Пептид, здатний нейтралізувати або модулювати утворення антитіл до мвр (мієлінового основного білка), фармацевтична композиція та спосіб лікування розсіяного склерозу

Пептид или его соли, способный нейтрализовать или модулировать образование антител к миелиновому основному белку, имеющий формулу Ri-Val-His-Phe-Phe-l_ys-Asn-lle-R2 где Ri выбрано из группы, включающей Asn-Pro-Val, Pro-Val, Val, Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val, Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val, водород и гидрокси, R2 выбрано из группы, включающей Val, Val-Thr, Val-Thr-Pro, Val-Thr-Pro-Arg, водород и гидрокси, при условии, что Ri и R2 одновременно не являются водородом или гидроксилом, при этом данный пептид содержит замещения, добавления или делеции 1 Пептид по п 1, отличающийся тем, что когда Ri - Asn-Pro-Val, то R2 - водород или гидрокси, - Pro-Val, то R 2 -Val, когда - Val, то R 2 - Val-Thr, когда - водород или гидрокси, то R2 - Val-Thrкогда Pro, 1 Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Gluкогда Asn-Pro-Val, то R2 - Val-Thr и когда Ri - Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val, то R2 Val-Thr-Pro-Arg 2 Фармацевтическая композиция активная против рассеянного склероза, содержащая пептид или его соли, способный нейтрализовать или модулировать образование антител к миелиновому основному белку, один или в комбинации, в смеси с фармацевтически приемлимым носителем, причем указанный пептид имеет формулу Ri-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle-R2 где Ri выбрано из группы, включающей Asn-Pro-Val, Pro-Val, Val, Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val, Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val, водород и гидрокси, R2 выбрано из группы, включающей Val, Val-Thr, Val-Thr-Pro, Val-Thr-Pro-Arg, водород и гидрокси, при условии, что Ri и R2 одновременно не являются водородом или гидроксилом, при этом данный пептид содержит замещения, добавления или делеции 3 Фармацевтическая композиция по п 3, отличающаяся тем, что когда Ri - Asn-Pro-Val, то R2 - водород или гидрокси когда - Pro-Val, то R 2 -Val, когда - Val, то R 2 - Val-Thr, когда - водород или гидрокси, то R2 - Val-ThrPro, когда Ri Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-GluAsn-Pro-Val, то R2 - Val-Thr и когда Ri - Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val, то R2 Val-Thr-Pro-Arg 4 Способ лечения рассеянного склероза, состоящий втом, что пациенту назначают пептид или его соли, отличающийся тем, что указанный пептид имеет формулу Ri-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle-R2 О ю ГО Ю ю где Ri выбрано из группы, включающей Asn-Pro-Val, Pro-Val, Val, Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val, Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val, водород и гидрокси, R2 выбрано из группы, включающей Val, Val-Thr, Val-Thr-Pro, Val-Thr-Pro-Arg, водород и гидрокси, при условии, что Ri и R2 одновременно не являются водородом или гидроксилом, при этом данный пептид содержит замещения, добавления или делеции Данное изобретение касается некоторых полипептидов и их использования для иммунорегуляции антител к миелиновому основному белку человека Изобретение также относится к новым фармацевтическим композициям, содержащим указанные полипептиды, и к способу использования этих пептидов для лечения рассеянного склероза УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ Рассеянный склероз (MS) - это многоочаговое демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС) человека, связанное с воспалением Повышенный синтез IgG в пределах гематоэнцефалического барьера (mtra-BBB) является признаком рассеянного склероза (Tourtelotte, W W J Neurol Sci 10 279-304, 1970, Link, H And Tibblmg G , Scand J Clm Lab Invest 37 397-401, 1977, Tourtelotte, W W and Ma B, Neurology 28 76-83, 1978, Walsh, J M And Tourtelotte, W W In, Hallpike, J F Adams, С W M And Tourtelotte, W W eds Multiple Sclerosis Baltimore Williams & Wilkms, 1982 275-358, and Warren К G , and Catz, I Ann Neurol 17 475-480, 1985) Выработка IgG в пределах ВВВ, в основном, повышается у пациентов с клинически определенным заболеванием рассеянным склерозом (Schimiacher, G А , Beebe, G , Kibler R E et al Aim NY Acad Sci 15 266-272, 1965), как в случае активной, так и скрытой формы заболевания Специфичность большинства IgG ЦНС неизвестна Тогда как небольшая их часть обладает антивирусной активностью или выступает во взаимодействие с антигенами мозга, нуклеиновыми кислотами, эритроцитами или антигенами гладкой мускулатуры, другие неспецифические Ig могут быть задействованы в политональной активации В-клеток (Tourtelotte, W W , and Ma, В , Neurology 28 76-83, 1978) В течение последнего десятилетия наблюдается значительный интерес к изучению антител, специфичных к миелиновым белкам Вслед за обнаружением циркулирующих иммунных комплексов, содержащих миелиновый 55375 4 5 Способ по п 5, отличающийся тем, что когда Ri - Asn-Pro-Val, то R2 - водород или гидрокси, когда Ri - Pro-Val, то R2 - Val, когда Ri - Val, то R2 - Val-Thr, когда Ri - водород или гидрокси, то R2 - Val-ThrPro, когда Ri Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-GluAsn-Pro-Val, то R2 - Val-Thr и когда Ri - Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val, то R2 Val-Thr-Pro-Arg 7 Способ по п 5 отличающийся тем, что пептид вводят внутривенно, с помощью поясничной пункции, орально или комбинацией данных методов 8 Способ по п 5, отличающийся тем, что пептид вводят внутривенно в дозе, варьирующей от 1 мг/кг веса тела до 10 мг/кг веса тела, однократно или последовательно несколько раз в случае необходимости основный белок (МБР) в качестве антигенного компонента (Dasgupta, M К Catz, I, Warren, К G , et al, Can J Neural Sci 10 239-243, 1983), были выявлены повышенные титры антител к МБР (antiМВР) в спинномозговой жидкости (CSF) больных с активной формой рассеянного склероза (MS) (Warren, К G , and Catz, I , Ann Neurol 209 20-25, 1986) Клиническая картина рассеянного склероза характеризуется фазами активного заболевания, такими как острые рецидивы или хроническое течение, и фазами клинической ремиссии Для активной формы рассеянного склероза характерны повышенные уровни внутриоболочечных анти-МВР (Warren, К G , and Catz, I , Ann Neurol 209 20-25, 1986, and Catz, L, and Warren, К G , Can J Neurol Sci 13 21-24, 1986) Эти антитела обнаруживаются преимущественно в свободной (F) форме во время острых рецидивов и преимущественно в связной (В) форме - когда болезнь незаметно прогрессирует (Warren, К G , and Catz, L, Ann Neurol 209 20-25, 1986) Во время острых рецидивов титры анти-МВР в спинномозговой жидкости (CSF) соответствуют активному развитию заболевания (Warren, К G , and Catz, L, Ann Neurol 21 183-187,1987) Уровни анти-МВР также повышаются у больных с первыми приступами оптического неврита и у большинства больных с начальными стадиями рассеянного склероза (MS) (Warren, К G , Catz, I , and Bauer, С , Ann Neurol 23 297-299, 1988, Warren, K, G, and Catz, L, J Neurol Sci 91 143-151, 1989) Продолжительные исследования кинетики уровней антител к МБР в CSF у пациентов, находящихся в стадии выздоровления после острого рецидива, показали постепенное падение титров анти-МВР в свободной (F) форме с соответствующим пропорциональным повышением (В)фракций, т е анти-МВР в связанной форме (Warren, К G , and Catz, I , J Neurol Sci 91 143-151, 1989, Warren, К G , and Catz, I , J Neurol Sci 88 185-194, 1988) В стадии ремиссии анти-МВР в CSF могут не обнаруживаться, что позволяет 55375 предположить, что нейтрализация анти-МВР связана с неактивной стадией заболевания (MS) (Warren, К G , and Catz, I , J Neurol Sci 88 185194, 1988) Наоборот, хронически прогрессирующий рассеянный склероз (MS), характеризующийся постоянным увеличением выработки анти-МВР в течение продолжительного периода времени, связан с ингибированием нейтрализации антиМВР (Warren, К G,, and Catz, I , J Neurol Sci 88 185-194, 1988) Недавно в lgG-фракции, полученной из CSF больных MS, были идентифицированы антитела к основному миелиновому белку, в том числе анти-МВР, антитела, нейтрализующие антиМВР, и антитела, ингибирующие нейтрализацию анти-МВР (Warren, К G , and Catz, I, J Neurol Sci 96 19-27, 1990) Предыдущие исследования авторов изобретения с учетом сведений о В-клеточных аутоантителах показывает, что существует по крайней мере, две отличающиеся друг от друга формы рассеянного склероза (MS) первая - когда у большинства больных вырабатываются аутоантитела к миелиновому основному белку (анти-МВР), и вторая, когда у меньшего числа больных вырабатываются антитела к белку протеолипидной природы (анти-PLP) (Warren, К G , et al , Ann Neurol 35 280-289,1994) При той форме заболевания (MS), для которой характерно наличие анти-МВР, острые рецидивы сопровождаются увеличением соотношения свободных (F) и связанных (В) антиМВР, тогда как хронически прогрессирующая фаза характеризуется более низким соотношением F/B анти-МВР, а больные на стадии ремиссии редко имеют слегка повышенные титры анти-МВР (Warren, К G , and Catz, I, J Neurol Sci 88 185-194, 1989) Было показано, что часть пролиферирующих Т-клеток у больных рассеянным склерозом направлена к МБР (Allegretta et al , Science, 718-721, 1990) и что Т-клетки человека могут узнавать множественные эпитопы на молекуле (Richert et al , J Neuroimmun 23, 55-66, 1989) MBP, повидимому, также способом к активации некоторых Т-клеток без вовлечения антигенпрезентирующих клеток (Altaian et al, Em J Immunol 17,1635-1640, 1987) Похоже, что небольшие пептиды МБР могут распознаваться Т-клетками без внутриклеточного процессирования просто за счет их способности связывать антигены основного комплекса гистосовместимости класса II на поверхности презентирующих клеток Поскольку экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЕАЕ), признанный моделью рассеянного склероза (MS) на животных, может быть индуцирован введением чувствительным грызунам как МБР, так и PLP в сочетании с полным адъювантом Фрейнда, процесс демиелинизации при рассеянном склерозе, возможно, имеет аутоиммунный механизм (Fritz, R В et al , J Immunol, 130, 1024-1024, 1983, Trotter, J L et al , J Neurol Sci 79, 173-188, 1987) Принимая во внимание сведения о Вклеточных аутоантителах, эпитоп МБР, на который «нацелено» заболевание, локализован вблизи от три-пролиловой последовательность (остатки -99-100-101-) на участке между 80-м и 100-м остатком (Warren, К G , et al , Ann Neurol 35 280289, 1994) Этот В-клеточный эпитоп частично перекрывает иммунодоминантный эпитоп Тклеток, активных в отношении МБР, которые обнаружены в участках мозга, пораженных рассеянным склерозом (MS) (Oksenberg, g R et al , Nature, 362, 68-70, 1993) Предыдущие исследования показали, что анти-МВР нейтрализуются МБР Однако, предварительные попытки лечения рассеянного склероза (MS) внутримышечным или подкожным введением гетерологичных МБР не привели к успеху (Campbell, В , Vogel, R J , Fisher, E and Lorenz, R , Arch Neurol 29 10-15, 1973, Gonsette, R E , Delmotte, P and Demonty, L, J Neurol 216 27-31, 1977, and Romme, J S and Salk, J , In Hallpike, J F , Adams, С W M and Tourtelotte, W W , eds Multiple sclerosis Baltimore, Williams & Wilkms, 1982 621-630) Проблема использования нативного МБР имеет две стороны Белок получают из образцов мозга человека, и потому существует потенциальная опасность, что в нем присутствует латентные нейровирусы Кроме того, несмотря на то, что, как правило, МБР не является иммуногенным, при введении лицам с нарушенной иммунной системой, МБР может проявлять себя как антиген и вызывать выработку антител к МБР Соответственно, настоящее изобретение направлено на решение вопроса могут ли антиМВР, выделенные из спиномозговой жидкости (CSF) больных рассеянным склерозом (MS) в стадии острого рецидива нейтрализоваться определенными пептидами МБР человека (h-MBP) Для этой цели синтетические пептиды, соответствующие полной длине h-MBP, использовали для определения возможной эпитогшой области на hМВР, которая нейтрализует анти-МВР, полученные от указанных больных Следовательно, выбранные пептиды, которые нейтрализуют антиМВР, могут использоваться для лечения рассеянного склероза (MS) более эффективно, чем МБР полной длины Эти пептиды получены искусственным путем и потому не несут потенциальной угрозы, связанной с нейровирусами Кроме того, в связи с малым размером эти пептиды не проявляют себя в качестве иммуногенов Следовательно, использование указанных пептидов как средства лечения рассеянного склероза поможет решить проблемы, возникающие при использовании нативного белка Кроме того, пептиды, полученные согласно настоящему изобретению, исследуют для определения эффективности их связывания или модуляции выработки анти-МВР рассеянного склероза (MS) in vivo СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ В соответствии с изобретением заявлены пептиды, последовательность которых, в основном, гомологична части аминокислотной последовательности миелинового основного белка человека Эти пептиды способны нейтрализовать или модулировать выработку анти-МВР В соответствии с настоящим изобретением заявляются пептиды формулы Ri-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle~R2 и их соли, где Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle 55375 аминокислотные остатки 87-93 SEQ ID NO 1 и Ri и F 2 независимо выбраны из группы, включающей ? водород, гидрокси, остаток аминокислоты и остаток полипептида, причем Ri и F 2 не являются во? дородом или гидроксилом одновременно Пептид может содержать замещения, делеции или добавления, причем его функция нейтрализации или модулирования выработки анти-МВР сохраняется Примеры указанных пептидов МВР75-95 (аминокислотные остатки 75-95 of SEQ ID NO 1) Lys Ser His GIV Arg Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lie Val Thr MBP64-78 (аминокислотные остатки 64-78 of SEQ ID NO 1) Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys SerHisGly MBP61-75 (аминокислотные остатки 61-75 of SEQ ID NO 1) His HIS Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys MBP69-83 (аминокислотные остатки 69-83 of SEQ ID NO 1) Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp Glu MBP80-97 (аминокислотные остатки 80-97 of SEQ ID NO 1) Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lie Val Thr Pro Arg MBP91-106 (аминокислотные остатки 91-106 of SEQ ID NO 1) Lys Asn He Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys Gly MBP84-93 (аминокислотные остатки 84-93 of SEQ ID NO 1) Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle MBP85-94 (аминокислотные остатки 84-94 of SEQ ID NO 1) Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle-Val MBP86-95 (аминокислотные остатки 86-95 of SEQ ID NO 1) 8 Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle-Val-Thr MBP87-96 (аминокислотные остатки 87-96 of SEQ ID NO 1) Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle-Val-Thr-Pro Далее, согласно настоящему изобретению, заявлена фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента пептид из числа описанных выше, индивидуально, или в композиции, смеси с фармацевтически приемлемым носителем Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением заявляется способ лечения рассеянного склероза, предусматривающий введение эффективного количества пептида из описанных выше, как индивидуально, так и в сочетании для эффективной нейтрализации или модулирования выработки антител к МБР человека КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ Фиг 1 показывает локализацию восемнадцати синтетических пептидов по отношению к интактной молекуле МБР человека Пептиды представлены в виде вертикальных полос и размещены после соответствующего им участка на молекуле МБР Шкала показывает аминокислотные остатки на молекуле МБР человека Фиг 2 показывает кривые ингибирования антител к МБР, очищенных и полученных от 10 различных больных рассеянным склерозом, при введении МБР человека и МБР-пептидов ФигЗ показывает нейтрализацию анти-МВР, полученных от одного больного рассеянным (MS) МБР человека и пептидами МБР 80-97, МБР 91106 и МБР 75-95 Фиг 4 - длительный мониторинг титров антиМВР в спиномозговой жидкости у пациента с хроническим рассеянным склерозом (MS) уровни F (свободных) и В (связанных) антиМВР были стабильно повышенными при исследовании 26 проб в течение 11-летнего периода с 1983 по 1993 г с р т счет в минуту единицы радиоактивности = с р т образца - с р т blank с р т общее - с р т blank - о - связанные (В) анти-МВР, определенные после кислотного гидролиза иммунных комплексов в спинномозговой жидкости (CSF) - • - свободные (F) анти-МВР Фиг 5 - контрольные больные уровни антиМВР CSF в 2 временных контролях (1F56, Fig 5A и ЗМ66, Fig 5B) и 2 двух временных контролях при использовании физиологического раствора У всех четверых больных уровень (F)- и (В)-анти-МВР остается устойчиво повышенным по отношению к базовому уровню, когда CSF отбиралась для анализа каждые 30 мин в течение первых двух часов, так же, как и 24-мя часами позже Обозначения такие же, как на фиг 4 Фиг 6 - сравнительные исследования пептидов от разных больных уровни анти-МВР в спинномозговой жидкости в группе из четырех больных (10F38, Fig 6а, 13F43, Fig 6С, 5М59, Fig 6D, и ЗМ66, Fig 6G), получивших увеличенные количества (1, 2 5, 5 и 10мг соответственно) несвязанно го контрольного синтетического пептида МВР-3558 и в группе из четырех других больных (6F53, Fig6B, 8M41, Fig 6D, и 4М45, Fig 6F, и 1F56, Fig 6H), которые получали повышенные количества (1, 2 5, 5 и 10мг соответственно) анти-МВР, связывающих синтетический пептид МБР 75-95 CSF (F)-aHTH-MBP были связаны в дозозависимом соотношении пептидом МБР 75-95, и они не вступали во взаимодействие с пептидом МБР 35-58 Связанные анти-МВР оставались фактически нереакционноспособным Фиг 7 - сравнительные исследования пептидов от разных больных когда больные MS подвергались временнуму контролю (1F56, Фиг7С и ЗМ66, Фиг7О) или временному контролю при использовании физиологического раствора (5М59, Фиг7А и 4М45, Фиг7В), а также, когда они получали несвязанный контрольный пептид МБР 35-58 (5М59 и ЗМ66), уровни их (F)-aHTH-MBP и (В)-антиМВР оставались постоянно неизмененными На 55375 против, когда те же больные 4М45, 1F56 и ЗМ66 позже получили 5-10мг анти-МВР связанных с пептидом МБР 75-95, их (F)-aHTH-MBP переставали обнаруживаться в течение периода до 7 дней и возвращались на уровень базовой линии между 10 и 21 днем Фиг 8 - повторяемые внутрикожные инъекции синтетического пептида больной с хронически прогрессирующим MS получал 10 еженедельных инъекций 10мг МБР 75-95, вводимых непосредственно в спинномозговую жидкость, титры (F) и (В)анти-МВР измерялись до (обозначенные кружками) и спустя ЗОмин после инъекции (обозначенные квадратами) Свободные (F)-aHTH-MBP (заштрихованные квадраты и кружки) становились неопределяемыми в течение 10 недель, несмотря на то, что уровень связанных (В)-антител оставался существенно неизмененным (незаштрихованные квадраты и кружки) Фиг 9 Внутривенное введение синтетического пептида уровни анти-МВР в спинномозговой жидкости соответствуют одной внутривенной инъекции 500мг МБР 75-95, уровни связанных (В)- и свободных (F)-aHTH-MBP существенно снижаются при исследованиях спустя 10, 16 и 30 дней после инъекции Обозначения - такие же, как на Фиг 4 Фиг 10 Дальнейшее изучение МБР эпитопа для анти-МВР MS с использованием группы из 41 декапептида, которые перекрывают участки между 61 и 110 остатками Описание полосы обозначают процент ингибирования =100 - единицы радиоактивности, МБР и пептид МБР 75-95 были использованы в качестве позитивного контроля и обеспечили 100% ингибирование как свободных (F)-, так и связанных (В)-антител, пептиды МБР 51-60 и МВР111-120 были использованы в качестве негативного контроля и привели к незначительному ингибированию (010%) связанных (В)- и свободных (F)-aHTH-MBP, декапептиды МБР 84-93, МБР 85-94, МБР 8695 и МБР 87-96, которые обеспечили максимальное ингибирование (90-100%) как свободных (F)-, так и свободных (В)-антител, тесно ассоциируются с МБР эпитопом, пунктирная линия 95%-ный достоверный интервал исследования по ингибированию ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Настоящее изобретение касается пептидов, аминокислотная последовательность которых практически гомологична части аминокислотной последовательности миелинового основного белка человека Термин «практически гомологична» означает, что небольшие различия между аминокислотной последовательностью миелинового основного белка человека и пептидами могут существовать при условии, что пептиды с небольшими различиями в аминокислотной последовательности способны функционировать с соответствии с изначально присущим назначением, т е способны нейтрализовать или модулировать выработку антител к миелиновому основному белку человека (анти-МВР) Проведенные в настоящем изобретении разъяснения делают очевидным для специалистов в данной области тот 10 факт, что эмпирически небольшие вариации в аминокислотной последовательности указанных пептидов могут быть произведены без ущерба для их функции В соответствии с настоящим изобретением на основе исследований по конкурентному ингибированию при использовании набора из 41 декапептида было установлено, что МБР эпитоп для антиМВР MS локализован на участке между аминокислотой 82 и аминокислотой 98 (более 40% ингибирования связанных анти-МВР и более 60% ингибировния свободных анти-МВР) С учетом самого высокого уровня ингибирования МБР эпитоп анти-МВР вероятно находится между аминокислотой 84 и аминокислотой 96 Наименьший общий участок эффективных декапептидов располагается между 87 и 93 аминокислотами Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением пептиды могут описываться следующей формулой Ri-Val-His-Phe-Phe-l_ys-Asn-lle-R2, включающей и их соли, где Val-His-Phe-PheLys-Asn-lle- остатки аминокислот 87-93 SEQ Ю N01, и где Ri и R2 - независимо друг от друга выбраны из группы, включающей водород, гидрокси, остаток аминокислоты и остаток полипептида, при условии, что Ri и R2 не являются водородом или гидроксилом одновременно Участок аминокислотной последовательности, соответствующий семи аминокислотам, занимающим положение, 87-93 вероятно, не слишком велик, чтобы эффективно связывать анти-МВР Поэтому Ri и R2 не могут одновременно быть водородами или гидроксилами Когда Ri или R2 - аминокислота, то она может быть выбрана из природных аминокислот Ri или R2 не ограничены аминокислотами, расположенными в положении «upstream» и «downstream» по отношению к Val 187 и Не 93 в миелиновом основном белке человека, как показано в SEQ ID NO 1 Могут использоваться различные модификации, включая замещения, добавления и делеции в последовательностях, расположенных в положениях «upstream» и «downstream» по отношению к Ri и R2 Кроме того, такие же модификации включая замещения, добавления и делеции, могут быть произведены и в последовательности Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle-, при условии, что полученные таким образом пептиды сохраняют предназначенную им функцию, т е нейтрализуют или модулируют выработку антител к миелиновому основному белку человека Термин «остаток пептида» или «полипептидный остаток» обозначает полипептид, состоящий из двух, трех и более аминокислотных остатков, включая белки и их фрагменты Как сказано выше, когда Ri или R2 -полипептидный остаток, Ri или R2 не ограничиваются пептидами, расположенными в положении «upstream» и «downstream» по отношению к Val 187 и Не 93 миелинового основного белка человека Может быть использован любой остаток полипептида Ri и/или R2 могут быть повторами последовательности -Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle или ее модификациями, включая замещения, дополнения или делеции Таким образом, пептид может со 11 55375 12 держать многочисленные повторы сайта связывавательности в пределах последовательности, пония анти-МВР (эпитопа) казанной ниже (аминокислотные остатки SEQ Ю Соединения, заявленные согласно настоящеN0 1), при условии, что указанная последоваму изобретению, могут быть получены в соответтельность может нейтрализовать или модулироствии с общепринятыми и хорошо известными вать выработку антител к миелиновому основному методами синтеза полипептидов Под термином белку человека «пептид» подразумевают пептиды, полученные из Аминокислотные остатки 61-106 SEQ ID NO 1 природных миелиновых основных белков челове61 His HIS Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser ка в результате контролируемого гидролиза, осуLeu Pro Gin Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp Glu Asn ществляемого до образования пептидов, относяPro Val Val His Phe Phe Lys Asn He Val Thr Pro Arg щихся к данному изобретению Указанное понятие Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys Gly 106 также включает и пептиды, полученные с помоНиже приведены примеры пептидов, выбранщью технологии рекомбинантных ДНК С учетом ных из группы, включающей известной последовательности заявленных пепМВР61-75 (аминокислотные остатки 61-75 тидов в объем настоящего изобретения включено SEQIDNO 1) также установление соответствующей последоваHis HIS Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu тельности ДНК, кодирующей заявленную аминоPro Gin Lys кислотную последовательность Соответствующая MBP64-78 (аминокислотные остатки 64-78 последовательность ДНК может быть получена SEQIDNO 1) общепринятыми хорошо известными методами Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys синтеза ДНК последовательностей Полученные Ser His Gly таким образом последовательности ДНК могут MBP69-83 (аминокислотные остатки 69-83 быть клонированы в соответствующих клонируюSEQIDNO 1) щих векторах и использованы для трансформации Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly Arg Thr подходящей клетки-хозяина с целью получения Gin Asp Glu рекомбинантного пептида Все изложенные выше MBP75-95 (аминокислотные остатки 75-95 подходы являются общепринятыми и хорошо изSEQIDNO 1) вестными для специалистов в данной области Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn He Val Thr Пептиды, заявленные согласно настоящему изобретению, в основном гомологичны по своей MBP80-97 (аминокислотные остатки 80-97 аминокислотной последовательности части амиSEQIDNO 1) нокислотной последовательности миелинового Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe основного белка человека Понятие «часть аминоLys Asn He Val Thr Pro Arg кислотной последовательности» означает, что MBP91-106 (аминокислотные остатки 91-106 последовательность может быть любой длины при SEQIDNO 1) условии, что она достаточно длинна для того, чтоLys Asn He Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser бы нейтрализовать или модулировать выработку Gin Gly Lys Gly антител к МБР, но имеет не такую длину, которая Один аспект настоящего изобретения касаетприводит к известным ранее проблемам, когда ся пептацов, представленных формулой пептиды используются in vivo для лечения рассеRi-Val-His- Phe-Phe-Lys-Asn-lle-R2 янного склероза В одном примере настоящего и их солей, где Ri и R2 независимо друг от изобретения описаны пептиды, включающие от друга выбраны из группы, включающей водород, -10 до -25 аминокислотных остатков Если заявгидрокиси, остаток аминокислоты и остаток полиленные пептиды используются как часть белков пептида, при условии, что Ri и R2 не являются слияния, общий размер пептида может быть гоодновременно водородом или гидроксилом Пепраздо больше тид может содержать замещения, добавления или делеции при условии сохранения пептидом своего В соответствии с одним вариантом осуществсвойства нейтрализовать или модулировать выления изобретения было установлено, что заявработку антител к МБР человека ленные пептиды, соответствующие в значительной мере аминокислотной последовательности Ниже приведены примеры пептидов, выбранчеловеческого МБР, эффективны в отношении ные из группы, включающей нейтрализации и модулирования выработки антиМВР84-93 (аминокислотные остатки 84-93 МВР Эти пептиды соответствуют аминокислотной SEQIDNO 1) последовательности человеческого МБР в интерAsn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle вале от 61 до 106 аминокислотного остатка В одМВР85-94 (аминокислотные остатки 84-93 ном примере эти пептиды соответствуют участку SEQIDNO 1) 75-106 аминокислотной последовательности чеPro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle-Val ловеческого МБР, когда пептиды используются МВР86-95 (аминокислотные остатки 84-93 для нейтрализации свободных анти-МВР В поSEQIDNO 1) следующем примере эти пептиды соответствуют Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle-Val-Thr участку 82-99 аминокислотной последовательноМВР87-96 (аминокислотные остатки 84-93 сти человеческого МБР, когда пептиды используSEQIDNO 1) ются для нейтрализации и модулирования выраVal-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle-Val-Thr-Pro ботки связанных анти-МВР Поэтому выбираются Возможная роль анти-МВР в патогенезе распептиды, состоящие из 10-25 аминокислотных сеянного склероза продолжает исследоваться О остатков, из сплошной аминокислотной последоповышенных титрах анти-МВР у больных активной 14 13 55375 формой рассеянного склероза впервые сообщили рассеянном склерозе (MS), вероятно, возможно Pamch et al (Pamtch, H S, Hooper, С S , and блокировать димиелинизацию внутриоболочечJohnson, К Р, Arch Neurol 37 206-209, 1980), коным и/или внутривенным и/или оральным введеторые использовали твердофазный радиоиммунием заявленных МБР пептидов, которые нейтранологический анализ с МБР морской свинки Пализовали бы анти-МВР и обеспечивали бы циенты с острым рецидивом заболевания, как толерантность к МБР in situ Другие миелиновые правило, имели повышенное содержание антибелки человека, возможно, также участвуют в диМВР, в основном, в свободной форме, тогда как миелинизации при рассеянном склерозе (MS) и, в некоторые больные в стадии клинической ремиссоответствии с этим, в объем настоящего изобресии могли иметь необнаруживаемые уровни антитения включено использование пептидов, в значиМВР Во время переходного периода от острой тельной мере гомологичных по аминокислотной дозы к ремиссии, титры свободных анти-МВР пропоследовательности части аминокислотной погрессивно снижались за период от нескольких неследовательности указанных других миелиновых дель до нескольких месяцев, в то время как уробелков, для того, чтобы нейтрализовать соответвень связанных антител был, сравним с ствующие антитела Несмотря на то, что предыпервоначальным У других больных на стадии дущие попытки лечения рассеянного склероза ремиссии можно было наблюдать низкие титры (MS) внутримышечным или подкожным введением свободных и связанных анти-МВР, обычно с соотгетерологичного МБР не оказались в полной мере ношением F/B меньше 1 Это позволяет предпоуспешными (Campbel, В , Vogel, R J , Fisher, E ложить, что антитела (антитело), нейтрализующие and Lorenz, R, Arch Neurol 29 10-15, 1973, анти-МВР, связываются с анти-МВР Иногда больGousette, R E , Delmotte, P and Demonty, L J Neuные, которые точно соответствовали критериям rol 216 27-31, 1977, and Romme, J S and Salk, J , клинически определяемого рассеянного склероза In Halpike, J F , Adams, С W M and Tourtelotte, или больные с нейропатологически выявленным W W , eds Multiple Sclerosis Baltimore, Williams & рассеянным склерозом, имели неопределяемый Wilkms, 1982 621-630), внутриоболочечное и/или уровень анти-МВР в период активной стадии завнутривенное введение МБР пептидов, которые болевания Возможно, такие пациенты имеют аннейтрализуют или модулируют выработку антититела к другим миелиновым белкам Отсутствие МВР, в соответствии с изобретением, продемонсхемы выработки специфических антител не стрировало более успешные результаты уменьшает потенциальной возможной роли антиМоделью MS на животных служит экспериМВР в механизме демиелинизации у большинства ментальный аллергический энцефаломиелит больных рассеянным склерозом (ЕАЕ), представляющий собой опосредованное Тклетками демиелинизирующее заболевание СимНедавно различные антитела к МБР были обптомы ЕАЕ могут быть скорригированы введением наружены во фракции IqG, выделенной из спиномышам синтетических пептидов МБР (Gaur, A et мозговой жидкости больных рассеянным склероal , Science, 258, 1491-1494, 1992) Более того, зом (Warren, К G and Catz, I , J Neurol Sci 96 19введение высоких доз МБР, делетировало ауто27, 1990) Первичные антитела к МБР как в свореактивные Т-клетки и аннулировало клинические бодной, так и в связанной форме оказались свяи патологические симптомы ЕАЕ у мышей (Gntchзанными с активной фазой заболевания F/B>1 у field, J M et al , Science, 263, 1139-1143, 1994) пациентов с острой формой и 0 80г/л) и повышенными титрами анти-МВР же иодинированного материала для того, чтобы (F/B отношение >1 0) Все больные имели клиниминимизировать вариабельность результатов мечески определенное заболевание жду опытами IgG был выделен из концентрированной спинОчищенные анти-МВР были полностью нейномозговой жидкости больных с острым рассеянтрализованы МБР и пептидами МБР 80-97, МБР ным склерозом на протеин А-сефарозе 91-106, и МБР 75-95 и были частично нейтрализо(Pharmacia™) аффинной хроматографией, как ваны пептидами МБР 64-78, МБР 69-83 и МБР 61описано ранее (Warren, К G , and Catz, I J Neurol 75 (Табл 1 и Фиг 2) Оставшиеся 12 пептидов не Sci 96 19-27, 1990) Чистота каждого препарата нейтрализовали очищенные анти-МВР, и их кинеIgG проверялась электрофорезом в полиакрила 55375 18 17 тические кривые показывают спад в пределах заизображения, данные контроля не приведены) штрихованной области, см фиг 2 Гистон тимуса Контрольные образцу показывают обоснованность теленка и альбумин сыворотки человека не реагиподхода в отношении нейтрализации, так как кажровали с очищенными анти-МВР даже при концендое контрольное антитело было абсолютно нейтрациях выше 10ООнг Клон 26 ингибировался трализовано выбранным пептидом и никакими только пептидом МБР 64-78 R 155 ингибировался другими Это показывает, что специфичность только пептидом МБР 1-8 Клон 16 не реагировал взаимодействия имеет место даже при высоких ни с МБР, ни с другими пептидами (для чистоты концентрациях пептидов (10 ОООнг) Таблица 1 Номер пептида 7 38 8 39 40 41 20 16 27 21 56 12 15 6 42 43 2 44 Последовательность МБР человека 1-8 Су Су 4-18 Су 11-24 18-32 26-40 Су 35-58 Су 51-64 Gly Су 64-78 Су 61-75 Су 69-83 Су 75-95 Су 80-97 Gly Су 91-106 117-129 Су 127-140 Су 136-149 141-155 Су 149-162 Взаимодействие анти МБР + + + ++ ++ ++ ++ - полная нейтрализация, + - частичная нейтрализация, - - незначительная нейтрализация Анти-МВР, полученные от 7 разных больных были полностью нейтрализованы МБР человека и пептидами МБР 80-97, МБР 91-106 и МБР 75-95 (см фигЗ, как иллюстрацию) Поскольку полученное от отдельных пациентов количество антител было ограничено, анти-МВР не подвергали реакции с остальными 15 пептидами Как указано выше, анти-МВР были нейтрализованы пептидами, соответствующими промежутку между 61-106 аминокислотными остатками Пептиды, которые не нейтрализовали анти-МВР, охватывают амино-концевой (примерно от 1 до 63 остатков) и карбокси-концевой (примерно от 117 до 162 остатка) участки МБР человека Повидимому, пептиды от различных не перекрывающихся участков МБР нейтрализуют одни и те же антитела Это может объясняться тем, что антитела узнают прерывистый эпитоп, содержащий аминогруппы различных участков Подобный факт ранее наблюдался Hruby et al (Hruby, S , Alvord, E С , Groome, N P et al, Molec Immun 24 1359-1364, 1987), который показал, что крысиное моноклональное антитело имеет основной эпитоп в последовательности МБР 112-121, и в то время сильную перекрестную реактивность с другим эпитопом 39-91 Это более вероятно, чем возможность того, что антитело имеет перекрестную реактивность по отношению к двум совершенно различным последовательностям, которые не образуют прерывистого эпитопа (Hruby, S , Alvord, Е С , Alvord, Е С , Marteuson R E et al , J Neurochem 44 637-650, 1985) Данные по нейтрализации могут быть объяснены способностью пептидов, соответствующих различным участкам МБР, частично занимать связывающую область антитела, взаимодействуя с различными аминокислотами в боковых цепях Это объяснение подтверждается тем наблюдением, что пептиды, обеспечивающие полное ингибирование (МБР 8097, МБР 91-106 и МБР 75-95), приблизительно в 100 раз менее эффективны в молярном отношении, чем интактный МБР Исходя из вышеизложенной гипотезы, это могло быть обусловлено тем, что каждый пептидный клон не способен достичь энергии связывания с действительным эпитопом МБР Пример 2 Нейтрализация или модулирование образования антител к МБР человека, in vivo Подбор больных и контрольные исследования Больные, которых подобрали для данного исследовательского проекта, наблюдались в клинике по уходу и исследованию больных рассеянным склерозом Университета Альберты, Эдмонтон, Канада Пациенты были продиагностированы как больные рассеянным склерозом по критерию Шумахера (1965) с подтверждением диагноза методом получения изображения мозга с помощью магнитного резонанса и/или иммунохимическими профилями спинномозговой жидкости (CSF) Для 19 55375 того, чтобы проиллюстрировать, что при хронически прогрессирующем рассеянном склерозе (MS) уровень анти-МВР устойчиво повышен в течение продолжительных периодов времени, от месяцев до нескольких лет, у больных повторно брали пункции CSF поясничного отдела с контролем свободных и связанных анти-МВР У больных с хронически прогрессирующим заболеванием (MS) уровень аутоантител остается устойчиво повышенным в течение 11, лет и спонтанного спада уровня анти-МВР не происходит (фиг 14 как иллюстрирующий пример) Для того чтобы определить, что изначально повышенные уровни анти-МВР в спиномозговой жидкости (CSF) оставались относительно постоянными в течение 24 часов, у двух больных (1F56 и ЗМ66) брали образцы CSF каждые 30 мин в течение 2 часов так же, как 24-мя часами позже, с контролированием свободной и связанной форм анти-МВР (фиг5А и 5В соответственно) Больные 1F56 и ЗМ66 служили в качестве временных контролей Уровни свободных и связанных анти-МВР оставались неизменно повышенными при исследованиях CSF каждые 30 мин в течение 2-х часов так же, как и спустя 24 часа Кроме того, подобным образом был определен эффект введения 5см3 физиологического раствора в спинномозговую жидкость двум другим больным (4М45 и 5М59) (фиг5С и 5Д соответственно) Эти больные служили в качестве временных контролей с физиологическим раствором При введении 5см 3 физиологического раствора внутриоболочечно уровни F и В анти-МВР оставались повышенными по сравнению с базовым уровнем, когда образцы CSF исследовались, как описано выше, подтверждая таким образом, что «эффект разведения» на титры анти-МВР был незначительным Уровни анти-МВР определяли твердофазным радиоиммунологическим анализом с МБР человека, адсорбированным в лунках панели для микротитрования «Иммунлон» Лунки покрывали ЮОмкл МБР в концентрации 10мкг/мл (1мкг/лунку) и инкубировали в течение ночи при 37°С После нанесения BSA и трехкратного отмывания водой, панели выдерживались при комнатной температуре Образцы (ЮОмкл) CSF или экстракта ткани, растворенные в 0 010 г lgG/л (0 01 М PBS буфер, 0 05% Твин 20), инкубировали в МБР-покрытых ячейках в течение 1-2 часов при комнатной температуре После пяти отмываний буфером (0 01 М PBS, 0 05% Твин 20), ячейки инкубировали с антителами козы к IgG-Fc кролика (0 01 М PBS, 0 05% Твин 20, 0 5% BSA) в течение 1 часа при комнатной температуре и затем отмывали, как описано выше Наконец, добавляли меченый 1251-протеин А (или 1251-протеин G) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре Когда в качестве метки использовали 1251-протеин G, BSA в буфере для исследований и для процедуры истощения заменяли на овальбумин После трехкратного завершающего отмывания водой лунки обсчитывали индивидуально Результаты, выраженные в единицах радиоактивности, представляли следующим образом (счет образца - счет контроля) -ь (общий счет радиоактивности - счет контроля) Все образ 20 цы исследовали в 10 повторах, и время счета составляло 10 мин для того, чтобы зарегистрировать > 10000 единиц радиоактивности в каждом положительном образце Перед исследованием все образцы CSF и/или образцы ткани разводили до конечной концентрации IgG 0 010г/л Свободные (F) анти-МВР определяли непосредственно в CSF или тканевом экстракте, тогда как уровни связанных антител определяли после кислотного гидролиза иммунных комплексов Неспецифичное связывание наблюдалось для каждого образца в непокрытых лунках С целью локализации эпитопа синтетические пептиды сначала подвергали взаимодействию с очищенными антителами в жидкофазном конкурентном исследовании, после чего анти-МВР определяли радиоиммунологическим анализом во всех конечных смесях Результаты анализов конкурентного связывания и радиоиммуноанализа выражали как % ингибирования синтетического пептида, определенный как 100 единиц радиоактивности Пробы исследовались в 10 повторах и обсчитывались в течение Юмин на LKB1275 Mimgamma-счетчике Объединенные выделенные из ткани анти-МВР использовались в 5 предварительно приготовленных разведениях в качестве позитивных контролен CSF, собранная от больных с не неврологическими заболеваниями, служила негативным контролем Воспроизводимость исследований составляла от 3% до 5%, а разброс данных менее 7% Определение постоянной повышенных уровней анти-МВР в CSF в контрольных экспериментах составило следующую стадию исследования Контрольный «слепой» эксперимент фазы I с дублированным пептидом-внутриоболочечная инъекция Проводят фазу 1 эксперимента по определению действия синтетического пептида МБР 75-95 на титры F и В анти-МВР в спиномозговой жидкости После утверждения в Научном Совете по этике Университета Альберты проект был осуществлен при участии больных с клинически установленным диагнозом рассеянного склероза (MS) (Schumacher et al, Ann NY Acad Sci , 122, 552-568, 1965), тяжелобольных инвалидов с сильно прогрессирующим заболеванием Четырнадцать больных согласились добровольно участвовать в этом исследовании, 8 больных были отобраны по начальному титру F анти-МВР в CSF (около 8 единиц радиоактивности) (Табл 2) для получения одной внутриоболочечной инъекции либо пептидов МБР 75-95, которые связывают анти-МВР in vitro, либо не связывающего контрольного пептида МБР 35-58 (Warren and Catz, 1993 b) Эксперимент проводили методом двойного «слепого» варианта, когда ни исследователи, ни испытуемые не знали природы вводимого вещества Все пептиды были закодированы семью наугад выбранными однозначными номерами посторонним врачом Парные пептиды, растворенные в 5см 3 физиологического раствора и введенные в CSF путем поясничной пункции, использовались в возрастающих дозах (1, 2 5, 5 и 10мг) CSF исследовалась до инъекции (базовая линия), с 30 минутными интервалами в течение 2 55375 22 21 часов после инъекции, 24 часами позже и затем с белок, глюкоза, уровни IgG и альбумина были оппредельным интервалом в течение 3-4 недель до ределены во всех образцах CSF Уровни свободтех пор, пока уровни анти-МВР не вернулись к ных и связанных анти-МВР определяли радиоимбазовому (исходному) Подсчет клеток, общий муноанализом, как описано выше Таблица 2 Номер больно- Период болезни го, пол, возраст (годы) 1F56 2М50 ЗМ66 4М45 5М59 6F53 7F33 8М41 9М49 10F38 11М49 12М35 13F43 14F32 10 18 20 21 28 19 11 8 7 7 20 12 15 4 EDSS Куртцке 8 5-Триплегия 6-Парапарез 9-Квадриплегия 9-Квадриплегия 9-Квадриплегия 9-Квадриплегия 6-Парапарез, атаксия 8-Триплегия 7-Парапарез 8 5-Параплегия 8-Триплегия 6 5-Парапарез, атаксия 8-Параплегия 6-Парапарез, атаксия Табл 2 Клинические данные и уровни антиМВР в CSF у 14 больных с хронически прогрессирующим рассеянным склерозом (MS), давших согласие участвовать в фазе I научного исследования, предусматривающего внутриоболочечную однократную инъекцию синтетических пептидов МБР Поскольку был необходим исходно высокий уровень свободных (F) анти-МВР (>8 единиц радиоактивности) для того, чтобы получить значительное постинъекционное изменение, для исследования было отобрано только 8 из 14 больных Все пептиды, используемые в данных исследованиях, синтезировались под кодом «продукт хорошего качества» (GMP) на основе Fmoc (9метоксикарбонил) метода Procyon Inc (L Ontario, Canada) Чистоту пептидов контролировали жидкостной обратнофазовой хроматографией на колонке С18 при водно-ацетонитрильном градиенте, содержащем 0 1 % ТХУ Масс спектроскопия и аминокислотный анализ выполнялся на основе стандартных методик Перед введением все пептиды тестировались на пирогенность (Ванкуверский Генеральный госпиталь, Ванкувер, Канада), стерильность (местная лаборатория Общественного Здравоохранения Северной Альберты, Эдмонтон, Канада) и острую токсичность (Служба Лаборатория медицинских исследований Университета Альберты, Канада) Было показано, что они «пригодны» для введения людям Соответствующие количества закодированных синтетических пептидов растворяли в 5см3 стерильного физиологического раствора (0 9% NaCI, инъекция USP, апирогенный, Baxter Corp, Toronto, Canada) фильтровали 2 раза через стерилизующую мембрану с размером пор 0 22мкм (Millex-GX, Milhpore Corp , Bedford, M A, USA) и вводили в спинномозговую жидкость (CSF) путем поясничной инъекции Сравнительные (между пациентами) исследования пептидов Больные 6F33, 8М41, 4М45 и 1F56 получали Анти-МВР CSF (единицы раОтобраны для диоактивности) исследования F В 9 10 Да 2 10 Нет 11 12 Да 10 11 Да 8 10 Да 10 9 Да 5 13 Нет 9 12 Да 5 10 Нет 11 10 Да 6 13 Нет 7 12 Нет 9 10 Да 8 7 Нет синтетический пептид МБР 75-95, способный связывать анти-МВР in vitro, а пациенты 10F36, 13F43, 5М59 и ЗМ66 получали «контрольный» несвязывающий синтетический пептид МБР 35-58 в возрастающих дозах 1, 2 5, 5 и 10мг соответственно (фиг 6) У больного 6F53 (фигбВ), который получил 1 мг МБР 75-95, наблюдалось 75% уменьшение свободных анти-МВР с немедленным возвращением их к исходному уровню, у больного 8М41 (фиг 6D), который получил 2 5мг МБР 75-95, наблюдались полное связывание-нейтрализация свободных анти-МВР, а затем их уровень вернулся к исходному через 24 часа, у больного 4М45 (фигбР), которому ввели 5мг МБР 75-95, произошли резкое и полное связываниенейтрализация свободных анти-МВР, что продолжалось в течение 7 дней с возвратом к исходному уровню, как было установлено, спустя 21 день, у больного 1F56 (фиг 6Н), которому ввели 10мг МБР 75-95, также произошли полное связываниенейтрализация свободных анти-МВР, что продолжалось в течение 7 дней и затем уровень антител, вернулся к исходным значениям, как было установлено, в период с 14 по 28 день Уровни связанных анти-МВР несущественно изменялись при однократном внутриоболочечном введении МБР 75-95 У больных 10F38, 13F43, 5М59 и ЗМ66, которым было введено соответственно 1, 2 5, 5 и 10мг контрольного несвязывающего пептида МБР 35-58, уровни свободных и связанных антител в CSF оставались измененными по отношению к исходному в течение 24 часов эксперимента (фигбА, 6С, 6Е и 6G соответственно) Традиционные CSF-параметры воспаления при MS, такие, как счет клеток, абсолютные уровни общего белка, IgG и альбумина, олигоклональное связывание, индекс IgG и синтез IgG в CNS оставались неизменяемыми до и после введения пептида Сравнительные исследования пептидов ПРИ введении ОДНОМУ пациенту 23 55375 Эти исследования проводились для того, чтобы минимизировать вариабельность результатов полученных исследований нескольких больных У больного 5М59, которому вводили либо физиологический раствор (временный контроль), либо 5мг несвязывающего пептида МБР 35-58, уровни свободных анти-МВР оставались повышенными относительно исходного уровня во время обоих экспериментов (фиг 7А) Больному 4М45 первоначально вводили физиологический раствор (временный контроль), а двумя месяцами позже ему ввели 5мг МБР 75-95 Уровни свободных больных анти-МВР оставались устойчиво повышенными во всех образцах, собранных во время контрольного эксперимента, и стали необнаруживаемыми после введения МБР 75-95 (фиг 7В) Подобные результаты были получены и у больной 1F56, которая имела устойчиво повышенные уровни свободных антител в течение контрольного эксперимента, а после введения 10мг МБР 7595 ее свободные анти-МВР стали необнаруживаемыми, (фиг7С) Полное исследование было проведено с больным ЗМ66 У него уровни свободных анти-МВР были устойчиво повышенными в течение контрольного эксперимента или при введении 10мг МБР 35-58, однако, когда были введены 10мг МБР 75-95, свободные анти-МВР были полностью нейтрализованы и не обнаруживались в течение 7 дней (фиг 7D) Повторное введение синтетического пептида МВР 75-95 После установления того, что пептид МВР 7595 нейтрализует свободные анти-МВР in vivo за период, больший, чем 7 суток, было принято решение о повторном введении 10мг МВР 75-95 в спинномозговую жидкость еженедельно в течение 10 недель Этот эксперимент был проведен с участием трех больных с прогрессирующим рассеянным склерозом (MS), которые не участвовали в эксперименте по однократному введению пептидов и дали согласие на это исследование Свободные и связанные анти-МВР определялись за 12 недели до первого введения, до и после 30 мин после каждой инъекции и вновь спустя 1 и 2 месяца после последней инъекции Счет клеток, общий белок, глюкозу, IgG и альбумин определяли во всех образцах CSF, полученных перед каждой из 10 инъекций Перед первой и после последней инъекции отбирали кровь и анализировали содержание электролитов, креатинина, ферментов сердца и печени и гематологические показатели Когда больные хронически прогрессирующей формой рассеянного склероза (MS) получали повторные внутриоболочечные инъекции 10мг МВР 75-95 с недельным интервалом (в течение периода до 10 недель), первоначально высокий уровень свободных анти-МВР мог становиться необнаруживаемым, пока вводился пептид, когда пептид прекращали вводить, уровень свободных антиМВР возвращался на исходный в течение 1-2 месяцев (фиг 8) Титры связанных антител оставались устойчиво повышенными на протяжении всего эксперимента Больные, которые участвовали в этих исследованиях и которые получали либо однократные инъекции синтетических пептидов, либо повто 24 ряемые еженедельно инъекции, имели хронически прогрессирующий рассеянный склероз с повышенной степенью неврологических повреждений Ни один из этих больных не сообщил об ухудшении неврологических симптомов или об обострениях болезни (MS), последовавших в результате внугриоболочечного введения пептидов, и клеточная реакция в CSF не развивалась Больные, получавшие повторные введения МВР 75-95 контролировались на развитие возможных соматических осложнений, включая изменения электролитов, так же и дисфункцию сердца, печени, почек и гематологические изменения, и никаких нежелательных осложнений не было выявлено Внутривенное ведение МВР 75-95 После установления того факта, что внутриоболочечное введение пептида МВР 75-95 приводит к связыванию свободных анти-МВР без изменения уровня связанных антител, было решено определить влияние внутривенного введения того же пептида на титры в CSF свободных и связанных анти-МВР, 500 мг МВР 75-95 растворяли в 100см3 физиологического раствора и вводили внутривенно спустя ЗОмин больному 8М41 при постоянном контроле анти-МВР в CSF каждые 30 мин в течение первых двух часов, 18 часов спустя и 10, 16 и 30 дней спустя Кровь отбирали перед инъекцией, а также через 16 и 30 дней и анализировали на содержание электролитов, креатинина сердечных и печеночных ферментов и гематологические показатели В спинномозговой жидкости определяли количество клеток, общий белок, глюкозу, содержание IgG и альбумина Как показано на фиг 8, внутривенное введение 500 мг МВР 7595 не дает никаких изменений в уровнях титров связанных и свободных анти-МВР в CSF на протяжении первых двух часов, 30%-ное падение уровня свободных анти-МВР в CSF наблюдалось через 18 часов Когда CSF повторно подвергалась анализу через 10, 16 и 30 дней, уровни свободных и связанных анти-МВР опускались ниже исходного с 11 единиц радиоактивности до 4, 2 и 1 радиоактивных единиц соответственно При повторных наблюдениях у пациентов с внутриоболочечными инъекциями МВР часто наблюдалась устойчивость повышенных уровней связанных антител, тогда как свободные антиМВР были необнаруживаемыми после внутриоболочечной инъекции МВР 75-95 Это свидетельствует о том, что воспалительный процесс, вызванный аутоантителами к МВР, остается активным во время и после внутриоболочечного введения МВР 75-95 Для подтверждения этого наблюдения МВР 75-95 был введен внутривенно пациенту, который предварительно получил внутриоболочечную инъекцию пептида После внутривенного введения уровни и свободных и связанных антител в CSF значительно снижались при наблюдении в течение месяца Снижение, как свободных, так и связанных антител CSF после внутривенного введения МБР 75-95 означает, что имеет место снижающая регуляция аутоиммунного воспалительного процесса, ответственного за синтез антиМВР МВР эпитоп для анти-МВР при MS Для определения локализации МВР эпитопа 25 для анти-МВР при MS свободные и связанные анти-МВР, очищенные аффинной хроматографией из CSF и ткани мозга больных рассеянным склерозом (MS) (Warren К G , et al , Arm Neurol 35, 280-283, 1994), подвергали взаимодействию в исследованиях по конкурентному ингибированию с 41 последовательным синтетическим пептидом МБР равной длины (каждый пептид состоит из 10 остатков и перекрывает соседний на 9 остатков), занимающих участок между 61 и 110 остатками МБР человека Было установлено, что пептид(ы), обеспечивающие максимальное ингибирование, наиболее прочно соединяются с антигенсвязывающей областью антитела Максимальное ингибирование (>80%) очищенных свободных и связанных анти-МВР из ткани мозга больного рассеянным склерозом (фиг 10) обеспечивалось четырьмя декапептидами, обозначенными МБР 84-93, МБР 85-94, МБР 86-95 и МБР 87-96, позволяя предположить, что эпитоп МБР для анти-МВР локализован между 84 и 96 остатками Минимальный участок общих аминокислотных остатков находится между 87 и 93 остатком Связанные антитела имеют более ограниченную направленность, чем свободные антитела Роль антител к анти-МВР в патогенезе демиелинизации при рассеянном склерозе еще не установлена и может единственно быть определена модулированием анти-МВР in vivo и последовательным наблюдением за клиническими и патологическими проявлениями Например, во время острых стадий MS, когда отношение свободных и связанных антител выше 1, пептид, который известен как связывающий свободные анти-МВР, может быть введен внугриоболочечно для того, чтобы связать свободно циркулирующие антитела и скорригировать клинические симптомы острого рецидива, еженедельное введение может быть необходимо до наступления ремиссии Для больных с хронически прогрессирующим заболеванием внутривенное введение пептида, так же, как и внутриоболочечное ведение может быть необходимо для регулирования механизмов воспаления, которые вызваны анти-МВР Различные модификации предпочтительных вариантов осуществления изобретения могут быть выполнены без ограничений объема изобретения, который охватывается приведенными ниже пунктами формулы ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ (1) GENERAL INFORMATION 55375 26 (і) APPLICANT The Governors of the University of Alberta (и) TITLE OF INVENTION PEPTIDE SPECIFICITY OF ANTI-MYELIN BASIC PROTEIN AND THE ADMINISTRATION OF MYELIN BASIC PROTEIN PEPTIDES TO MULTIPLE SCLEROSIS PATIENTS (MI) NUMBER OF SEQUENCES 1 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS (A) ADDRESSEE Cowling, Strath у & Henderson (B) STREET 160 Elgin Street (C) CITY Ottawa (D) STATE Ontario (E) COUNTRY Canada (F)ZIP KIP1C3 (v) COMPUTER READABLE FORM (A) MEDIUM TYPE Floppy disk (B) COMPUTER IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE Patentln Release #1 0, Version #1 25 (vi) CURRENT APPLICATION DATA (A) APPLICATION NUMBER (B) FILING DATE (C) CLASSIFICATION (VII) PRIOR APPLICATION DATA (A) APPLICATION NUMBER US 08/327,351 (B) FILING DATE 21-OCT-1994 (VIM) ATTORNEY/AGENT INFORMATION (A) NAME Judy A Erratt (B) REGISTRATION NUMBER 4,068 (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER 08859459WO1 (їх) TELECOMMUNICATION INFORMATION (A) T E L E P H O N E (613)233-1781 (B) TELEFAX (613)563-9869 (C) TELEX (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO 1 (i) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА 170 аминокислот (B) ТИП аминокислотная (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (II) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП белок (vi) НЕПОСРЕДСТВЕННЫЙ ИСТОЧНИК (A) ОРГАНИЗМ homo sapiens (VII) НЕПОСРЕДСТВЕННЫЙ ИСТОЧНИК (B) КЛОН основной миелиновый белок человека (XI) СТРУКТУРА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQIDNO 1 27 55375 28 Ala Ser Gin Lys Arg Pro Ser Gin Arg His Gly Ser Lys Tyr Leu Ala 1 5 10 15 Thr Ala Ser Thr Hot Asp His Ala Arg His Gly Phe Leu Pro Arg His 20 25 30 Arg Asp Thr Gly H e Leu Asp Ser lie Gly Arg Phe Phe Gly Gly Asp 35 40 45 Arg Gly Ala Pro Lys Arg Gly Ser Gly Lys Asp Ser His His Pro Ala 50 55 60 Arg Thr Ala His Tyr Sly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly Arg Thr 63 70 75 80 Gin &sp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lie Val Thr Pro 85 90 95 Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lvs Gly Arg Sly Leu Ser Leu Ser 100 105 110 Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gin Arg Pro Gly Phe Gly Tyr Gly 115 120 125 Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val 130 135 140 Asp Ala Gin Gly Thr Leu Ser Lys H e Phe Lys Lau Gly Gly Ara Asp 145 150 15S 150 Ser Arg Ser Gly Ser Pro Met Ala Arg Arg 165 170 29 ЗО 55375 NH, су ю: 20: 38 зо 40 40 су 41 ,су 50 20 60 су 70 16 1су 21 су 80 90 су 27 су 56 12 100 15 110 120 су 130 42 140 су 43 150 44 180 170 і СООН Фиг. 1 10Ch 80 МВР 75-95 МБР МБР 80-97 6 0 МБР 91-106 40 МВР 69-83 МВР 61-73 8Р 64-78 20 0 Ю 100 100 1000 Фиг. 2 ЮООМГМВР 10,000иг СШТЄТНЧЙ ЖШ шіггіщ 31 55375 32 ю с -1ВР80-97 о S 2 60 л л МБ РЭ^-Ю MBP75-~ 4020& 100 1000 10 100 1 0 0 0 И Г М В Р 1 U,UUU ЧГ синтетический пептид Фиг. 3 4М45 & 1-Ю VJ 1 ) о о 15 о о о *• Г~І о І о О о оо оо о о о о о О о о о оо |о I -гт~т М І М І г" —-д —а -«С ! і ! Г 111 СЗ , S 1986 ФИГ. 4 1F56 750В-1 $ 5272H o—-c—o a S S 26364 о 1 I t *1 [U J^J Временной контроль 0 Ih Фіг. 5А і 2h * 24h „^ 33 55375 34 3M65 15 , 1 0 -5 га Временной контроль "-О th 24h Время Фиг. 5В 4М45 I 4873 а I 2436 Фнз раствор 0 J 1 11 1 > 2tl 24ЇІ Фиг. 5С -15 -10 Физ раствор 1h 2fi 24h Время Фиг. 5D § со СП Анти-МВР (срт) Анти-МВР ( с р т ) СП -п ел со ro CO to I L т CO •fe. CO an с о -a 3 со ~~> e .en со CD CO ro О со cn en 1 J ^, -1- ІГ - г C O ся tn P 4 V .о О •n it CO m en en CO b WZ/ШШ, С5 ro J Анти-МБР (единицы радиоактивности) со со 37 55375 38 8M41 15 -10 f G і -5 -91 d 0 Hi 2h 12h 24h 7d Фиг. 6D 5М5Э 7485-1 48 90 29 4S MP 3 - 3 B 55 5 MT -5cd 0 1 h 24h Время Фиг. 6Е 4M4S ,-15 -10 Анти-МВР (cpm) о 1 от со ев 03 со Анти-МВР (ерш) Ж СП СП со СП СП со О) О ш. W •о C D ТЗ (В ГО ^ — ~ S Анти-МВР (единицы радиоактивности) Анти-МВР (единицы радиоактивности) \кти МБР (cpm) АНТЙ-МВР (cpm) Анти-МВР (единицы радиоактивности) АНЇИ-МВР (cpm) о б п в ^1 о о п о' в s ГО СП СП со о' о' Р о о \ О Анти-МВР (единицы радиоактивности) Лнти МВР {едшищы рвлиоактивностн) Анти-МВР (единицы радиоактивности) 43 55375 12 • і I 8 8 8 ' 10 44 r I. # Минуты , ^ 0 З 69і S Ш'§ їв О C J ? Ш 7-5 Р 59 Фиг. 9 F Лати МВР В Анти-МВР Фиг. 10 Підписано до друку 05 05 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24