при 90-100 °C протягом 2 годин. Розчини відфільтровують від волокнистого матеріалу (надалі осаду). Осади відокремлюють та піддають різним оброблянням з метою підвищення виходу моносахариду до величин, наведених у прикладах 4 або 5. Вихід вуглеводів з розчинів становить від 2 до 6 % у залежності від вихідного матеріалу, як правило, 4 % при подрібненні ялинкових волокон при високій температурі (вище 170 °C). Деякі розчини повторно використовують без упарювання для екстрагування наступних порцій волокнистої маси, а інші концентрують упарюванням до вмісту сухої речовини біля 20 мас. %. Концентровані фільтрати вилучають до вироблення одноклітинного ліпіду. Розчинені вуглеводи є типовими для застосованих порід дерев, будучи гексозами та пентозами. Приклад 2 По 100 г деревних волокон, подрібненої деревини, термомеханічної целюлози, тирси та механічної деревної маси нарізно додають до 1 л 5 % розчину лугу (NaOH) та перемішують при 90-100 °C 3 години. Проводять фільтрацію при температурі оточення, а осади піддають подальшому оброблянню для одержання моносахаридів за прикладом 4. Екстракційні розчини обробляють таким чином, що частину кожного розчину повторно використовують при оброблянні наступної партії волокнистої маси, частину нейтралізують, а частину піддають гідролізу за прикладом 4, оскільки у лужних екстракційних розчинах присутня деяка кількість лігніну, а також оліго- та полісахаридів. До розчинів, одержаних з різних вихідних матеріалів, переходить у середньому до 5 % маси вихідних матеріалів. Осади, одержані при первинному лужному оброблянні, також повторно обробляють лугом, як вище, та подрібнюють протягом 6 хвилин під тиском 8 бар при температурі 170 °C. Завдяки цьому подальшому подрібненню вихід матеріалу до лужного розчину можна підвищити до 27 % первинної маси вихідних матеріалів. Ці розчини стають чорними; після нейтралізації, гідролізу та концентрування їх обробляють активованим вугіллям та іонообмінною смолою з метою знебарвлювання. Виділені суміші надходять на вироблення одноклітинного ліпіду. Приклад 3 По 100 г деревних волокон, подрібненої деревини, термомеханічної целюлози, деревноволокнистої маси середньої щільності, тирси, механічної деревної маси, вторинних волокон та нейтралізованого екстракту з прикладу 2 гідролізують в 1 л 5 % мінеральної кислоти з рН 1 при 90-100 °C протягом 3 годин. Осади відфільтровують від розчинів. Розчини містять моносахариди у середньому до 10 % від маси вихідного матеріалу. Кожний розчин обробляють так, що частину його нейтралізують, фільтрують та концентрують упарюванням до досягнення 13 UA 101637 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вмісту моносахариду біля 20 мас. %, концентровані розчини надходять на вироблення одноклітинного ліпіду. Частину розчинів як такі повторно використовують при гідролізі наступних партій вихідного матеріалу, як описано у цьому прикладі. Осади піддають подальшому оброблянню для підвищення виходу моносахариду згідно з прикладом 5. Приклад 4 По 125 г деревних волокон, подрібненої деревної маси, термомеханічної целюлози, деревно-волокнистої маси середньої щільності, тирси, механічної деревної маси, соломи, лушпиння та осаду з прикладів 1-3 додають до розчину сірчаної кислоти з концентрацією 10 % та дають просякнутися кислотою протягом 2 годин. Надлишок кислоти декантують, суміші подають до крильчастого рафінера, пропарюють 11 хвилин, не даючи конденсату стекти, після чого підвищують температуру до 160 °C і тиск до 8 бар та подрібнюють у крильчастому рафінері. Ялинкові волокна подрібнюють з перемішуванням 11 хвилин. Після подрібнення осади відокремлюють від розчинів. Кожний осад розділяють так, що частину його спалюють, а частину подрібнюють повторно з метою підвищення виходу моносахариду згідно з прикладом 5. Відповідно розчини нейтралізують, фільтрують та концентрують упарюванням до досягнення вмісту моносахариду біля 20 мас. %. Ці розчини надходять на вироблення одноклітинного ліпіду. Приклад 5 ID. По 125 г деревних волокон, подрібненої деревної маси, термомеханічної целюлози, тирси, механічної деревної маси, соломи, злакових волокон та осаду з прикладів 1-4 додають до 40 % розчину сірчаної кислоти % та дають просякнутися кислотою при температурі оточення протягом 2 годин. Надлишок кислоти декантують, суміші подають до крильчастого дефібратора, пропарюють 11 хвилин, не даючи конденсату стекти. Підвищують температуру до 160 °C і тиск до 8 бар та подрібнюють у крильчастому рафінері. Солому та лузгу подрібнюють 11 хвилин. Після подрібнення осади відокремлюють від розчинів. Вміст розчинених речовин у середньому всюди становить більше 50 % від вихідного матеріалу. Розчини нейтралізують, фільтрують та концентрують упарюванням, а потім виділяють для вироблення одноклітинного ліпіду. Осади, тобто залишкові волокна, частково спалюють, а частково подрібнюють повторно з метою підвищення виходу моносахариду. Концентрованою сірчаною кислотою (72 %) також окремо просочують зазначені вихідні матеріали протягом 2 годин при температурі оточення. Після того кислоту розбавляють до 5 % та кип'ятять під атмосферним тиском при 100 °C 4 години. Подальше обробляння та використання одержаних фракцій відбуваються, як описано вище. Приклад 6 Моносахарид, придатний для вироблення одноклітинних ліпідів, можна одержати з полови, соломи та лушпиння прямим гідролізом за допомогою 5 %-ної кислоти, або просочити міцнішою кислотою та гідролізувати 5 % розчином, або спочатку обробити лугом, а потім гідролізувати геміцелюлозу та целюлозу окремо, як у попередніх прикладах. Ці обробляння можна чергувати з просочуваннями кислотою чи лугом з наступними повторними подрібнюваннями у крильчастому або дисковому рафінері з одержанням термомеханічної целюлози. Однак у цьому прикладі полову, солому та лушпиння (по 125 г) пропарюють 11 хвилин під тиском 8 бар та переробляють на термомеханічну целюлозу у крильчастому рафінері при температурі 170 °C. Одержану термомеханічну целюлозу гідролізують у 5 %-ній кислоті (сірчаній) обсягом в 1 л при 90-100 °C під атмосферним тиском протягом 4 годин. Розчинені фракції відфільтровують та нейтралізують. Після того розчини концентрують та відводять на вироблення одноклітинного ліпіду. Вихід моносахариду у середньому становить 50 % від вихідного матеріалу. Для збільшення виходу вуглеводів осади після фільтрації піддають повторному термомеханічному оброблянню за прикладом 5, а частину спалюють. Приклад 7 По 16 кг полови, соломи та лушпиння витримують у 100 л лужного розчину (1,2 M NaOH) при 90-100 °C 4 години. Суміш розділяють на розчин та осад. У середньому 49-57 % сухої речовини вихідних матеріалів потрапляє до розчинів. Концентрацію лужних розчинів знижують до 5 % доданням сірчаної кислоти та піддають гідролізу, як у прикладі 6. Утворюються головним чином суміші ксилози та арабінози з невеличкою домішкою глюкози та галактози. У розчинах міститься 23-33 % моносахариду вихідного матеріалу. Колір розчинів змінюють за допомогою активованого вугілля, перш ніж подавати їх на вироблення одноклітинного ліпіду. Осади після фільтрації просочують 5 %-ною сірчаною кислотою та подрібнюють 11 хвилин у крильчастому рафінері під тиском 6 бар при температурі 150 °C. Осади розкладаються на розчинні вуглеводи, головним чином глюкозу та галактозу, які після нейтралізації та фільтрації надходять на вироблення одноклітинного ліпіду. Осади, що лишаються після кислотного 14 UA 101637 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гідролізу та фільтрації, повторно подрібнюють, а потім гідролізують у 10 %-ній кислоті за прикладом 4. Розчини після таких оброблянь містять моносахариди у сумарній кількості 55-65 % їх вмісту у вихідному матеріалі. Розчини виділяють для вироблення одноклітинного ліпіду. Приклад 8 Бурякову м'якоть після сушки парою висипають до корита, куди виливають воду так, щоб вона покривала м'якоть з верхом. Розчину дають охолонути, після чого декантацією відокремлюють воду від твердої фази. У воді розчиняються 3,6 мг сухої речовини/мл. Частину водної фракції використовують для розчинення нової партії, іншу частину концентрують та скеровують на вироблення одноклітинного ліпіду. Одержану тверду фракцію, осад, що містить 16,7 % сухої речовини, тобто 748 г висушеної бурякової м'якоті відповідають 125 г осаду, і його просочують 0,4M фосфорною кислотою (H3PO4, 500 мл) при температурі оточення 18 годин. Надлишок кислого розчину видаляють декантацією та пропарюють 11 хвилин до початку термомеханічного подрібнення. Суміш подрібнюють 11 хвилин у крильчастому рафінері під тиском 8 бар при температурі, яка на початку процесу становить 172 °C, а після 10 хвилин подрібнення знижується до 162 °C. Суміш видаляють з рафінера та фільтрують. Розчинна фракція (2,26 л) містить 2,75 % сухої речовини. Після фільтрації у розчині опиняється 50 % сухої речовини від кількості, що надходила на подрібнення. Розчин містить переважно моносахариди глюкозу, галактозу, арабінозу та ксилозу. Крім того, помічена мала кількість олігосахаридів молекулярною масою 500-3000 та сполук з ще більшою молекулярною масою. Розчинну фракцію нейтралізують, концентрують та скеровують на вироблення одноклітинного ліпіду. Осад – тверду волокнисту масу (125 г сухої речовини), одержану при описаному оброблянні бурякової м'якоті, просочують 15 %-ною соляною кислотою при температурі оточення 4 години. Надлишок кислого розчину декантують, а осад повторно подрібнюють таким само чином. Після фільтрації до розчину потрапляє ще 28 % моносахаридів. Осад видаляють. Приклад 9 Вихідним матеріалом слугують ялинкові волокна після термомеханічного обробляння масою 46,8 г (обсяг біля 1 л). Зверху наливають 0,2N NaOH, потім додають 5,6 г Na 2CO3 та 1,3 г MgSO4 6H2O (500 мл). Суміш нагрівають до 50 °C, у розчині опиняються невеличкі кількості глюкози, ксилози, галактози, арабінози, манози та деяких олігомерів. pH розчину біля 11, його фільтрують та промивають водою. Змиви та фільтрат зливають разом та випарюють до 320 мл. У розчині присутні 4,5 % сухої речовини вихідного матеріалу. Для підвищення виходу моносахаридів до розчину додають кислоту, відокремлюють одержаний осад, а розчин виділяють та скеровують на вироблення одноклітинного ліпіду. Осад гідролізують у 5 %-ній кислоті для одержання моносахаридів за прикладом 3. Шляхом гідролізу виділяють 1 % моносахаридів з маси осаду, вони переходять до розчину й після знебарвлювання надходять на вироблення одноклітинного ліпіду. Приклад 10 Беруть ялинкові волокна після термомеханічного обробляння масою 45 г (об'єм біля 1 л). Зверху наливають 0,2N NaOH, потім додають 5,6 г Na2CO3 та 1,3 г MgSO4 6H2O (500 мл). Суміш нагрівають до 50 °C, фільтрують, осад промивають водою. Змиви та фільтрат зливають разом. Для підвищення виходу моносахаридів до змішаних фільтратів додають кислоту та проводять гідроліз за прикладом 3. Після нейтралізації продукт, одержаний гідролізом, скеровують на вироблення одноклітинного ліпіду. Промитий осад ущільнюють до 300 мл, додають 1 л цитратного буфера з pH 4,8 та фермент целюлазу. Оброблену ферментом суміш як без фільтрації, так і відокремлений фільтрат скеровують на вироблення одноклітинного ліпіду. Приклад 11 125 г вівсяних висівок піддають термомеханічному подрібненню при 170 °C під тиском 8 бар протягом 2 хвилин. Після обробляння осад відфільтровують від розчину. Розчин скеровують на вироблення одноклітинного ліпіду. 7 г осаду (волокна) обробляють 19 %-ною сірчаною кислотою та нагрівають із зворотним холодильником 4 години. Аналіз показує, що до нового розчину переходять 56 % моносахаридів з вихідного матеріалу, переважно ксилоза, маноза, глюкоза, галактоза та арабіноза. Розчин скеровують на вироблення одноклітинного ліпіду. Приклад 12 400 г вівсяних висівок зважують та додають 3 л води та 200 г NaOH. Суміш витримують при температурі 90-96 C при перемішуванні 2 години, фільтрують крізь тканину та відокремлюють волокнисту масу. Фільтратну фракцію (50 мл) нейтралізують, коригують її рН до 4,8 цитратним буфером (40 мл), додають мультиефект-ксиланазу (10 мл) й витримують суміш у термостаті до 50 °C. цукри переходять до розчину, у тому числі 25,2 % становить ксилоза та 11,8 % арабіноза. Після 50 годин реакції у розчині з'являються також олігомери. Суміш цілком скеровують на вироблення одноклітинного ліпіду. 15 UA 101637 C2 5 10 15 20 25 Приклад 13 125 г бурякової м'якоті просочують 0,4 M сірчаною кислотою, а через 12 годин декантують надлишок кислоти. М'якоть подають до крильчастого рафінера, де пропарюють 4 хвилини та подрібнюють при 150 °C під тиском 6 бар 11 хвилин. Суміш нейтралізують та додають лимонну кислоту, поки рН не знизиться до 4. Додають 10 мл пектинази 4450 одиниць, тобто 178 мг/мл протеїну (фірми Sigma) та продовжують реакцію ще 24 години при 25 °C. Після реакції частину суміші скеровують на вироблення одноклітинного ліпіду, а частину фільтрують. Осад після фільтрації повертають на подрібнення, а до розчину після нового обробляння додають 2 г/л активованого вугілля, після чого скеровують до аніонообмінної колонки. Розчин моносахаридів, що виходить з колонки, випарюють до вмісту 20 % сухої речовини та скеровують на вироблення одноклітинного ліпіду. Приклад 14 Вівсяні висівки обробляють за прикладом 7, одержуючи суміш, яка містить 23,8 г/л глюкози, 93,3 г/л ксилози, 37,1 г/л арабінози та 9,0 г/л галактози. Цю суміш додають як культуральне середовище до дріжджів, що синтезують ліпід, Yarrowia lipolytica ATCC 20373 та Rhodotorula glutinis TKK 3031 як таку, у розбавленні 1:1, причому після розбавлення додають 11 г/л глюкози. Культуру витримують 68 годин при температурі 28 °C, перемішуванні зі швидкістю 250 обертів/хв. та об'ємі культури 50 мл. Як показано на фіг.3, дріжджі здатні рости та синтезувати ліпід без необхідності додавання інших поживних речовин. Приклад 15 Три види дріжджів, Rhodotorula glutinis, Yarrowia lipolytica та Kluyveromyces marxianus (або Candida kefyr) ATCC 42265, культивують нарізно з ксилозою як джерелом вуглецю. Культуральне середовище містить 20 г/л ксилози, 10 г/л дріжджового екстракту та 20 г/л пептону. Культивують об'єм 50 мл при 25 °C при перемішуванні на швидкості 200 об/хв. З фіг.4 видно, що всі три штами здатні використовувати пентозний цукор як джерело вуглецю. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 30 35 40 45 50 55 1. Спосіб одержання ліпіду або суміші ліпідів з вихідного органічного матеріалу, який містить полісахарид, вибраного з групи, що включає целюлозу, геміцелюлозу, крохмаль, усі ці речовини разом, будь-яку суміш цих речовин або вуглеводних продуктів їх розкладу, або некрохмальний полісахарид, який відрізняється тим, що: a) по-перше, обробляють вихідний матеріал речовиною, вибраною з групи, яка включає: і) воду, іі) кислоту та ііі) луг, b) після чого розділяють осад та фільтрат, а осад, одержаний від такої обробки, піддають механічному або термомеханічному подрібненню як такий або у присутності води, кислоти або лугу, розділяють одержані таким чином осад та фільтрат, або ж піддають одержаний таким чином осад ще одному або кільком оброблянням згідно з будь-яким з етапів і), іі) або ііі), та/або подрібнюванню і с) вводять мікроорганізм, що продукує ліпід, у контакт з одержаним таким чином фільтратом, або з кількома одержаними фільтратами, або осадами, або будь-якою одержаною з них комбінацією та, за бажанням, і з вихідним матеріалом, у культуральному середовищі, завдяки чому клітини мікроорганізму починають виробляти ліпід, і d) виділяють ліпіди. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що осад обробляють застосовуючи також метод, який складається з одного або кількох з наступних етапів, на яких: e) обробляють осад, одержаний на етапі b), міцною кислотою й розділяють осад та фільтрат, або ж, у альтернативному випадку f) підкислюють осад, одержаний на етапі b) або e), піддають його механічному або термомеханічному подрібненню й розділяють осад та фільтрат або, за бажанням, повторно обробляють осад, одержаний на будь-якому з етапів b), e) або f), знову один або кілька разів методом за будь-яким з етапів b), e) або f), у довільному порядку, g) вводять мікроорганізм, що продукує ліпід, у контакт з фільтратом або осадом, одержаними на етапах b), e) або f), або з будь-якою комбінацією речовин, одержаних на цих етапах, та, за бажанням, і з вихідним матеріалом, у культуральному середовищі, завдяки чому клітини мікроорганізму починають виробляти ліпід, і h) виділяють ліпіди. 16 UA 101637 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 3. Спосіб за пп. 1 або 2, який відрізняється тим, що вихідний матеріал походить з механічного або термомеханічного обробляння деревини або культурних рослин. 4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, який відрізняється тим, що вихідний матеріал обробляють водою або кислотою. 5. Спосіб за пп. 1 або 2, який відрізняється тим, що вихідний матеріал обирають з групи, яка включає вторинні волокна, м'якоть цукрового буряка, полову, солому, висівки, злакові зерна, цілі придатні для обробляння сільськогосподарські рослини, культурні рослини, термомеханічну деревну масу та деревно-волокнисту масу середньої щільності. 6. Спосіб за будь-яким з пп. 1, 2 або 5, який відрізняється тим, що вихідний матеріал обробляють кислотою. 7. Спосіб за пп. 1 або 2, який відрізняється тим, що вихідний матеріал вибирають з групи, що включає тирсу, очищену механічну деревну масу, полову, солому, термомеханічну деревну масу, деревно-волокнисту масу середньої щільності, м'якоть цукрового буряка та культурні рослини, що не містять крохмалю у помітній кількості. 8. Спосіб за будь-яким з пп. 1, 2 або 7, який відрізняється тим, що вихідний матеріал обробляють лугом. 9. Спосіб за пп. 1 або 2, який відрізняється тим, що вихідний матеріал вибирають з групи, яка включає мікробну масу, болотну або підводну біомасу, включаючи водорості та мікроводорості, біомаси з водозбірників целюлозних виробництв, біомаси з міських відходів та біомаси муніципальних стічних вод. 10. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що фільтрат містить 0,530 мас. %, краще 1-20 мас. %, оптимально 4-5 мас. % цукрів, придатних для вироблення ліпіду. 11. Спосіб за пп. 1 або 2, який відрізняється тим, що обробляння за будь-яким з етапів b), e) або f) проводять один або кілька разів. 12. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що при оброблянні вихідного матеріалу лугом за етапом а) ііі) одержаний на наступному етапі b) осад повторно обробляють кислотою й розділяють фільтрат та осад. 13. Спосіб за пп. 1 або 2, який відрізняється тим, що при оброблянні осаду, який містить волокна, міцною кислотою одержаний осад знову піддають механічному або термомеханічному подрібненню. 14. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що до розчину для обробляння біоматеріалу додають один або декілька гідролітичних ферментів. 15. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що фільтрат, одержаний на будь-якому етапі процесу, при подальшому оброблянні піддають знебарвленню, коригують рН та видаляють або додають воду, щоб зробити фільтрат більш придатним для вирощування мікроорганізмів. 16. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що вихідний матеріал піддають попередньому оброблянню шляхом механічного або термомеханічного подрібнення, хімічно шляхом обробляння водою, лугом або кислотою, біологічно шляхом ферментного або мікробіологічного обробляння або шляхом комбінації цих методів. 17. Застосування способу за будь-яким з пп. 1-16 для попереднього обробляння сировини при виробленні біопалива, одноклітинної біомаси або спирту. 18. Спосіб одержання біопалива, який відрізняється тим, що використовують як сировину ліпід, одержаний способом за будь-яким з пп. 1-16. 19. Спосіб оброблення біомаси з міських стічних вод, який відрізняється тим, що біомасу обробляють способом за будь-яким з пп. 1-16. 17 UA 101637 C2 18 UA 101637 C2 19 UA 101637 C2 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 20