Сполуки, що мають активність по відношенню до рецепторів кальцію

1 Соединения общей формулы где Аг5 - нафтил или фенил, необязательно замещенный 0-5 заместителями, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из низшего алкила, галогена, низшего алкокси, низшего тиоалкила, метилендиокси, низшего алкилгалогенида, низшего алкоксигалогенида, ОН, СНгОН, CONH2, CN, ацетокси, бензила, бензилокси, а а ' ~диметилбензила, NO2, CHO, СН3СН(ОН), ацетила, этилендиокси, -СН=СН-фенила, Агб - фенил, замещенный 1-5 заместителями, каждый из которых выбран независимо из группы, состоящей из ацетила, низшего алкила, галогена, низшего алкокси, низшего тиоалкила, метилендиокси, низшего алкилгалогенида, низшего алкоксигалогенида, ОН, СН2ОН, CONH2, CN, карбометокси, ОСН2С(О)С2Н5 и ОСН2С(О)ОС2Н5 и ацетокси, при этом по меньшей мере одним из заместителей является ОСН2С(О)ОС2Н5, Rn - водород или метил, и R-I2 - водород или метил, при этом по меньшей мере один из Rn и R-I2 является метилом, или их фармацевтически приемлемые соли или комплексы 2 Соединение по п 1, где Агб - это замещенный фенил, содержащий заместителем ОСН2С(О)ОС2Нб в мета позиции 3 Соединение, выбранное из группы, состоящей из 21S ((^-М-(3-(2-хпорфенил)пропил)-1 -(3пропоксифенил)этиламина), 21Т (^)-^(3-(2-хлорфенил)пропил)-1-(3изопропоксифенил)этиламина), 21U ((^-М-(3-(2-хпорфенил)пропил)-1 -(3изобутоксифенил)этиламина), 21Y (^Л)^-(4-(3-(трифторметил)фенил)-2бутил)-1-(3-метоксифенил)этиламина), 22J (^)-^(3-(3-(трифторметил)фенил)пропил)-1(1-нафтил)этиламина), 23А (^)-^(4-(3-(трифторметокси)фенил)-2бутил)-1-(3-метоксифенил)этиламина), 23Е (^)^-((3-(трифторметокси)фенил)метил)-1(1-нафтил)этиламина), 24В (Г^-((3-метил-4-метоксифенил)метил)-1-(2(трифторметил)фенил)этиламина), 24J (^)-^(3-(3-(трифторметокси)фенил)пропил)1 -(1 -нафтил)этиламина), 24М (^)-^(3-(3,5-дифторфенил)пропил)-1-(3метоксифенил)этиламина), 24V ^-((3-метил-4-метоксифенил)метил)-1-(3(этилацетокси)фенил)этиламина), 24Х (^)-^((3-бром-4-метоксифенил)метил)-1 -(1 нафтил)этиламина), 24Y (^)^-((3-хлор-4-этоксифенил)метил)-1 -(1 нафтил)этиламина), 25С ((3^)-^(4-(3-трифторметил)фенил)-2-бутил) О го Ю ю 55374 1 -(1 -нафтил)этиламина), 25D (^Л)-І\І-(4-(3-трифторметил)фенил)-2-бутил)1-(1-нафтил)этиламина) и 25Е (^)-1\1-(3-фенилпроп-2-ен-1 -ил)-1 -(3метоксифенил)этиламина) или его фармацевтически приемлемых солей или комплексов 4 Соединение по п 3, где упомянутое соединение - это 21Y (^Л)-І\І-(4-(3-(трифторметил)фенил)-2бутил)-1-(3-метоксифенил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 5 Соединение по п 3, где упомянутое соединение - это 22J ((Р)-1\1-(3-(3-(трифторметил)фенил)пропил)-1(1-нафтил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 6 Соединение по п 3, где упомянутое соединение - это 24V (1\1-((3-метил-4-метоксифенил)метил)-1-(3(этилацетокси)фенил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 7 Соединение по п 3, где упомянутое соединение - это 25D (^Л)-І\І-(4-(3-трифторметил)фенил)-2-бутил)1 -(1 -нафтил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 8 Способ ингибирования костной резорбции у пациента, включающий введение упомянутому пациенту терапевтически эффективного количества соединения, выбранного из группы, состоящей из 21S (^)-1\1-(3-(2-хлорфенил)пропил)-1 -(3пропоксифенил)этиламина), 21Т (^)-1\1-(3-(2-хлорфенил)пропил)-1-(3изопропоксифенил)этиламина), 21U (^)-1\1-(3-(2-хлорфенил)пропил)-1 -(3изобутоксифенил)этиламина), 21Y (^Л)-І\І-(4-(3-(трифторметил)фенил)-2бутил)-1-(3-метоксифенил)этиламина), 22J ((Р)-1\1-(3-(3-(трифторметил)фенил)пропил)-1(1-нафтил)этиламина), 23А (^)-І\І-(4-(3-(трифторметокси)фенил)-2бутил)-1-(3-метоксифенил)этиламина), 23Е ((Р)-1\1-((3-(трифторметокси)фенил)метил)-1(1-нафтил)этиламина), 24В (1\1-((3-метил-4-метоксифенил)метил)-1-(2(трифторметил)фенил)этиламина), 24J ((Р)-І\І-(3-(3-(трифторметокси)фенил)пропил)1 -(1 -нафтил)этиламина), 24М (^)-1\1-(3-(3,5-дифторфенил)пропил)-1-(3метоксифенил)этиламина), 24V (1\1-((3-метил-4-метоксифенил)метил)-1-(3(этилацетокси)фенил)этиламина), 24Х (^)-1\1-((3-бром-4-метоксифенил)метил)-1 -(1 нафтил)этиламина), 24Y ((Р)-М-((3-хлор-4-этоксифенил)метил-)-1 -(1 нафтил)этиламина), 25С ((3^)-г\І-(4-(3-трифторметил)фенил)-2-бутил)1 -(1 -нафтил)этиламина), 25D (^Л)-І\І-(4-(3-трифторметил)фенил)-2-бутил)1-(1-нафтил)этиламина) и 25Е (^)-1\1-(3-фенилпроп-2-ен-1 -ил)-1 -(3метоксифенил)этиламина) или его фармацевтически приемлемых солей или комплексов 9 Соединения общей формулы где Агз - нафтил или фенил, необязательно замещенный 0-5 заместителями, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из низшего алкила, галогена, низшего алкокси, низшего тиоалкила, метилендиокси, низшего алкилгалогенида, низшего алкоксигалогенида, ОН, СЬЬОН, CONH2, CN, ацетокси, бензила, бензилокси, диметилбензила, NO2, CHO, СН3СН(ОН), N(CH3)2, ацетила, этилендиокси, Аг4 - нафтил или фенил, необязательно замещенный 0-5 заместителями, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из низшего алкила, галогена, низшего алкокси, низшего тиоалкила, метилендиокси, низшего алкилгалогенида, низшего алкоксигалогенида, ОН, СН2ОН, CONH2, CN и ацетокси, при этом, если Аг4 является 3-метоксифенилом, то Агз является замещенным фенилом, который не есть 2-метокси, 3-метилом, 2-метилом, 4-метилом, 2,4-диметилом, 2,4,6-триметилом или 4изопропилом, и если Аг4 является незамещенным фенилом, то Агз является замещенным фенилом, который не есть 2-нитрофенилом, 4нитрофенилом или 4-диметиламинофенилом, Rs - водород или фенил, Rg - водород или метил, и Rio - водород, метил или фенил, или их фармацевтически приемлемые соли или комплексы 10 Соединение по п 3, где упомянутое соединение - это 21S (^)-1\1-(3-(2-хлорфенил)пропил)-1 -(3пропоксифенил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 11 Соединение по п 3, где упомянутое соединение - это 21Т (^)-1\1-(3-(2-хлорфенил)пропил)-1-(3изопропоксифенил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 12 Соединение по п 3, где упомянутое соединение - это 21U (^)-1\1-(3-(2-хлорфенил)пропил)-1 -(3изобутоксифенил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 13 Соединение по п 3, где упомянутое соединение - это 23А (^)-І\І-(4-(3-(трифторметокси)фенил)-2бутил)-1-(3-метоксифенил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 14 Соединение по п 3, где упомянутое соедине 55374 ниє - это 24В (І\І-((3-метил-4-метоксифенил)метил)-1-(2(трифторметил)фенил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 15 Соединение по п 3, где упомянутое соединение - это 23Е ((Р)-1\1-((3-(трифторметокси)фенил)метил)-1(1-нафтил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 16 Соединение по п 3, где упомянутое соединение - это 24J ((Р)-І\І-(3-(3-(трифторметокси)фенил)пропил)1 -(1 -нафтил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 17 Соединение по п 3, где упомянутое соединение - это 24М ((Р)-1\1-(3-(3,5-дифторфенил)пропил)-1-(3метоксифенил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 18 Соединение по п 3, где упомянутое соединение - это 24Х ((Р)-1\1-((3-бром-4-метоксифенил)метил)-1 -(1 нафтил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 19 Соединение по п 3, где упомянутое соединение - это 24Y ((Р)-1\1-((3-хлор-4-этоксифенил)метил)-1 -(1 нафтил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 20 Соединение по п 3, где упомянутое соединение - это 25Е ((Р)-1\1-(3-фенилпроп-2-ен-1 -ил)-1 -(3метоксифенил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 21 Способ снижения уровней паратиреоидного гормона у пациента для достижения полезного эффекта, отличающийся тем, что вводят упомянутому пациенту терапевтически эффективное количество соединения, выбранного из группы, состоящей из 21S ((Р)-1\1-(3-(2-хлорфенил)пропил)-1 -(3пропоксифенил)этиламина), 21Т ((Р)-1\1-(3-(2-хлорфенил)пропил)-1-(3изопропоксифенил)этиламина), 21U ((Р)-1\1-(3-(2-хлорфенил)пропил)-1 -(3изобутоксифенил)этиламина), 21Y ((Р,Р)-І\І-(4-(3-(трифторметил)фенил)-2бутил)-1-(3-метоксифенил)этиламина), 22J ((Р)-1\1-(3-(3-(трифторметил)фенил)пропил)-1(1-нафтил)этиламина), 23А ((Р)-І\І-(4-(3-(трифторметокси)фенил)-2бутил)-1-(3-метоксифенил)этиламина), 23Е ((Р)-1\1-((3-(трифторметокси)фенил)метил)-1(1-нафтил)этиламина), 24В (1\1-((3-метил-4-метоксифенил)метил)-1-(2(трифторметил)фенил)этиламина), 24J ((Р)-І\І-(3-(3-(трифторметокси)фенил)пропил)1 -(1 -нафтил)этиламина), 24М ((Р)-1\1-(3-(3,5-дифторфенил)пропил)-1-(3 метоксифенил)этиламина), 24V (|\|-((3-метил-4-метоксифенил)метил)-1-(3(этилацетокси)фенил)этиламина), 24Х ((Р)-|\|-((3-бром-4-метоксифенил)метил)-1 -(1 нафтил)этиламина), 24Y ((Р)-1Ч-((3-хлор-4-этоксифенил)метил)-1 -(1 нафтил)этиламина), 25С ((3,Р)-І\І-(4-(3-трифторметил)фенил)-2-бутил)1 -(1 -нафтил)этиламина), 25D ((Р,Р)-І\І-(4-(3-трифторметил)фенил)-2-бутил)1-(1-нафтил)этиламина) и 25Е ((Р)-1\1-(3-фенилпроп-2-ен-1 -ил)-1 -(3метоксифенил)этиламина) или его фармацевтически приемлемых солей или комплексов 22 Способ по п 21, где упомянутое соединение это 21S ((Р)-1\1-(3-(2-хлорфенил)пропил)-1 -(3пропоксифенил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 23 Способ по п 21, где упомянутое соединение это 21Т ((Р)-1\1-(3-(2-хлорфенил)пропил)-1-(3изопропоксифенил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 24 Способ по п 21, где упомянутое соединение это 21U ((Р)-1\1-(3-(2-хлорфенил)пропил)-1 -(3изобутоксифенил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 25 Способ по п 21, где упомянутое соединение это 21Y ((Р,Р)-І\І-(4-(3-(трифторметил)фенил)-2бутил)-1-(3-метоксифенил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 26 Способ по п 21, где упомянутое соединение это 22J ((Р)-|\|-(3-(3-(трифторметил)фенил)пропил)-1(1-нафтил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 27 Способ по п 21, где упомянутое соединение это 23А ((Р)-І\І-(4-(3-(трифторметокси)фенил)-2бутил)-1-(3-метоксифенил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 28 Способ по п 21, где упомянутое соединение это 23Е ((Р)-|\|-((3-(трифторметокси)фенил)метил)-1(1-нафтил)этиламин или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 29 Способ по п 21, где упомянутое соединение это 24В (|\|-((3-метил-4-метоксифенил)метил)-1-(2(трифторметил)фенил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 30 Способ лечения пациента, имеющего заболевание, выбранное из группы, состоящей из гиперпаратиреоза, болезни Педжета, гиперкальцимиче 55374 8 ского расстройства, остеопороза, гипертензии и почечной остеодистрофии, отличающийся тем, что вводят упомянутому пациенту эффективное количество соединения по любому из пунктов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19, или 20 31 Способ по п 30, где указанное заболевание гиперпаратиреоз 32 Способ по п 30, где указанное заболевание болезнь Педжета 33 Способ по п 30, где указанное заболевание остеопороз 34 Способ по п 30, где указанное заболевание гипертензия 35 Способ по п 30, где указанное заболевание почечная остеодистрофия 36 Способ по п 21, где упомянутое соединение это 24J ((Р)-І\І-(3-(3-(трифторметокси)фенил)пропил)1 -(1 -нафти л)эти л амин или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 37 Способ по п 21, где упомянутое соединение это 24М ((Р)-1\1-(3-(3,5-дифторфенил)пропил)-1-(3метоксифенил)этиламин или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 38 Способ по п 21, где упомянутое соединение это 24V (1\1-((3-метил-4-метоксифенил)метил)-1-(3(этилацетокси)фенил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 39 Способ по п 21, где упомянутое соединение это 24Х ((Р)-1\1-((3-бром-4-метоксифенил)метил)-1 -(1 нафтил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 40 Способ по п 21, где упомянутое соединение это 24Y ((Р)-1\1-((3-хлор-4-этоксифенил)метил)-1 -(1 нафтил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 41 Способ по п 21, где упомянутое соединение это 25С ((3,Р)-І\І-(4-(3-трифторметил)фенил)-2-бутил)1 -(1 -нафтил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 42 Способ по п 21, где упомянутое соединение это 25D ((Р,Р)-І\І-(4-(3-трифторметил)фенил)-2-бутил)1 -(1 -нафтил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 43 Способ по п 21, где упомянутое соединение это 25Е ((Р)-1\1-(3-фенилпроп-2-ен-1 -ил)-1 -(3метоксифенил)этиламин) или его фармацевтически приемлемые соли или комплексы 44 Фармацевтическая композиция, включающая терапевтически эффективное количество соединения по любому из пунктов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 20 и фармацевтически приемлемый носитель 45 Способ лечения пациента, имеющего заболевание или расстройство, характеризующееся аномальной костью и минеральным гомеостазом, отличающийся тем, что вводят упомянутому пациенту терапевтически эффективное количество соединения по любому из пунктов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 46 Соединение по п 9, где Агз - либо нафтил, необязательно замещенный 0-5 заместителями, либо фенил, необязательно замещенный 1-5 заместителями, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из галогена, низшего алкокси, низшего тиоалкила, метилендиокси, низшего алкилгалогенида, низшего алкокси галоген ида, ОН, СН2ОН, CONH2, CN, ацетокси, бензила, бензилокси, диметилбензила, NO2, CHO, СНзСН(ОН), г\І(СНз)2, ацетила и этилендиокси Настоящее изобретение относится к проектированию, разработке, приготовлению и применению соединений, способных управлять одним или несколькими эффектами рецептора неорганического иона Предшествующий уровень Некоторые клетки организма реагируют не только на химические сигналы, но и на ионы, такие как внеклеточные ионы кальция (Са2+) Изменение концентрации внеклеточных ионов кальция (далее в настоящем документе обозначенной [Са2+]) приводит к изменению функциональной реакции этих клеток Один из типов таких специализированных клеток - это клетки паращитовидной железы, выделяющие гормон паращитовидной железы (паратгормон) Паратгормон - это основной эндокринный фактор, регулирующий гомеостаз Са + в крови и внеклеточных жидкостях Паратгормон, воздействуя на клетки костной ткани и почек, вызывает повышение уровня Са 2+ в крови Это повышение [Са2+] действует как сигнал отрицательной обратной связи, приводящий к уменьшению секреции паратгормона Такая взаимная зависимость между [Са2 ] и секрецией паратгормона лежит в основе механизма поддержания гомеостаза Са 2+ в организме Внеклеточный Са 2+ воздействует непосредственно на клетки паращитовидной железы, регулируя секрецию паратгормона Было подтверждено существование на поверхности этих клеток белка, регистрирующего изменения со стороны [Са2+] Brown et al , 366 Nature 574, 1993 В клетках паращитовидной железы этот белок действует как рецептор внеклеточного Са 2+ ("рецептор кальция"), регистрирует изменения со стороны [Са2+] и стимулирует функциональный клеточный ответ - вы 55374 работку паратгормона Внеклеточный Са может влиять на функцию различных клеток, перечисленных в Nemeth et al , 11 Cell Calcium 319, 1990 Влияние внеклеточного Са на парафолликулярные клетки (С-клетки) и клетки паращитовидной железы рассмотрено в Nemeth, 11 Cell Calcium 323, 1990 Было показано, что эти клетки экспрессируют подобный рецептор Са 2+ Brown et al , 366 Nature 574, 1993, Mithal et al , 9 Suppl 1 J Bone and Mineral Res s282, 1994, Rogers et al , 9 Suppl 1 J Bone and Mineral Res s409, 1994, Garrett et al , 9 Suppl 1 J Bone and Mineral Res s409, 1994 Воздействие внеклеточного Са + на костные остеокласты рассмотрено в Zaidi, 10 Bioscience Reports 493, 1990 Кроме того, на увеличение концентрации внеклеточного кальция реагируют кератиноциты, юкстагломерулярные клетки, трофобласты, бета-клетки поджелудочной железы и жировые/адипозные клетки, что, вероятно, является результатом активации рецепторов кальция этих клеток Способность различных соединений имитировать in vitro действие внеклеточного Са 2+ рассмотрена в Nemeth et al, "Calcium-Binding Proteins in Health and Disease," 1987, Academic Press, Inc , pp 33-35 (спермин и спермидин), в Brown et al , 128 Endocrinology 3047, 1991 (например, неомицин), в Chen et al , 5 J Bone and Mineral Res 581, 1990 (дилтиазем и его аналог, ТА-3090) и в Zaidi et al , 167 Biochem Biophys Res Commun 807, 1990 (верапамил) Nemeth et al , PCT/US93/01642, международная публикация № WO 94/18959 и Nemeth et al , PCT/US92/07175, международная публикация № WO 93/04373 описывают различные соединения, модулирующие воздействие неорганического иона на клетку, имеющую рецептор неорганического иона Ссылки, приведенные в этом разделе, не являются предшествующим уровнем Сущность изобретения Настоящим изобретением предложены соединения, способные модулировать один или несколько эффектов рецептора неорганического иона, и способы лечения заболеваний или расстройств при помощи модуляции активности рецептора неорганического иона Предпочтительные соединения способны имитировать или блокировать воздействие внеклеточного кальция на рецептор кальция на поверхности клетки К заболеваниям или расстройствам, которые можно лечить за счет модуляции активности рецептора неорганического иона, относятся один или несколько следующих типов (1) заболевания или расстройства, характеризующиеся нарушением гомеостаза неорганического иона, предпочтительно, гомеостаза кальция, (2) заболевания или расстройства, характеризующиеся изменением количества внеклеточного или внутриклеточного мессенджера, на выработку которого может повлиять активность рецептора неорганического иона, предпочтительно, активность рецептора кальция, (3) заболевания или расстройства, характеризующиеся изменением эффекта (по качеству или по силе) внутриклеточного или внеклеточного мессенджера, которое можно обратить за счет активности рецептора неорганического иона, 10 предпочтительно, активности рецептора кальция, (4) другие заболевания и расстройства, при которых модуляция активности рецептора неорганического иона, предпочтительно, активности рецептора кальция, дает благоприятный эффект, например, заболевания или расстройства, при которых выработка внутриклеточного или внеклеточного мессенджера, стимулируемая активностью рецептора, компенсирует изменение количества другого мессенджера К примерам внеклеточных мессенджеров, на секрецию и/или эффект которых может повлиять модуляция активности рецептора неорганического иона, относятся неорганические ионы, гормоны, нейромедиаторы, факторы роста и хемокины К примерам внутриклеточных мессенджеров относятся цАМФ (сАМР), цГМФ (cGMP), инозиттрифосфат (IP3) и диацил глицерин Так, предпочтительно, соединения, предложенные настоящим изобретением, модулируют активность рецептора кальция и используются для лечения заболеваний или расстройств, на ход которых может повлиять модуляция одного или нескольких эффектов рецептора кальция Белки рецепторов кальция сообщают некоторым специализированным клеткам способность реагировать на изменения внеклеточной концентрации Са 2+ Например, внеклеточный Са 2+ подавляет секрецию паратгормона клетками паращитовидной железы и резорбцию в остеокластах и стимулирует секрецию кальцитонина С-клетками В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, упомянутые соединения используются для лечения заболеваний или расстройств, характеризующихся нарушением костного и минерального гомеостаза, предпочтительно, гомеостаза кальция Внеклеточный Са 2+ управляется гомеостазом и управляет различными процессами, такими как свертывание крови, нервной и мышечной возбудимостью и правильным формированием костей Нарушение гомеостаза кальция характеризуется одним или несколькими следующими проявлениями (1) ненормально низкой или высокой концентрацией кальция в сыворотке, (2) ненормальным увеличением или уменьшением выделения кальция с мочой, (3) ненормально высоким или низким содержанием кальция в костной ткани, например, при измерении минеральной плотности, (4) нарушением усвоения кальция из пищи, (5) ненормально усиленной или ослабленной выработкой и/или высвобождением мессенджеров, влияющих на уровень кальция в сыворотке, таких как паратгормон и кальцитонин, и (6) ненормально измененным ответом на воздействие мессенджеров, влияющих на уровень кальция в сыворотке Это увеличение или уменьшение различных показателей гомеостаза кальция считается ненормальным по сравнению с изменениями, встречающимися в общей популяции, и обычно связаны с заболеванием или расстройством Заболевания или расстройства, характеризующиеся нарушением гомеостаза кальция, могут объясняться различными нарушениями на уровне клетки, например, нарушением активности рецептора кальция, ненормальным количеством рецеп 11 55374 12 торов кальция или нарушением со стороны внутВ предпочтительном случае соединение возриклеточного белка, на который воздействует редействует на один или несколько эффектов рецептор кальция Например, в клетках паращитоцептора кальция Кальцимиметики - это иономивидной железы рецептор кальция связан с белком метики, воздействующие на один или несколько G,, который, в свою очередь, подавляет выработку эффектов рецептора кальция и связывающиеся с циклического АМФ Дефекты в белке G, могут порецептором кальция влиять на его способность подавлять выработку Ионолитики - это соединения, связывающиеся цАМФ с рецептором неорганического иона и блокирующие (например, подавляющие или ослабляющие) Таким образом, первый аспект настоящего один или несколько эффектов, которые дает неоризобретения - соединения, модулирующие рецепганический ион в области рецептора неорганичетор неорганического иона, которые соответствуют ского иона, В предпочтительном случае соединеформуле ние воздействует на один или несколько СТРУКТУРА I эффектов рецептора кальция Кальцилитики - это ионолитики, блокирующие один или несколько N. .АГ, эффектов рецептора кальция, вызванных действием внеклеточного кальция, и связывающиеся с рецептором кальция н R СН, где An - это либо нафтил, либо фенил, необязательно замещенный 0-5 заместителями, каждый из которых выбран независимо из группы, состоящей из низшего алкила, галогена, низшего алкоксила, низшего тиоалкила, метилен диоксила, низшего алкилгалогенида, низшего алкоксилгалогенида, ОН, СН2ОН, CONH2, CN, ацетоксила, г\І(СНз)2, фенила, феноксила, бензила, бензилоксила, а,а-диметилбензила, NO2, CHO, СНзСН(ОН), ацетила, этилен диоксила, Аг2 - это либо нафтил, либо фенил, необязательно замещенный 0-5 заместителями, каждый из которых выбран независимо из группы, состоящей из низшего алкила, галогена, низшего алкоксила, низшего тиоалкила, метилен диоксила, низшего алкилгалогенида, низшего алкоксилгалогенида, ОН, СН2ОН, CONH2, CN и ацетоксила, q - это 0, 1, 2 или 3, и R - это либо Н, либо низший алкил, и их фармацевтически приемлемые соли и комплексы Соединения, предложенные настоящим изобретением, имеют предпочтительную стереохимию Группа СНз в структуре I находится в хиральном центре и создает a-(R)-метил о вую структуру Когда R - это СНз, то R структуры I также находится в хиральном центре, за счет чего образуется ^)-метиловая структура Таким образом, если R - это СНз, то соединение, представленное структурой I, имеет стереохимию (R,R) Эффекты рецептора неорганического иона это процессы, развивающиеся в результате активации рецептора неорганического иона К этим процессам относится синтез молекул, способных действовать как внутриклеточные или внеклеточные мессенджеры К веществам, модулирующим рецепторы неорганических ионов, относятся иономиметики, ионолитики, кальцимиметики и кальцилитики Иономиметики - это соединения, связывающиеся с рецептором неорганического иона и имитирующие (стимулирующие или потенцирующие) воздействие неорганического иона на рецептор неорганического иона Иономиметики и ионолитики могут связываться с тем же местом рецептора, с которым связывается лиганд самого неорганического иона, или с другим местом связывания (например, аллостерическим местом) Например, связывание NPS R467 с рецептором кальция стимулирует активность рецептора кальция и, следовательно, NPS R-467 можно отнести к кальцимиметикам Однако, NPS R-467 связывается с рецептором кальция не на том месте, на котором связывается внеклеточный кальций (т е на аллостерическом месте) Меру эффективности соединения можно определить посредством расчета ECso или ICso для этого соединения ЕС50 - это концентрация соединения, обеспечивающая пятьдесят процентов максимального имитирующего эффекта ICso - это концентрация соединения, обеспечивающая пятьдесят процентов максимального блокирующего эффекта ЕС50 и ICso для соединений на рецепторе кальция можно определить посредством оценки одного или нескольких эффектов внеклеточного кальция на рецепторе кальция Примеры экспериментов по определению ЕС50 и IC50 описаны в Nemeth et al , PCT/US93/01642, международная публикация № WO 94/18959 и Nemeth et al , PCT/US92/07175, международная публикация № WO 93/04373 (обе эти публикации включены в настоящий документ посредством ссылки) и ниже К этим экспериментам относятся эксперименты по экспрессии в овоцитах и по измерению увеличения внутриклеточной концентрации ионов кальция ([Са2+],), обусловленного активностью рецептора кальция Соединения, модулирующие рецептор неорганического иона, в предпочтительном случае избирательно воздействует на активность рецептора неорганического иона в определенной клетке Например, избирательность воздействия на активность рецептора кальция обеспечивается за счет того, что соединение в данной концентрации сильнее воздействует на активность рецепторов кальция в клетках одного типа, чем на эту активность в клетках другого типа В предпочтительном случае избирательное воздействие должно быть в 10 и более раз сильнее при измерении in vivo или in vitro В наиболее предпочтительном случае интенсивность воздействия измеряют in vivo, концентрацию соединения измеряют как концентра 13 цию в плазме или внеклеточной жидкости, а в качестве эффекта измеряют выработку внеклеточных мессенджеров, таких как кальцитонин в плазме, паратгормон или кальций в плазме Например, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения соединение избирательно воздействует на секрецию паратгормона, а не на секрецию кальцитонина В предпочтительном случае соединение является кальцимиметиком или кальцилитиком и имеет ЕС50 или IC50 на рецепторе кальция не более 5мкМ, более предпочтительно, не более 1мкМ, ЮОнмоль, Юнмоль или Інмоль, в соответствии с экспериментом, описанным ниже В более предпочтительном случае внутриклеточную кон2+ центрацию Са измеряют в клетках НЕК 293, трансформированных нуклеиновой кислотой, экспрессирующей рецептор кальция человеческих клеток паращитовидной железы, и нагруженных fura-2 Меньшие ECso и ICso удобнее, так как позволяют применять соединения in vivo и in vitro в меньших концентрациях Обнаружение соединений с низкими ЕС50 и IC50 дает возможность проектировать и синтезировать другие соединения, настолько же или более мощные, эффективные и/или избирательные Другой аспект настоящего изобретения - соединения, модулирующие рецептор неорганического иона, которые соответствуют формуле СТРУКТУРА I I 10 где Агз - это либо нафтил, либо фенил, необязательно замещенный 0-5 заместителями, каждый из которых выбран независимо из группы, состоящей из низшего алкила, галогена, низшего алкоксила, низшего тиоалкила, метилен диоксила, низшего алкилгалогенида, низшего алкоксилгалогенида, ОН, СН2ОН, CONH2, CN, ацетоксила, бензила, бензилоксила, а,адиметилбензила, NO2, СНО, СН3СН(ОН), N(CH3)2, ацетила, этилен диоксила, Аг4 - это либо нафтил, либо фенил, необязательно замещенный 0-5 заместителями, каждый из которых выбран независимо из группы, состоящей из низшего алкила, галогена, низшего алкоксила, низшего тиоалкила, метилен диоксила, низшего алкилгалогенида, низшего алкоксилгалогенида, ОН, СН2ОН, CONH2, CN и ацетоксила, Rs - это либо водород, либо фенил, Rg - это либо водород, либо метил, R-іо - это водород, либо метил, либо фенил, или их фармацевтически приемлемые соли и комплексы Еще один аспект настоящего изобретения соединения, модулирующие рецептор неорганического иона, которые соответствуют формуле 55374 14 СТРУКТУРА I I I 12 где Аг5 - это либо нафтил, либо фенил, необязательно замещенный 0-5 заместителями, каждый из которых выбран независимо из группы, состоящей из низшего алкила, галогена, низшего алкоксила, низшего тиоалкила, метилен диоксила, низшего алкилгалогенида, низшего алкоксилгалогенида, ОН, СН2ОН, CONH2, CN, ацетоксила, бензила, бензилоксила, а,адиметилбензила, NO2, СНО, СНзСН(ОН), ацетила, этилен диоксида, -СН=СН-фенила, Агб - это либо нафтил, либо фенил, необязательно замещенный 0-5 заместителями, каждый из которых выбран независимо из группы, состоящей из ацетила, низшего алкила, галогена, низшего алкоксила, низшего тиоалкила, метилен диоксила, низшего алкилгалогенида, низшего алкоксилгалогенида, ОН, СН2ОН, CONH2, CN, карбометоксила, OCH2C(O)C2Hs и ацетоксила, Rn - это водород или метил, и R-I2 - это водород или метил Еще один аспект настоящего изобретения фармацевтический состав, приготовленный из описанного здесь соединения, модулирующего рецептор неорганического иона, и физиологически приемлемого носителя Выражение "фармацевтический состав" относится к составам, приемлемым для введения млекопитающему, предпочтительно, человеку В предпочтительном случае фармацевтический состав содержит достаточное количество соединения, модулирующего рецептор кальция, в надлежащей лекарственной форме для оказания терапевтического воздействия на человека Показатели приемлемости лекарственных форм известны специалистам и включают токсические эффекты, растворимость, путь введения и сохранение активности Например, фармацевтические составы, впрыскиваемые в кровь, должны быть растворимыми Фармацевтические составы также могут быть приготовлены в виде фармацевтически приемлемых солей (например, солей от взаимодействия с кислотами) и комплексов упомянутых соединений Приготовление таких солей может облегчить фармакологическое применение соединения за счет изменения его физических свойств без ущерба для его физиологического эффекта Еще один аспект настоящего изобретения способ лечения пациента за счет модуляции активности рецептора неорганического иона при помощи описанных в настоящем документе соединений, модулирующих рецептор неорганического иона Способ предусматривает введение пациенту фармацевтического состава, содержащего терапевтически эффективное количество соединения, модулирующего рецептор неорганического иона В предпочтительном варианте осу 16 15 55374 ществления настоящего изобретения заболевание мента петли Генле и/или первичного мочеточника, или расстройство лечат за счет модуляции активкератиноцитов эпидермиса, парафолликулярных ности рецептора кальция посредством введения клеток щитовидной железы (С-клеток), кишечных пациенту терапевтически эффективного количестклеток, тромбоцитов, клеток гладкой мускулатуры ва соединения, модулирующего рецептор кальсосудов, клеток сердечных предсердий, клеток, ция выделяющих гастрин, клеток, выделяющих глюкагон, мезангиальных почечных клеток, клеток моСоединения, модулирующие рецептор неорлочной железы, бета-клеток, жировых/адипозных ганического иона, и составы, их содержащие, моклеток, иммунных клеток, клеток желудочногут быть использованы для лечения пациентов кишечного тракта, клеток кожи, клеток надпочечПод "пациентом" подразумевается млекопитаюников, клеток гипофиза, клеток гипоталамуса и щее, на которое модуляция рецептора неорганиклеток субфорникулярного органа ческого иона оказывает благоприятное воздействие Пациентов, нуждающихся в лечении, В более предпочтительном случае клетки выпредусматривающем модуляцию рецептора неорбирают из группы, состоящей из клеток паращиганического иона, можно выявить стандартными товидной железы, клеток центральной нервной способами, известными медикам системы, клеток периферической нервной системы, клеток толстого восходящего сегмента петли В предпочтительном случае пациент - это чеГенле и/или первичного мочеточника, парафоллиловек, страдающий заболеванием или расстройкулярных клеток щитовидной железы (С-клеток), ством, характеризующимся одним или несколькикишечных клеток, клеток желудочно-кишечного ми следующими проявлениями (1) нарушением тракта, клеток гипофиза, клеток гипоталамуса и гомеостаза неорганического иона, более предпочклеток субфорникулярного органа тительно, нарушением гомеостаза иона кальция, (2) ненормальным содержанием мессенджера, на В одном из предпочтительных вариантов осувыработку или выделение которого влияет активществления настоящего изобретения соединение ность рецептора неорганического иона, более - это кальцимиметик, действующий на рецептор предпочтительно, активность рецептора кальция, кальция клеток паращитовидной железы и снии (3) ненормальными содержанием или активножающий уровень паратиреоидного гормона в сыстью мессенджера, на функцию которого влияет воротке пациента В более предпочтительном активность рецептора неорганического иона, бослучае уровень гормона снижается в степени, лее предпочтительно, активность рецептора кальдостаточной для того, чтобы в результате уменьция шилось содержание Са 2+ в плазме В наиболее предпочтительном случае уровень паратиреоидК заболеваниям, характеризующимся нарушеного гормона снижается до уровня, наблюдаемого нием гомеостаза кальция, относятся гиперпаратив здоровом организме реоз, остеопороз и другие, костные и минеральные расстройства и подобные им, описанные, В другом предпочтительном варианте осущенапример, в стандартных учебниках по медицине, ствления настоящего изобретения соединение таких как "Harrison's Principles of Internal Medicine" это кальцилитик, действующий на рецептор кальТакие заболевания лечат при помощи соединеция клеток паращитовидной железы и повышаюний, модулирующих рецептор кальция и имитищий уровень паратиреоидного гормона в сыворотрующих или блокирующих один или несколько ке пациента В более предпочтительном случае эффектов внеклеточного Са 2+ в отношении рецепэтот уровень повышается в степени, достаточной тора кальция и тем самым прямо или косвенно для того, чтобы у пациента возросла минеральная влияющих на содержание белков или других соплотность кости единений в организме пациента Пациентов, нуждающихся в таком лечении, можно выявить стандартными способами, наприПод "терапевтически эффективным количестмер, при помощи исследования крови или мочи вом" подразумевается количество соединения, Например, в результате обнаружения дефицита которое в той или иной степени облегчает один белка, на образование или секрецию которого или несколько симптомов заболевания или расвлияет изменение концентрации неорганического стройства у пациента или возвращает к норме, иона, или в результате обнаружения ненормальчастично или полностью, один или несколько финых уровней неорганических ионов или гормонов, зиологических или биохимических параметров, обеспечивающих гомеостаз неорганического иона связанных с заболеванием или расстройством или обусловливающих его В этой заявке приведены разнообразные примеры Эти примеры не ограничивают настоящее В предпочтительном случае у пациента наизобретение в каком-либо отношении блюдается заболевание или расстройство, характеризующееся ненормальным содержанием одноДругие особенности и достоинства настоящего или нескольких элементов, регулируемых го изобретения явствуют из нижеследующих илрецептором кальция, а соединение активно в отлюстраций, полного описания изобретения, приношении рецепторов кальция клеток, которые вымеров и пунктов формулы бирают из группы, состоящей из клеток паращиКраткие пояснения к иллюстративным матетовидной железы, костных остеокластов, риалам юкстагломерулярных почечных клеток, клеток На фиг1а-1г приведено химическое строение проксимальных почечных канальцев, клеток дисразличных соединений На фиг 2-131 приведены тальных почечных канальцев, клеток центральной физические характеристики наиболее типичных из нервной системы, клеток периферической нервописанных в настоящем документе соединений ной системы, клеток толстого восходящего сег 18 17 55374 Описание предпочтительных вариантов осукатионов Рецептор кальция паращитовидной же3+ ществления изобретения лезы реагирует на кальций и Gd , а остеокласты реагируют на двухвалентные катионы, такие как Настоящим изобретением предложены соеди3+ кальций, но не реагируют на Gd Таким образом, нения, способные модулировать один или нерецептор кальция паращитовидной железы фарсколько эффектов рецептора неорганического макологически отличается от рецептора кальция иона, предпочтительно, имитировать или блокиостеокластов ровать воздействие внеклеточного иона на клетку, имеющую рецептор неорганического иона, более С другой стороны, судя по последовательно2+ предпочтительно, внеклеточный ион - это Са , стям нуклеиновых кислот, кодирующим рецепторы который воздействует на клетку, имеющую рецепкальция клеток паращитовидной железы и Стор кальция К публикациям, где идет речь об акклеток, аминокислотная структура этих рецептотивности кальция, рецепторе кальция и/или соров должна быть весьма сходной Тем не менее, единениях, модулирующих рецептор кальция кальцимиметические соединения в клетках параотносятся следующие Brown et al , Nature 366 щитовидной железы и С-клетках демонстрируют 574, 1993, Nemeth et al, PCT/US93/01642, междуразличные фармакологические свойства и регународная публикация № WO 94/18959, Nemeth et лируют различные процессы Таким образом, al , PCT/US92/07175, международная публикация фармакологические свойства рецепторов кальция № WO 93/04373, Shoback and Chen, J Bone Minмогут значительно различаться в зависимости от eral Res 9 293 (1994), и Racke et al , FEBS Lett того, в клетках какого типа или в каком органе ре333 132, (1993) Эти работы не считаются предцепторы экспрессируются, даже если они имеют шествующим уровнем по отношению к настоящесходную или идентичную структуру му изобретению Как правило, рецепторам кальция свойственна низкая аффинность по отношению к внеклеI Рецепторы кальция точному Са 2+ (очевидное Kd обычно больше приРецепторы кальция имеются в клетках размерно 0,5мМ) Рецепторы кальция могут личных типов и в клетках разных типов могут содержать свободный или связанный эффекторфункционировать по-разному Фармакологические ный механизм, как описано в Cooper, Bloom and эффекты перечисленных ниже клеток в ответ на Roth, "The Biochemical Basis of Neuroкальций соответствуют присутствию в этих клетpharmacology", Ch 4, что отличает их от внутриках рецептора кальция Это клетки паращитовидклеточных рецепторов кальция, например, кальной железы, костных остеокластов, юкстагломемодулина и тропонинов рулярные почечные клетки, клетки проксимальних почечных канальцев, клетки дистальных почечных Рецепторы кальция реагируют на изменение канальцев, клетки центральной нервной системы, уровня внеклеточного кальция Характер изменеклетки периферической нервной системы, клетки ния зависит от самого рецептора и клеточной литолстого восходящего сегмента петли Генле и/или нии, содержащей рецептор Например, воздейстпервичного мочеточника, кератиноциты эпидервие кальция на рецептор кальция клетки миса, парафолликулярные клетки щитовидной паращитовидной железы in vitro включает слежелезы (С-клетки), кишечные клетки, тромбоциты, дующее клетки гладкой мускулатуры сосудов, клетки сер1 Повышение внутриклеточного содержания дечных предсердий, клетки, выделяющие гастрин, кальция Это повышение обусловлено притоком клетки, выделяющие глюкагон, мезангиальные кальция извне и/или мобилизацией внутриклеточпочечные клетки, клетки молочной железы, бетаного кальция Характеристики повышения содерклетки, жировые/ад ипозные клетки, иммунные жания внутриклеточного кальция следующие клетки, клетки желудочно-кишечного тракта, клет(a) Быстро наступающее (время до пика 4 часов) не влияров кальция Например, рецепторы кальция могут ет на это повышение реагировать на целый ряд двух- и трехвалентных 19 55374 2 Быстрое ( 4 часов) не влияет на это усиление 3 Подавление образования циклического АМФ, стимулируемого допамином и изопротеренолом Этот эффект устраним при помощи предварительной обработки коклюшным токсином (100 нг/мл, в течение >4 часов), и 4 Подавление секреции паратгормона Предварительная обработка коклюшным токсином (100нг/мл, в течение > 4 часов) не влияет на подавление секреции паратгормона При помощи известных специалистам способов можно легко определить воздействие кальция на другие рецепторы кальция в различных клетках Это воздействие может оказаться сходным в отношении повышения внутриклеточного содержания кальция, наблюдаемого в клетках паращитовидной железы Однако, оно не должно быть одинаковым в других аспектах, таких как стимуляция или подавление выработки гормона, отличного от паратиреоидного гормона II Соединения, модулирующие рецептор неорганического иона Соединения, модулирующие рецептор неорганического иона, модулируют один или несколько эффектов рецептора неорганического иона Предпочтительными среди соединений, модулирующих рецептор кальция, являются кальцимиметики и кальцилитики Соединения, модулирующие рецептор неорганического иона, можно выявить путем тестирования соединений, синтезированных по модели соединения, о котором известно, что оно обладает требуемой активностью (те ведущего соединения) Предпочтительным способом измерения активности рецептора кальция является измерение изменений [Са2+], Измерить изменение [Са2+], можно различными способами, например, посредством использования клеток НЕК 293, трансформированных нуклеиновой кислотой, экспрессирующей рецептор кальция клеток человеческой паращитовидной железы, и нагруженных fura-2, посредством измерения усиления тока СІ в овоцитах Xenopus, в которые введена нуклеиновая кислота, кодирующая рецептор кальция (См Nemeth et al , PCT/US93/01642, международная публикация № WO 94/18959) Например, поли(А)+ матричная РНК может быть получена из клеток, экспрессирующих рецептор кальция, таких как клетки паращитовидной железы, костные остеокласты, почечные юкстагломерулярные клетки, клетки проксимальных почечных канальцев, клетки дистальных почечных канальцев, клетки толстого восходящего сегмента петли Генле и/или первичного мочеточника, кератиноциты эпидермиса, парафолликулярные клетки щитовидной железы (С-клетки), кишечные клетки, клетки центральной нервной системы, клетки периферической нервной системы, тромбоциты, клетки гладкой мускулатуры сосудов, клетки предсердий сердца, клетки, выделяющие гастрин, клетки, выделяющие глюкагон, почечные мезангиальные клетки, клетки молочных желез, бетаклетки, жировые/ад ипозные клетки, иммунные 20 клетки и клетки желудочно-кишечного тракта Предпочтительно, нуклеиновую кислоту берут из клеток паращитовидной железы, С-клеток или остеокластов Более предпочтительно, нуклеиновая кислота кодирует рецептор кальция и находится в плазмиде или векторе В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения соединение, модулирующее рецептор кальция, - это кальцимиметик, подавляющий костную резорбцию в остеокластах in vivo, подавляющий костную резорбцию в остеокластах in vitro, стимулирующий секрецию кальцитонина С-клетками in vitro и in vivo, подавляющий секрецию паратиреоидного гормона клетками паращитовидной железы in vitro и уменьшающий секрецию паратгормона in vivo, повышающий уровни кальцитонина in vivo, блокирующий костную резорбцию в остеокластах in vitro и подавляющий костную резорбцию in vivo Еще в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения соединение, модулирующее рецептор кальция, - это кальцилитик, стимулирующий секрецию паратиреоидного гормона клетками паращитовидной железы in vitro и повышающий уровень паратиреоидного гормона in vivo В предпочтительном случае соединение избирательно по отношению к активности рецептора неорганического иона, более предпочтительно, к активности рецептора кальция, в клетках определенного типа Под "избирательностью" подразумевается, что соединение в данной концентрации оказывает более сильное воздействие на активность рецептора неорганического иона в клетках одного типа по сравнению с клетками другого типа Предпочтительно, это воздействие сильнее в 10 раз и более Концентрация - это, предпочтительно, концентрация в плазме крови, а измеряемый эффект - это выработка внеклеточных мессенджеров, таких как кальцитонин плазмы, паратиреоидный гормон или кальций плазмы Например, в одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения соединение избирательно воздействует на секрецию паратгормона в сравнении с секрецией кальцитонина В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения ЕС50 или ICso Для упомянутого соединения составляет не более 5мкМ в клетках одного или нескольких, но не всех типов, которые выбирают из группы, состоящей из клеток паращитовидной железы, костных остеокластов, юкстагломерулярных почечных клеток, клеток проксимальных почечных канальцев, клеток дистальных почечных канальцев, клеток центральной нервной системы, клеток периферической нервной системы, клеток толстого восходящего сегмента петли Генле и/или первичного мочеточника, кератиноцитов эпидермиса, парафолликулярных клеток щитовидной железы (Склеток), кишечных клеток, тромбоцитов, клеток гладкой мускулатуры сосудов, клеток сердечных предсердий, клеток, выделяющих гастрин, клеток, выделяющих глюкагон, мезангиальных почечных клеток, клеток молочной железы, бета-клеток, жировых/адипозных клеток, иммунных клеток, клеток желудочно-кишечного тракта, клеток кожи, клеток 22 21 55374 надпочечников, клеток гипофиза, клеток гипотаІЧ(СНз)2, фенила, феноксила, бензила, бензилокламуса и клеток субфорникулярного органа Присила, а,а-диметилбензила, NO2, CHO, СНзСН(ОН), сутствие рецептора кальция в этой группе клеток ацетила, этилен диоксила, но предпочтительно, было подтверждено данными физических исслекаждый заместитель независимо выбирают из дований, таких как гибридизация in situ и окрашигруппы, состоящей из СНз, СНзО, СН3СН2О, мевание антителами тилен диоксила, Br, Cl, F, I, CF3, CHF2, CH2F, CF3O, CF3CH2O, CH3S, ОН, СН2ОН, CONH2, CN, NO2, В предпочтительном случае соединения, моСНзСН2, пропила, изопропила, бутила, изобутила, дулирующие рецептор неорганического иона, трет-бутила и ацетоксила Более предпочтительимитируют или блокируют воздействие внеклено, An - это нафтил или фенил с 1-5 заместитеточного иона на клетку, имеющую рецептор неорлями, каждый из которых независимо выбирают из ганического иона, такой, что эти соединения окагруппы, состоящей из изопропила, СНзО, CH3S, зывают терапевтическое воздействие CF3O, I, Cl, F, CF3 и СНз, более предпочтительно, Соединения, модулирующие рецептор неорганиCF3O, I, Cl, F, и CF3 ческого иона, могут оказывать одинаковое или различное воздействие на клетки с различной Ar2 - это нафтил или фенил, необязательно морфологией рецептора неорганического иона замещенный 0-5 заместителями, каждый из кото(например, на клетки с нормальными рецепторами рых независимо выбирают из группы, состоящей неорганического иона, с нормальным количеством из низшего алкила, галогена, низшего алкоксила, рецепторов неорганического иона, с измененными низшего тиоалкила, метилен диоксила, низшего рецепторами неорганического иона и с измененалкилгалогенида, низшего алкоксилгалогенида, ным количеством рецепторов неорганического ОН, СН2ОН, CONH2, CN и ацетоксила, но предиона) почтительно, каждый заместитель независимо выбирают из группы, состоящей из СНз, СНзО, В предпочтительном случае соединения, моСНзСН2О, метилен диоксила, Br, Cl, F, I, CF3, дулирующие рецептор кальция, имитируют или CHF2, CH2F, CF3O, CF3CH2O, CH3S, ОН, СН2ОН, блокируют все эффекты внеклеточного иона в CONH2, CN, NO2, CH3CH2, пропила, изопропила, отношении клетки, имеющей рецептор кальция бутила, изобутила, трет-бутила и ацетоксила БоОднако, кальцимиметики не обязательно обладалее предпочтительно, Аг2 - это нафтил или фенил ют всеми биологическими свойствами внеклеточс 1-5 заместителями, каждый из которых незавиного Са 2+ Подобным образом, кальцилитики не симо выбирают из группы, состоящей из изопрообязательно должны блокировать все эффекты, вызванные внеклеточным кальцием Кроме того, пила, СНзО, CH3S, CF3O, I, Cl, F, CF3 и СНз, более различные кальцимиметики и различные кальципредпочтительно, CF3O, I Cl, F, СНзО и CF3 литики не обязательно должны связываться с тем q - это 0, 1, 2 или 3, и же местом на рецепторе кальция, с которым свяR - это Н или СНз, зывается внеклеточный кальций, чтобы оказывать и их фармацевтически приемлемые соли и свое действие комплексы Соединения, модулирующие рецептор неорВыражение "низший алкил" относится к насыганического иона, не обязательно воздействуют щенному углеводороду, содержащему 1-4 атомов на активность рецептора неорганического иона в углерода, предпочтительно, 1-3 атома, который той же степени или в точности таким же образом, может быть прямым или разветвленным что и природный лиганд Например, кальцимимеВыражение "низший алкоксил" относится к "Отик может воздействовать на активность рецептонизшему алкилу", где "О" - это кислород, присоера кальция в иной степени, с иной продолжительдиненный к низшему алкилу ностью, за счет связывания с другим местом, с Выражение "низший тиоалкил" относится к "Sдругой аффинностью, чем воздействует кальций низшему алкилу", где "S" - это сера, присоединенна рецептор кальция ная к низшему алкилу А Кальцимиметики Выражение "низший алкилгалогенид" относит1 Соединения структуры I ся к низшему алкилу, замещенному хотя бы одним Соединения структуры I, способные модулигалогеном Предпочтительно, замещен только ровать активность рецептора кальция, имеют слекрайний атом углерода низшего алкила, и присутдующую формулу ствуют 1-3 атома галогена Более предпочтительно, низший алкилгалогенид содержит 1 атом углерода Предпочтительно, галогены-заместители N это CI или F Выражение "низший алкоксилгалогенид" отноАг, сится к "О-низшему ал кил галоген иду", где "О" - это кислород, присоединенный к низшему алкилгалогениду R СН, а_ An и Аг? - оба необязательно замещенные где An - это либо нафтил, либо фенил, необяфенилы зательно замещенный 0-5 заместителями, каждый В одном из предпочтительных вариантов осуиз которых независимо выбирают из группы, соществления изобретения и An и Аг2 - это необязастоящей из низшего алкила, галогена, низшего тельно замещенные фенилы, а соединение имеет алкоксила, низшего тиоалкила, метилен диоксила, следующую формулу низшего алкилгалогенида, низшего алкоксилгалогенида, ОН, СН2ОН, CONH2, CN, ацетоксила, 55374 24 трет-бутила и ацетоксила, более предпочтительно, изопропила, СНзО, CH3S, CF30, CF3, I, CI, F и СНз Более предпочтительно, соединение имеет формулу где R - это водород или метил, т и п - каждое независимо от другого равно О, 1, 2, 3, 4 или 5, каждое X независимо выбирают из группы, состоящей из низшего ал кила, галогена, низшего алкоксила, низшего тиоалкила, метилен диоксила, низшего алкилгалогенида, низшего алкоксилгалогенида, ОН, СН2ОН, CONH2, CN, ацетоксила, ІЧ(СНз)2, фенила, феноксила, бензила, бензилоксила, а,а-диметилбензила, NO2, CHO, СНзСН(ОН), ацетила, этилен диоксила Предпочтительно, каждое X независимо выбирают из группы, состоящей из СНз, СНзО, СН3СН2О, метилен диоксила, Br, CI, F, I, CF3, CHF2, CH2F, CF3O, CF3CH2O, CH3S, ОН, СН2ОН, CONH2, CN, NO2, CH3CH2, пропила, изопропила, бутила, изобутила, трет-бутила и ацетоксила Более предпочтительно, каждое X независимо выбирают из группы, состоящей из изопропила, СНзО, CH3S, CF3O, I, CI, F, CF3 и СН3, более предпочтительно, CF3O, I, CI, F и CF3, каждое Z независимо выбирают из группы, состоящей из низшего ал кила, галогена, низшего алкоксила, низшего тиоалкила, метилен диоксила, низшего алкилгалогенида, низшего алкоксилгалогенида, ОН, СН2ОН, CONH2, CN и ацетоксила Предпочтительно, каждое Z независимо выбирают из группы, состоящей из СНз, СНзО, СН3СН2О, метилен диоксила, Br, CI, F, I, CF3, CHF2, CH2F, CF3O, CF3CH2O, CH3S, ОН, СН2ОН, CONH2, CN, СН3СН2, пропила, изопропила, бутила, изобутила, трет-бутила и ацетоксила Более предпочтительно, каждое Z независимо выбирают из группы, состоящей из изопропила, СНзО, CH3S, CF36, CF3, I, CI, FHCH3 оса где R - это водород или метил, Ri - это галоген или водород, предпочтительно, F или водород, R2 - это водород, галоген, низший алкил, низший алкилгалогенид, низший алкоксилгалогенид, предпочтительно, водород, CF3, СНз, OCF3 или F, и R3 - это водород, галоген, или алкоксил, предпочтительно, CI, F, водород или метоксил, более предпочтительно - метоксил В других более предпочтительных вариантах хотя бы два из Ri, R2, и R3 - это галогены, предпочтительно, F, a R - это водород или СНз, R -это водород или СНз, R2 - это низший алкилгалогенид или низший алкоксилгалогенид, предпочтительно, OCF3 или CF3, a Ri и R3 - атомы водорода, и R это СНз, R3 - это галоген, предпочтительно, CI, Ri -это галоген или водород, предпочтительно, F или водород, a R2 - это водород, низший алкил, низший алкилгалогенид или низший алкоксилгалогенид, предпочтительно, водород, CF3, СНз, OCF3 или F b Аг? - это нафтил, a q равно О В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения Агг - это нафтил, q равно 0, а соединение имеет формулу, В одном из наиболее предпочтительных вариантов хотя бы один из заместителей Z находится в мета-положении Более предпочтительно, соединение имеет следующую формулу R ОСН. 2, где R - это водород или метил, m - 0, 1, 2, 3, 4 или 5, предпочтительно 1 или а каждое X независимо выбирают из группы, состоящей из низшего алкила, галогена, низшего алкоксила, низшего тиоалкила, метилен диоксила, низшего алкилгалогенида, низшего алкоксилгалогенида, ОН, СН2ОН, CONH2, CN, ацетоксила, N(CH3h, фенила, феноксила, бензила, бензилоксила, а,а-диметилбензила, NO2, CHO, СНзСН(ОН), ацетила, этилен диоксила, но предпочтительно, каждый заместитель независимо выбирают из группы, состоящей из СНз, СНзО, СН3СН2О, метилен диоксила, Вг, С1, F, I, CF3, CHF2, CH2F, CF30, CF3CH2O, CH3S, ОН, СН2ОН, CONH2, CN, N02, CH3CH2, пропила, изопропила, бутила, изобутила, где An - это либо нафтил, либо фенил, необязательно замещенный 0-5 заместителями, каждый из которых независимо выбирают из группы, состоящей из низшего алкила, галогена, низшего алкоксила, низшего тиоалкила, метилен диоксила, низшего алкилгалогенида, низшего алкоксилгалогенида, ОН, СН2ОН, CONH2, CN, ацетоксила, N(CH3h, фенила, феноксила, бензила, бензилоксила, а,а-диметилбензила, NO2, CHO, СНзСН(ОН), ацетила, этилен диоксила, но предпочтительно, каждый заместитель независимо выбирают из группы, состоящей из СНз, СНзО, СН3СН2О, метилен диоксила, Br, CI, F, I, CF3, CHF2, CH2F, CF3O, CF3CH2O, CH3S, ОН, СН2ОН, CONH2, CN, NO2, CH3CH2, пропила, изопропила, бутила, изобутила, трет-бутила и ацетоксила 25 55374 Более предпочтительно, An - это нафтил или фенил с 1-5 заместителями, каждый из которых независимо выбирают из группы, состоящей из изопропила, СНзО, CH3S, CF3, CF3O, І, СІ, F и СН 3 Более предпочтительно, An - это фенил, необязательно замещенный, а соединение имеет формулу 26 но, изопропила, СН3О, CH3S, CF3O, CF3, I, Cl, F и CH 3 Более предпочтительно, соединение имеет формулу R сн. R где Х п обозначает возможные заместители для фенила, необязательно замещенного, как сказано выше (предпочтительные заместители и их количество описаны выше) В еще более предпочтительном случае соединение имеет формулу где R6 - это водород, низший ал кил галоген ид или низший алкоксилгалогенид, предпочтительно, водород, OCF3 или CF3, и R7 - это галоген или водород, предпочтительно, хлор или водород В других вариантах R, R6 и R7 такие, как описано выше (с описанными выше предпочтительными заместителями), с условием, что если R и R6 одновременно атомы водорода, то R7 - это не CI, R - это СН3, a R6 и R7 такие, как описано выше (с описанными выше предпочтительными заместителями) 2 Соединения структуры II Соединения структуры II имеют формулу R где R - это СН 3 или водород, R4 - это низший алкил, галоген или алкоксил, предпочтительно, изопропил, хлор или метоксил, и Rs - это водород, низший алкил или галоген, предпочтительно, метил, СН3, Вг или CI с Аг? - это нафтил, a q равно 2 В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения An - это замещенный фенил, Аг2 - это нафтил, q равно 2, а соединение имеет формулу R где R - это водород или СН3, п - это 0, 1, 2, 3, 4 или 5, предпочтительно 1 или 2, и каждое X независимо выбирают из группы, состоящей из низшего ал кила, галогена, низшего алкоксила, низшего тиоалкила, метилен диоксила, низшего алкилгалогенида, низшего алкоксилгалогенида, ОН, СН2ОН, CONH2, CN, ацетоксила, N(CH3)2, фенила, феноксила, бензила, бензилоксила, а,а-диметилбензила, NO2, CHO, СН3СН(ОН), ацетила, этилен диоксила, но предпочтительно, каждый заместитель независимо выбирают из группы, состоящей из СН3, СН3О, СН3СН2О, метилен диоксила, Br, Cl, F, I, CF3, CHF2, CH2F, CF3O, CF3CH2O, CH3S, OH, CH2OH, CONH2, CN, NO2, CH3CH2, пропила, изопропила, бутила, изобутила, трет-бутила и ацетоксила, более предпочтитель где Аг3 - это либо нафтил, либо фенил, необязательно замещенный 0-5 заместителями, каждый из которых независимо выбирают из группы, состоящей из низшего ал кила, галогена, низшего алкоксила, низшего тиоалкила, метилен диоксила, низшего алкилгалогенида, низшего алкоксилгалогенида, ОН, СН2ОН, CONH2, CN, ацетоксила, бензила, бензилоксила, а,а-диметилбензила, NO2, CHO, CH3CH(OH), N(CH3)2 ацетила, этилен диоксила, предпочтительно, N(CH3)2, низшего алкоксила или низшего алкила, Аг4 - это либо нафтил, либо фенил, необязательно замещенный 0-5 заместителями, каждый из которых независимо выбирают из группы, состоящей из низшего алкила, галогена, низшего алкоксила, низшего тиоалкила, метилен диоксила, низшего алкилгалогенида, низшего алкоксилгалогенида, ОН, СН2ОН, CONH2, CN и ацетоксила, предпочтительно, низшего алкоксила, более предпочтительно, метоксина, Rs - это водород или фенил, предпочтительно, водород, Rg - это водород или метил, и R-іо - это водород, метил или фенил, более предпочтительно, что если R-іо - это метил, то хиральный углерод, к которому он присоединен, имеет конфигурацию (R) Предпочтительно, а-метил в структуре II - это (R)-а-метил 2 Соединения структуры III Соединения структуры III имеют формулу 27 55374 Ar c Ar c R и R 1 2 где Аг5 - это либо нафтил, либо фенил, необязательно замещенный 0-5 заместителями, каждый из которых независимо выбирают из группы, состоящей из низшего ал кила, галогена, низшего алкоксила, низшего тиоалкила, метилен диоксила, низшего алкилгалогенида, низшего алкоксилгалогенида, ОН, СН2ОН, CONH2, CN, ацетоксила, бензила, бензилоксила, а,а-диметилбензила, NO2, СНО, СНзСН(ОН), ацетила, этилен диоксила, СН=СН-фенила, предпочтительно, низшего алкила, феноксила, -СН=СН-фенила, диметилбензила, метоксила, метилена или этилена, Агб - это либо нафтил, либо фенил, необязательно замещенный 0-5 заместителями, каждый из которых независимо выбирают из группы, состоящей из ацетила, низшего алкила, галогена, низшего алкоксила, низшего тиоалкила, метилен диоксила, низшего алкилгалогенида, низшего алкоксилгалогенида, ОН, СН2ОН, CONH2, CN, карбометоксила, OCH2C(O)C2Hs и ацетоксила, предпочтительно, метоксила, низшего алкила, фенила, галогена, CF3, CN, карбометоксила или ОСН2С (О) С2Н5, Rn - это водород или метил, предпочтительно, что если R-іо - это метил, то атом углерода, к которому он присоединен," имеет конфигурацию (R), и R-I2 - это водород или метил, предпочтительно, что если R-I2 - это метил, то атом углерода, к которому он присоединен, имеет конфигурацию (R) 4 Кальцимиметическая активность Способность соединений имитировать активность Са 2+ на рецепторах кальция может быть установлена при помощи процедур, известных специалистам и описанных в Nemeth et al , PCT/US93/01642, международная публикация № WO 94/18959 Например, кальцимиметики при тестировании с клетками паращитовидной железы in vitro дают один или несколько, а, предпочтительно, все нижеперечисленные эффекты 1 Соединение вызывает быстро наступающее (время до пика < 5 секунд) и преходящее повышение внутриклеточной концентрации кальция, устойчивое к ингибированию 1мкМ l_a3+ или 1мкМ Gd 3+ Это повышение наблюдается в отсутствие внеклеточного Са2+, но устранимо посредством предварительной обработки иономицином (в отсутствие внеклеточного Са2+), 2 Соединение потенцирует повышение [Са2+]|, обусловленное близкими к максимальной концентрациями внеклеточного Са2+, 3 Повышение [Са2+]|, вызванное внеклеточным Са2+, невозможно ингибировать дигидропиридинами, 4 Преходящее повышение [Са2+]|, вызванное соединением, устранимо посредством 10 28 минутной предварительной обработки ЮмМ фторидом натрия, 5 Преходящее повышение [Са2+]|, вызванное соединением, уменьшается за счет предварительной обработки активатором протеин киназы С (РКС), таким как форбол миристат ацетат (РМА), мезереин или (-)-индолактам V Итоговый эффект активатора протеин киназы С состоит в сдвиге кривой зависимости реакции от концентрации соединения вправо без изменения максимальной реакции, 6 Соединение вызывает быстрое ( 4 часов) блокирует подавляющее воздействие соединения на образование циклического АМФ, но не влияет на повышение [Са2+]|, образование инозит-1,4,5трифосфата или диацилглицерина или уменьшение секреции паратгормона, 10 Соединение вызывает усиления тока СІ - в овоцитах Xenopus, в которые введена обогащенная поли (А)+ мРНК из клеток коровьей или человеческой паращитовидной железы, но не оказывает действия на овоциты Xenopus, в которые введена вода или печеночная мРНК, 11 Подобным же образом, при использовании клонированного рецептора кальция клетки паращитовидной железы, соединение вызывает реакцию в овоцитах Xenopus, в которые введена кДНК или мРНК, кодирующая рецептор При помощи известных способов можно измерить различные эффекты кальция (см Nemeth et al , PCT/US93/01642, международная публикация № WO 94/18959) Параллельные определения соединений, имитирующих активность Са + в других клетках, чувствительных к кальцию, предпочтительно, на рецепторах кальция, содержатся в приведенных в настоящем документе примерах и в (Nemeth et al , PCT/US93/01642, международная публикация № WO 94/18959) В предпочтительных биопробах, описанных в настоящем документе и в (Nemeth et al , PCT/US93/01642, международная публикация № WO 94/18959), соединение дает один или несколько, а, предпочтительно, все нижеперечисленные эффекты вызывает преходящее повышение внутриклеточного содержания кальция, длящееся до 30 секунд (предпочтительно, за счет мобилизации внутриклеточного кальция), вызывает быстрое повышение [Са2+]|, наступающее в пределах тридцати секунд, вызывает стойкое повышение [Са + ]| (длящееся более 30 секунд) (предпочтительно, за счет стимуляции притока кальция извне), вызывает повышение уровней инозит-1,4,5-трифосфата или диацилглицерина, предпочтительно в пределах до 60 секунд, и подавляет образование циклического АМФ, стимулируемое допамином или изопротеренолом 29 55374 Преходящее повышение [Ca2+]i, предпочтительно, устранимо при помощи десятиминутной предварительной обработки клетки ЮмМ фторидом натрия, или же его можно ослабить посредством непродолжительной предварительной обработки (не более десяти минут) клетки активатором протеин киназы С, предпочтительно, форбол миристат ацетатом (РМА), мезереином или (-) индолактамом V С Кальцилитики Способность соединения блокировать активность внеклеточного кальция на рецепторе кальция может быть установлена при помощи стандартных способов, упомянутых в настоящем документе (См также Nemeth et al , PCT/US93/01642, международная публикация № WO 94/18959) Например, соединения, блокирующие эффекты внеклеточного кальция, обладают в отношении клетки паращитовидной железы одним или несколькими, а, предпочтительно, всеми нижеперечисленными свойствами (в ходе тестов in vitro с клетками паращитовидной железы) 1 Соединение блокирует, частично или полностью, способность повышенных концентраций внеклеточного Са 2+ (a) повышать [Са2+],, (b) мобилизовать внутриклеточный Са2+, (c) усиливать образование инозит-1,4,5трифосфата, (d) уменьшать образование циклического АМФ, стимулируемое допамином или изопротеренолом, (e) подавлять секрецию паратгормона, 2 Соединение блокирует усиление тока СІ - в овоцитах Xenopus, в которые введена поли(А)+мРНК из клеток коровьей или человеческой паращитовидной железы, вызванное внеклеточным Са 2+ или соединениями-кальцимиметиками, но не действует в овоцитах Xenopus, в которые введена вода или печеночная мРНК, 3 Подобным же образом, при использовании клонированного рецептора кальция из клетки паращитовидной железы, соединение блокирует вызванную внеклеточным Са 2+ или соединениемкальцимиметиком реакцию в овоцитах Xenopus, в которые введена кДНК, мРНК или кРНК, кодирующая рецептор кальция Параллельные определения соединений, блокирующих активность Са 2+ в клетке, чувствительной к кальцию, предпочтительно, на рецепторе кальция, содержатся в приведенных в настоящем документе примерах и в Nemeth et al , PCT/US93/01642, международная публикация № WO 94/18959 III Лечение заболеваний или расстройств Заболевания или расстройства, которые можно лечить за счет модуляции активности рецептора кальция, известны специалистам Например, заболевания или расстройства, которые можно лечить за счет модуляции активности рецептора кальция, можно выявить на основании функциональных реакций клеток, регулируемых активностью рецептора кальция Функциональные реакции клеток, регулируемые рецептором кальция, известны специалистам К ним относятся секре 30 ция паратгормона клетками паращитовидной железы, секреция кальцитонина С-клетками и костная резорбция в остеокластах Эти функциональные реакции связаны с различными заболеваниями или расстройствами Например, гиперпаратиреоз приводит к повышению уровня паратгормона в плазме Снижение уровня паратгормона в плазме представляет собой эффективное средство лечения гиперпаратиреоза Подобным образом, повышение уровня кальцитонина в плазме связано с подавлением костной резорбции Подавление костной резорбции - это эффективный способ лечения остеопороза Таким образом, модуляция активности рецептора кальция может быть применена для лечения таких заболеваний, как гиперпаратиреоз и остеопороз Соединения, модулирующие активность рецептора неорганического иона, предпочтительно, активность рецептора кальция, могут быть использованы для оказания благоприятного воздействия на пациентов, страдающих от целого ряда заболеваний или расстройств Например, остеопороз - это возрастное расстройство, характеризующееся потерей костной массы и повышением риска перелома кости Соединения могут быть использованы для непосредственной блокады костной резорбции в остеокластах (например, соединение - остеокластный иономиметик) или для опосредованной ее блокады за счет повышения уровня эндогенного кальцитонина (например, Склеточный кальцимиметик) С другой стороны, кальцилитик, воздействующий на рецептор кальция клеток паращитовидной железы, повысит уровень паратиреоидного гормона в крови, что способствует образованию костной ткани Все три подхода обеспечивают благоприятное воздействие на пациентов, страдающих от остеопороза Другие болезни или расстройства можно выявить, выявляя другие клеточные функциональные реакции, связанные с заболеванием или расстройством и регулируемые активностью рецептора кальция Заболевания или расстройства, которые можно лечить за счет модуляции рецепторов других неорганических ионов, выявляют аналогичным образом Предложенные настоящим изобретением соединения, модулирующие рецептор неорганического иона, оказывают свое действие в области рецептора неорганического иона, вызывая один или несколько клеточных эффектов, результатом которых является терапевтический эффект Предложенные настоящим изобретением соединения, модулирующие рецептор кальция, оказывают свое воздействие на рецептор кальция, вызывая один или несколько клеточных эффектов, следствием которых является терапевтический эффект Настоящее изобретение позволяет лечить различные заболевания посредством воздействия на клетки, имеющие рецептор кальция Например, первичный гиперпаратиреоз характеризуется гиперкальциемией и ненормально высокими уровнями паратгормона в крови Нарушение, связанное с этим основным типом гиперпаратиреоза, состоит в ослаблении чувствительности клеток паращитовидной железы к отри 32 31 55374 цательной обратной связи, т є регуляторному костеобразующих ной фосфатазы из 2+ воздействию внеклеточного Са Таким образом, остеобластов в ткани пациентов с первичным гиперпаратиреоПовышенные концентрации внеклеточного 2+ 2+ зом "критическая точка" для внеклеточного Са Са угнетают, подобно секреции паратгормона, сдвинута вправо, так что для угнетения секреции секрецию ренина в почечных юкстагломерулярных 2+ паратгормона требуются концентрации внеклеклетках Внеклеточный Са вызывает мобилиза2+ 2+ точного Са , превышающие нормальную Более цию внутриклеточного Са в этих клетках Другие того, при первичном гиперпаратиреозе даже высоклетки почек реагируют на кальций следующим + 2+ кие концентрации внеклеточного Са нередко образом повышение содержания Са угнетает лишь частично угнетают секрецию паратгормона образование 1,25 (ОН)2-витамина D в клетках проПри вторичном (уремическом) гиперпаратиреозе ксимальных канальцев, стимулирует выработку упомянутое повышение критического значения кальций-связывающего белка в клетках дисталь2+ 2+ для внеклеточного Са наблюдается даже тогда, ных канальцев, подавляет реабсорбцию Са и 2+ 2+ когда Са угнетает секрецию паратгормона в досМд в канальцах и действие вазопрессина в толтаточной степени Эти изменения со стороны секстом восходящем сегменте петли Генле (MTAL), реции паратгормона сопровождаются измененияослабляет действие вазопрессина в корковых 2+ ми [Са ], критическая точка для повышения клетках первичного мочеточника и воздействует [Са2+]|, обусловленного действием внеклеточного на клетки гладкой мускулатуры кровеносных сосуСа2+, сдвигается вправо, но само повышение окадов в почечных клубочках зывается менее сильным Кальций также способствует дифференциации бокаловидных клеток кишечника, клеток моУ пациентов со вторичным гиперпаратиреозом лочной железы, клеток кожи, подавляет секрецию может присутствовать и почечная остеодистропредсердного натриуретического пептида в серфия В таких случаях кальцимиметики оказываютдечных предсердиях, уменьшает накопление ся полезными для лечения как нарушений секрецАМФ в тромбоцитах, влияет на секрецию гастриции паратгормона, так и остеодистрофии на и глюкагона, воздействует на клетки гладкой Соединения, имитирующие действие внеклемускулатуры сосудов, влияя на выделение ими точного Са2+, дают благоприятный эффект при вазоактивных факторов, и воздействует на клетки длительном лечении как первичного, так и втоцентральной нервной системы и периферической ричного гиперпаратиреоза Эти соединения обеснервной системы печивают сумму воздействий, необходимую для угнетения секреции паратгормона, которого не Таким образом, имеются достаточные осноможет обеспечить одно только гиперкальциемичевания, чтобы предположить, что Са 2+ - это не ское состояние, и тем самым облегчает гипертолько универсальный внутриклеточный сигнал, кальциемическое состояние Соединения, дейстно и внеклеточный сигнал, регулирующий реакции вующие сильнее, чем внеклеточный Са2+, могут некоторых специализированных клеток Соединеподавить даже сверхстойкий компонент секреции ния, предложенные настоящим изобретением, паратгормона, особенно нежелательный при осмогут быть использованы для лечения заболевановной форме первичного гиперпаратиреоза, выний или расстройств, связанных с нарушением званной аденомой паращитовидной железы С реакции этих клеток на Са 2+ К заболеваниям и другой стороны или кроме того, такие соединения расстройствам, которые можно лечить или предумогут подавлять синтез паратгормона было выпреждать путем воздействия на пораженные клетяснено, что продолжительная гиперкальциемия ки, относятся заболевания центральной нервной снижает уровни мРНК препропаратгормона в ткасистемы, такие как судороги, инсульт, черепнони коровьей и человеческой паращитовидной жемозговые травмы, поражения спинного мозга, полезы, пораженной аденомой Продолжительная ражения нервных клеток, обусловленные гипоксигиперкальциемия также угнетает пролиферацию ей (например, при остановке сердца или неонаклеток паращитовидной железы in vitro, поэтому тальной патологии), эпилепсия, кальцимиметики также могут эффективно протинейродегенеративные заболевания, такие как боводействовать гиперплазии паращитовидной железнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона и болезы, характерной для вторичного гиперпаратилезнь Паркинсона, слабоумие, напряженность реоза мышц, депрессия, страхи, панические состояния, обессивно-компульсивные расстройства, поНа физиологические изменения концентрации сттравматический стресс, шизофрения, нейролепвнеклеточного Са 2+ способны непосредственно тический злокачественный синдром и синдром реагировать не только клетки паращитовидной Туретта (Tourette), заболевания, связанные с железы Например, изменения концентрации внечрезмерной реабсорбцией воды в почках, такие клеточного Са 2+ управляют секрецией кальцитокак синдром неадекватной секреции антидиуретинина в парафолликулярных клетках щитовидной ческого гормона (SIADH), цирроз, застойная сержелезы (С-клетках) дечная недостаточность и нефроз, гипертензия, Изолированные остеокласты реагируют на попредупреждение и/или ослабление почечной токвышение концентрации внеклеточного Са 2+ соот2+ сичности катионных антибиотиков (например, ветственным повышением [Са ]|, отчасти объясаминогликозидных антибиотиков), расстройства няемым мобилизацией внутриклеточного Са 2+ 2+ двигательной функции кишечника, такие как диаПовышение [Са ], в остеокластах связано с порея или синдром раздраженной толстой кишки, давлением костной резорбции Кальций непоязвенные заболевания желудочно-кишечного средственно стимулирует высвобождение щелочтракта, заболевания желудочно-кишечного тракта 33 с чрезмерным всасыванием кальция, такие как саркоидоз, аутоиммунные заболевания и отторжение пересаженных органов Хотя предложенные настоящим изобретением соединения, модулирующие рецептор кальция, должны применяться, прежде всего, для лечения людей, их также можно использовать для лечения подобных или идентичных заболеваний других видов теплокровных животных, например, других приматов, сельскохозяйственных животных, таких как свиньи, крупный рогатый скот, птица, спортивных и декоративных животных, таких как лошади, собаки и кошки IV Доставка в организм Различные соединения, предложенные настоящим изобретением, могут быть использованы для лечения различных заболеваний или расстройств посредством модуляции активности рецептора неорганического иона, предпочтительно, активности рецептора кальция Соединения, предложенные настоящим изобретением, можно приготовить в различных лекарственных формах для различных способов применения, втом числе системного и наружного, или местного Составы и технологии их приготовления можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co , Easton, PA Способы введения иономиметиков и ионолитиков рассмотрены в Nemeth et al , PCT/US93/01642, международная публикация № WO 94/18959 Подходящие лекарственные формы в какой-то мере определяются характером и способом применения, например, внутрь, трансдермально или посредством инъекции Такие лекарственные формы должны обеспечить доставку соединения в нужную клетку, находящуюся в многоклеточном организме или в культуре Например, лекарственные вещества или составы, впрыскиваемые в кровь, должны быть растворимыми Специалистам известны и другие факторы, к которым относятся соображения токсичности и учет способности некоторых лекарственных форм отсрочивать наступление действия соединения или состава Соединения также можно приготовить в виде фармацевтически приемлемых солей (например, солей от взаимодействия с кислотами) и комплексов Фармацевтически приемлемые соли - это соли, нетоксичные в применяемой концентрации Приготовление таких солей может облегчить применение соединений за счет изменения их физических свойств без ущерба для физиологического эффекта К полезным изменениям физических свойств относятся снижение температуры плавления, облегчающее введение через слизистые оболочки, и повышение растворимости, позволяющее применять лекарство в более высоких концентрациях К фармацевтически приемлемым солям относятся соли от взаимодействиями с кислотами, такие как соли, содержащие сульфат-, гидрохлорид-, малеат-, фосфат-, сульфамат-, ацетат-, цитрат-, лактат-, тартрат-, метансульфонат-, этансульфонат-, бензолсульфонат, ртолуолсульфонат-, циклогексилсульфамат- и хинат-ион (см напр , PCT/US92/03736, включенный в настоящий документ посредством ссылки) Фар 55374 34 мацевтически приемлемые соли можно получить от взаимодействия с такими кислотами, как соляная кислота, малеиновая кислота, серная, кислота, фосфорная кислота, сульфамовая кислота, уксусная кислота, лимонная кислота, молочная кислота, винная кислота, малоновая кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, ртолуолсульфоновая кислота, циклогексилсульфамовая кислота и хинная кислота Фармацевтически приемлемые соли можно приготовить стандартными способами Например, соединение в виде свободного основания растворяют в подходящем растворителе, таком как водный или водно-спиртовой раствор, содержащий соответствующую кислоту, затем выделяют посредством выпаривания раствора Помимо этого, соль можно получить, проведя реакцию свободного основания и кислоты в органическом растворителе Для облегчения применения соединения можно также использовать носители или наполнители К примерам носителей и наполнителей относятся карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, такие как лактоза, глюкоза или сахароза, крахмалы, производные целлюлозы, желатин, растительные масла, полиэтиленгликоли и физиологически совместимые растворители Составы или лекарственные составы можно вводить различными способами, в том числе внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно и внутримышечно, внутрь, наружно или через слизистые оболочки Предпочтительным способом системного применения является прием внутрь Также приемлемы инъекции, например, внутримышечные, внутривенные, внутрибрюшинные и подкожные Для инъекций соединения, предложенные настоящим изобретением, готовят в виде жидких растворов, предпочтительно, в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнкса или Рингера Кроме того, соединения можно приготовить в виде твердых веществ, которые растворяют или взвешивают непосредственно перед применением Возможно также приготовление лиофилизированных форм Системное применение осуществляется также посредством трансдермального введения, введения через слизистые оболочки или приема соединения внутрь Для введения через слизистые оболочки или через кожу в препаратах используют смачивающие вещества, соответствующие барьеру, сквозь который должно проникнуть соединение Эти смачивающие вещества известны специалистам, к ним относятся, например, для введения через слизистые оболочки, соли желчных кислот и производные фузидовой кислоты Кроме того, для облегчения проникновения можно использовать детергенты Введение через слизистые оболочки осуществляют при помощи, например, аэрозолей для носа или суппозиториев Для приема внутрь соединения можно приготовить в виде традиционных лекарственных форм для приема внутрь, таких как капсулы, таблетки и жидкие лекарственные формы Для наружного применения соединения, предложенные настоящим изобретением, можно 35 приготовить в виде мазей, гелей или кремов, как известно специалистам Количества, в которых следует вводить различные соединения, предложенные настоящим изобретением, можно определить стандартными способами Как правило, терапевтически эффективное количество соединения находится в пределах от около 1нмоль до Змкмоль, предпочтительно от 0,1нмоль до Імкмоль, в зависимости от ЕС50 или IC50 соединения, возраста и массы тела пациента и сущности заболевания или расстройства Как правило, это количество составляет примерно от 0,1 до 50мг/кг, предпочтительно, от 0,01 до 20мг/кг массы тела животного, которое необходимо лечить V Примеры Ниже приведены примеры, иллюстрирующие различные аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения Эти примеры не исчерпывают объем настоящего изобретения Пример 1 Клонирование рецептора кальция человеческой паращитовидной железы из аденомы человеческой паращитовидной железы В этом примере описано клонирование рецептора кальция человеческой паращитовидной железы из аденомы человеческой паращитовидной железы с использованием pBoPCaRI в качестве гибридизационного зонда (см Nemeth et al , PCT/US93/01642, международная публикация № WO 94/18959) Зонд был использован для распознавания нуклеиновой кислоты, кодирующей рецептор кальция человеческой паращитовидной железы, в ходе перекрестной гибридизации в условиях пониженной жесткости Матричную РНК приготовили из аденомы человеческой паращитовидной железы, удаленной у 39-летнего мужчины-кавказца, у которого был установлен первичный гиперпаратиреоз Анализ этой мРНК методом назерн-блоттинга с использованием pBoPCaRI в качестве гибридизационного зонда позволил выявить транскрипты рецептора кальция величиной около 5 тысяч оснований и около 4 тысяч оснований На основе этой мРНК создали библиотеку кДНК На агарозном геле по размеру отобрали двухнитевые кДНК больше 3 тысяч пар оснований и вшили в вектор клонирования лямбда Zap II Пятьсот тысяч первичных рекомбинантных фагов протестировали при помощи гибридизационного зонда pBoPCaRI (кДНК-вставка величиной 5,2 тысячи пар оснований) Вставку pBoPCaRI пометили [32Р]-с1ЦТФ посредством синтеза с произвольной затравкой, придав ей удельную активность 1 х 109 раз в минуту/мкг Скрининг библиотеки проводили в следующих условиях гибридизации 400мМ Na+, 50% формамид, температура 38°С Фильтры для бляшек гибридизовали с зондом в концентрации 500000 раз в минуту/мл в течение 20 часов После гибридизации фильтры в течение 1 часа при 40°С промывали 1 х SSC Первичный скрининг выявил около 250 положительных клонов (гибридизовавшихся с рВоРCaRI) Семь из них были подвергнуты вторичному и третичному скринингам, в результате чего были выделены отдельные клоны, гибридизующиеся с зондом pBoPCaRI Эти семь клонов анализирова 55374 36 ли посредством картирования при помощи рестрикционных ферментов и саузерн-блоттинга Три из этих клонов содержали вставки кДНК величиной в 5 тысяч пар оснований и, по-видимому, являлись полноразмерными клонами, соответствующими мРНК в 5 тысяч оснований Два из этих клонов содержали вставки кДНК величиной в 4 тысячи пар оснований и, по-видимому, являлись полноразмерными клонами, соответствующими мРНК в 4 тысячи оснований Картирование этих двух вставок различного размера при помощи рестрикционных ферментов показывает, что на их 5'-концах находятся участки с подобными последовательностями, а З'-концы различаются Анализ последовательностей ДНК показывает, что меньшая вставка может быть продуктом альтернативного полиаденилирования, происходящего выше по ходу последовательности, чем полиаденилирование в большой вставке Типичные для обоих классов кДНК-вставки были субклонированы в плазмидный вектор pBluescnpt SK Линеаризация с последующей транскрипцией in vitro при помощи РНК полимеразы Т7 дала кРНК-транскрипты Эти кРНКтранскрипты ввели в овоциты Xenopus (150нг/мкл РНК, 50нл/овоцит) для функциональных тестов После 2-4-дневной инкубации овоциты протестировали на присутствие функциональных рецепторов кальция Возбуждение тока хлорид-ионов, стимулируемого кальцием, в ответ на добавление соответствующих агонистов рецептора кальция показало, что клоны обоего типа сформировали функциональные рецепторы кальция Известные агонисты рецептора кальция, в том числе NPS R467 и NPS R-568 (см Nemeth et al , PCT/US93/01642, международная публикация № WO 94/18959), активировали экспрессируемый овоцитами рецептор примерно в тех же концентрациях, которые, как известно, эффективно воздействуют на нативный рецептор клеток паращитовидной железы Таким образом, оба клона кодируют функциональный рецептор кальция клеток человеческой паращитовидной железы Плазмиды были приготовлены посредством субклонирования каждого класса вставок в pBluescnpt, продуктами которого стали pHuPCaR5 2 и pHuPCaR4 0 Последовательности нуклеотидов и аминокислот для вставок представлены последовательностями №№ 1 и 2 Между последовательностями нуклеотидов двух кДНК-вставок наблюдались некоторые различия Анализ последовательностей двух этих кДНК-вставок показывает, что существует, по меньшей мере, два варианта последовательностей, различающиеся З'-конечными нетранслируемыми участками, что может быть результатом альтернативного полиаденилирования Кроме того, существуют варианты последовательностей и на 5'-концах вставок Эти различающиеся последовательности соответствуют нетранслируемым участкам и могут появиться в результате альтернативной инициации трансляции и/или сплайсинга В кодирующих областях кДНК-клонов pHuPCaR5 2 и pHuPCaR4 0 обнаруживаются три различающихся участка (см последовательности №№ 1 37 и 2), а это значит, что эти клоны кДНК кодируют различные белки Анализ последовательности человеческого гена CaR (рецептора кальция) показывает, что лишние (по сравнению с клоном кДНК pHuPCaR4 0) 30 пар оснований ДНК в клоне кДНК pHuPCaR5 2 являются результатом альтернативного сплайсинга мРНК Альтернативный сплайсинг мРНК, согласно расчетам, должен вставить 10 добавочных аминокислот в полипептид CaR, кодируемый кДНК pHuPCaR5 2, на участок между аминокислотой № 536 и аминокислотой № 537 полипептида, кодируемого кДНК pHuPCaR4 0 Кроме того, pHuPCaR4 0 кодирует глутамин (Gin) в позиции 925 и глицин (Gly) в позиции 990, тогда как pHuPCaR5 2 кодирует аргинин (Arg) в обеих соответствующих позициях Человеческий ген CaR кодирует в этих позициях Gin и Arg, соответственно Различие между кДНК pHuPCaR4 0 и человеческой ДНК, по-видимому, отражает реальный полиморфизм последовательностей, существующий в человеческой популяции, а замена одного основания в pHuPCaR5 2, вероятно, отражает мутацию, произошедшую в ходе клонирования Обе кДНК кодируют функциональные рецепторы кальция, как видно по способности овоцитов Xenopus, в которые введена кРНК, приготовленная из этих клонов кДНК, отвечать на ЮмМ внеклеточный кальций проводимостью CI Однако, возможно, что эти две изоформы рецептора функционально и/или фармакологически различны Пример 2 Отбор стабильных рекомбинантных клеток, экспрессирующих рецептор кальция Были получены тональные клеточные линии, стабильно экспрессирующие оба человеческих и коровий рецепторы кальция Комплементарные ДНК рецептора кальция были субклонированы в два различных промышленных вектора экспрессии - pMSG (приобретен в компании Pharmacia) и Сер4В (приобретен в компании Invitrogen) Первый вектор содержит ген селектируемого маркера для ксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (gpt), позволяющий стабильно трансфицированным клеткам преодолевать блокаду биосинтеза пуринов, наступающую при добавлении 2мкг/мл аминоптерина и 25мкг/мл микофенольной кислоты КДНК pHuPCaR5 2 и pHuPCaR4 0 (последовательности №№ 1 и 2, соответственно) были удалены из родительских плазмид Bluescnpt при помощи рестрикционных ферментов Not I и Hind III, a затем либо непосредственно вшиты в переваренный Not I + Hind III Cep4B, либо обработаны фрагментом Кленова ДНК полимеразы, а затем вшиты тупыми концами в pMSG, переваренный Sma I Субклон pMSG, содержащий вставку HuPCaR5 2, ввели в клетки СНО (яичник китайского хомячка), как описано выше В результате селекции получили 20 устойчивых клонов, описанных ниже Субклоном Сер4В, содержащим вставку HuPCaR5 2, трансфицировали клетки НЕК 293, как описано выше Селекция с гигромицином дала популяцию стабильных клонов Подобным образом были приготовлены клоны, экспрессирующие изоформу рецептора HuPCaR4 0 Клетки, полученные из популяции, отобранной при помощи гигромицина из клеток НЕК 293, 55374 38 трансфицированных Сер4В, содержащим вставку HuPCaR5 2, высадили на покрытые коллагеном квадраты из аклара (Aklar), которые поместили в отдельные лунки 12-луночных планшетов для тканевых культур Через 2-6 дней среду удалили, а клетки промыли сбалансированным соляным раствором и 1мл буфера, содержащего 1мкМ fura2АМ, 1мМ СаСЬ и 0,1% бычий сывороточный альбумин и 1мМ СаСЬ Измерение флуоресценции, возникающей в ответ на воздействие агонистов рецептора кальция, проводили при 37°С в спектрофлуориметре при длине волны возбуждения и эмиссии 340 и 510нм, соответственно Для калибровки шкалы максимальную флуоресценцию Fmax определяли после добавления иономицина (40мкМ), а видимую минимальную флуоресценцию F m определяли после добавления 0,3 М m EGTA ((этилендиокси)диэтилендинитрилотетрауксусной кислоты) и 2,5 М Трис-НСІ, рН 10 Сильное повышение [Са2+], наблюдалось при добавлении следующих агонистов рецептора кальция Са 2+ (ЮмМ), Мд2+ (20мМ) и NPS R-467 Контрольные клетки, экспрессирующие функциональные рецепторы вещества К, не реагировали на эти кальцимиметические соединения Были получены дополнительные клоны клеток НЕК 293, трансфицированных последовательностью pHuPCaR4 0 Их протестировали на реакцию на кальцимиметики, как описано выше, с той лишь разницей, что тестируемые клетки находились в суспензии Пример 3 Измерение активности рецептора кальция в клетках паращитовидной железы, нагруженных fura-2 В этом разделе описаны процедуры, проведенные для получения клеток паращитовидной железы от телят и людей и для использования этих клеток для измерения активности рецептора кальция Паращитовидные железы брали от только что забитых телят (в возрасте 1 2 - 1 5 недель) на местной бойне и доставляли в лабораторию в ледяном буфере для клеток паращитовидной железы (РСВ), содержащем (мМ) NaCI-126, KCI-4, MgCI21, Na-HEPES-20, рН 7,4, глюкозы-5,6, - и СаСІ2 в различных количествах, например, 1,25мМ Человеческие паращитовидные железы брали в ходе хирургического удаления ткани паращитовидной железы при первичном или уремическом гиперпаратиреозе и обрабатывали так же, как и коровьи С желез обрезали излишки жира и соединительной ткани и маленькими ножницами разрезали их на кубики со стороной 2-Змм Отдельные клетки получали при помощи переваривания ткани коллагеназой, затем очищали посредством центрифугирования в буфере перколл Полученный препарат клеток паращитовидной железы практически не содержал эритроцитов, адипоцитов и ткани капилляров (по результатам фазоконтрастной микроскопии и окрашивания Суданом черным В) Разъединенные и очищенные клетки паращитовидной железы имели вид небольших скоплений (по 5-20 клеток) Жизнеспособность клеток, 39 55374 как показало исключение трипанового синего или бромида этидия, обычно составляла 95% В таком виде клетки уже можно использовать в экспериментах, но их физиологические реакции (например, угнетаемость секреции паратгормона или уровни [Са2+], в покое) следует определять после культивации в течение ночи Первичная культура удобна также тем, что клетки можно пометить изотопами, нагрузив их изотопами почти до равновесия, что необходимо для исследований, предусматривающих оценку обмена инозит фосфатов После очистки градиентами перколла клетки несколько раз промыли смесью 1 1 F12 Хэма со средой Игла, модифицированной по Дульбекко (GIBCO) и содержащей в виде добавок 50мкг/мл стрептомицина, 100Ед/мл пенициллина, 5мкг/мл гентамицина и ITS+ ITS+ - это готовый раствор, содержащий инсулин, трансферрин, селен и бычий сывороточный альбумин (ВЗА)-линоленовую кислоту (Collaborative Research, Bedford, MA) Затем клетки перенесли на пластиковые матрасы (75 или 150см , Falcon) и выдержали в течение ночи при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СОг В эти ночные культуры сыворотку не добавляли, так как ее присутствие позволяет клеткам прикрепиться к пластику, размножиться и слиться Клетки, выдержанные в описанных выше условиях, легко отделялись от матрасов при опрокидывании и имели такую же жизнеспособность, как и свежеприготовленные клетки Очищенные клетки паращитовидной железы взвесили в 1,25мМ CaCI2 - 2% BSA-PCB, содержащем 1мкМ fura-2-ацетоксиметилового эфира, и выдержали их 20 минут при 37°С Затем клетки дважды промыли РСВ, содержащим 0,5мМ СаСЬ и 0,5% BSA, и держали при комнатной температуре (около 20°С) Непосредственно перед использованием клетки разбавляли до пятикратного объема подогретым 0,5мМ СаСЬ-РСВ, доводя окончательную концентрацию BSA до 0,1% Концентрация клеток в кювете, используемой при измерении флуоресценции, составляла 1-2 х 106/мл Флуоресценцию нагруженных индикатором клеток измеряли при 37°С в спектрофлуориметре (Biomedical Instrumentation Group, university of Pennsylvania, Philadelphia, PA), снабженном термостатом для кюветы и магнитной мешалкой, при длине волны возбуждения и эмиссии 340 и 510нм, соответственно Флуоресценция показывает уровень Са 2+ в цитоплазме Калибровку шкалы провели с использованием дигитонина (окончательная концентрация 50мкг/мл, для получения максимальной флуоресценции Fmax), EGTA (окончательная концентрация ЮмМ, рН 8,3, для получения минимальной флуоресценции Fmm) и кон 40 станты диссоциации 224нМ Утечка красителя зависит от температуры и происходит в основном в течение первых 2 минут после нагревания клеток в кювете После этого утечка красителя происходит очень медленно Чтобы учесть утечку красителя при калибровке, клетки помещали в кювету и перемешивали при 37°С в течение 2-3 минут Затем суспензию отбирали, центрифугировали и помещали супернатант в чистую кювету Супернатант обрабатывали дигитонином и EGTA, чтобы оценить утечку красителя, которая обычно составляет 10 - 15% от суммарного флуоресцентного сигнала, вызванного действием Са 2+ Эту величину вычитали из видимой Fmm Пример 4 Измерение активности рецептора кальция в клетках НЕК 293/pHuPCaR4 0, нагруженных fura-2 В этом разделе описаны процедуры, проведенные для измерения активности рецептора кальция в клетках НЕК 293/pHuPCaR4 0, нагруженных fura-2 Клетки НЕК 293, трансфицированные pHuPCaR4 0, были нагружены fura-2 в ходе инкубации в среде Игла, модифицированной по Дульбекко, забуференной 20мМ HEPES, содержащим около 5мкМ fluo-3/AM, в течение 1 часа при комнатной температуре Затем клетки промыли сбалансированным соляным раствором Хэнкса, забуференным 20мМ HEPES, содержащим 1мМ СаСЬ и 1мМ МдСЬ Затем к клеткам добавили тестируемые соединения и измерили флуоресценцию (длина волны возбуждения и эмиссии 340 и 510нм, соответственно) Пример 5 Измерение способности соединений модулировать активность рецептора кальция Способность различных соединений модулировать активность рецептора кальция оценивали на основании измерения повышения [Са2+], в клетках НЕК 293, трансфицированных нуклеиновой кислотой, кодирующей pHuPCaR4 0, и нагруженных fura-2, или в клетках паращитовидной железы, нагруженных fura-2 Результаты различных экспериментов приведены в Таблицах 1а, 1 Ь 1 , 1 b 2, 1 с и 2 В Таблицах 1а, 1 b 1, 1 Ь 2 и 1с представлено воздействие соединений в различных концентрациях на активность рецептора кальция, измеренную, как описано в Примере 4 (т е , с использованием клеток НЕК 293, трансфицированных нуклеиновой кислотой, кодирующей pHuPCaR4 0, и нагруженных fura-2) В Таблице 2 приведены результаты различных экспериментов, где рассчитывалась ECso для клеток паращитовидной железы или для клеток НЕК 293/pHuPCaR4 0, нагруженных fura-2 Клетки были нагружены fura-2 и исследованы, как описано в Примере 2 (клетки паращитовидной железы) и в Примере 3 (клетки НЕК 293/pHuPCaR4 0) 41 55374 42 Таблица 1 а Кальцимиметические соединения, вызывающие реакцию сильнее 40% в концентрации 3,3 нг/мл в клетках НЕК-293, экспрессирующих человеческий рецептор кальция Код соединения контрольные соединения R-568 контрольные соединения R-568 17Р 17Х 24Х 24У 17J 25А 17Е 24Z 14S 25Е 17G 14Т 17Н 140 25I 12J 121 25G 9R 12F 120 23Z 17М 16V 250 25J 16L 12N 16Т 25U 17Р 16Q 23Е 17С 25L 8Z 17Х 13R 170 23Q 16Х 24V 130 17N 21V 24М 13U 24Р 17Y 11Х 25Н 22J 9С 3300 активности в четырех концентрациях (нг/мл) 330 33 3,3 95 126 119 116 122 116 138 116 132 125 126 126 119 119 131 115 130 118 110 129 126 119 146 115 107 137 113 97 122 127 122 132 140 109 115 69 24 95 101 105 109 120 118 120 110 138 106 129 128 125 124 119 113 130 111 115 108 110 117 126 115 114 115 123 138 106 97 107 101 110 113 120 97 101 105 132 112 114 111 98 115 108 116 134 108 138 94 100 107 99 104 69 86 93 124 127 122 114 110 135 105 122 119 117 111 102 114 113 93 99 101 101 94 100 99 102 96 105 98 102 88 95 86 88 102 99 85 97 93 98 96 98 96 71 94 86 99 99 79 110 79 76 89 71 82 24 54 51 109 102 102 92 92 90 88 85 77 77 74 74 74 68 68 66 64 63 62 61 59 58 57 56 56 55 55 55 54 53 53 52 52 52 51 51 51 51 51 50 50 49 48 48 47 46 46 45 45 45 45 43 55374 44 Продолжение таблицы 1 а Код соединения контрольные соединения R-568 контрольные соединения 13S 10Q 13Р 8К 13N 10N 12Н 25Р 18А 14L % активности в четырех концентрациях (нг/мл) 3300 330 33 3,3 95 103 106 114 90 69 24 102 100 110 98 114 97 115 81 111 109 87 84 83 81 88 77 94 75 88 78 45 44 44 44 43 43 43 41 40 40 Таблица 1 b1 Кальцимиметические соединения, вызывающие реакцию сильнее 40% в концентрации ЗЗнг/мл в клетках НЕК-293, экспрессирующих человеческий рецептор кальция Код соединения % активности в четырех концентрациях (нг/мл) 3300 330 33 3,3 контрольные соединения R-568 17Р 17Х 12С 161 17D 17F 24С 25К 13F 21F 21S 10F 14R 13G 14Z 16N 8U 23W 12G 15G 25М 13V 14Р 6Т 14Q 17L 24К 24U 25Q 8J 23Н 21C=4U 25F 16R 171 24J 95 101 105 134 121 116 124 125 132 106 111 118 122 123 117 139 118 112 123 111 106 116 121 134 97 118 69 86 93 24 54 51 125 117 108 111 113 107 122 109 131 96 107 128 103 159 129 97 139 113 100 110 103 129 101 104 106 106 95 104 114 114 85 100 97 103 98 96 91 90 87 86 85 85 85 84 84 82 82 82 82 81 81 80 79 79 78 78 78 78 78 78 77 77 77 76 76 76 76 75 39 36 38 28 32 35 38 36 34 27 37 29 20 8 11 25 35 32 25 33 30 15 35 31 30 25 20 39 28 17 28 25 18 31 45 Код соединения контрольные соединения 210 24G 151 21D 20Y ЮР 23М 14Y 17К 12Е 17Z 16W 23К 25Х 13W 23Р 18В 21Y 17W 23А 23G 13М 21U 21R 10S/10T 17R 13Х 4N 21Е 15J 22Y 21G 24L 10V 10W/10X 17В 23Y 11Y 55374 46 Продолжение таблицы 1 b 1 % активности в четырех концентрациях (нг/мл) 3300 330 33 3,3 109 111 117 113 98 117 106 96 125 111 127 104 80 106 109 94 93 104 95 102 97 109 97 121 99 102 107 94 109 99 96 100 92 103 93 92 104 100 86 98 102 100 94 75 114 88 105 99 98 92 87 103 75 75 75 75 74 74 74 73 73 73 73 73 72 72 71 70 69 68 67 67 67 66 66 66 65 65 65 65 64 64 64 63 62 62 61 61 61 61 37 22 24 17 24 8 26 17 37 23 37 4 24 22 12 22 26 36 13 24 13 15 18 15 13 13 -13 13 4 13 28 18 10 8 9 19 16 20 Таблица 1 b 2 Кальцимиметические соединения, вызывающие реакцию сильнее 40% в концентрации ЗЗнг/мл в клетках НЕК-293, экспрессирующих человеческий рецептор кальция Код соединения % активности в четырех концентрациях (нг/мл) 3300 330 33 3,3 контрольные соединения R-568 17Р 17Х 18С 23Т 4V 8G 231 21М 240 3U 9А 95 101 105 99 102 137 69 86 93 24 54 51 87 74 93 84 102 102 114 89 82 60 60 59 59 58 58 58 57 56 18 31 6 3 17 8 6 47 55374 48 Продолжение таблицы 1 b 2 Код соединения контрольные соединения 12М 12В 21Р 8Т 10L/10m 241 14N 23R 23S 21Т 10W/10X 13Т 6R 201 24А 12D 6Х 18Т 21Х 23J 10Z 16Z 23N 16U 11D 23Х 17А 20J 22Х 23U 9Z 16J 25N 4Р 230 13Q 4G 12Y 12L 23F 11W 8Н 25V 25W 10R 21N 8S 8Х 13Е % активности в четырех концентрациях (нг/мл) 3300 330 33 3,3 98 130 109 104 133 122 128 99 119 102 92 94 111 89 95 124 123 86 110 92 85 99 84 89 86 97 112 81 90 94 87 85 109 84 74 101 61 96 88 96 85 96 94 88 80 86 87 74 76 73 81 79 95 83 80 88 82 81 88 59 69 82 98 73 75 94 56 56 56 55 55 55 55 54 53 53 53 53 52 52 52 52 52 52 51 51 51 51 50 50 50 49 49 48 48 48 48 47 46 46 46 46 46 46 45 45 44 44 43 42 42 42 42 40 40 11 4 13 13 4 11 15 13 3 3 4 6 7 12 9 5 10 14 2 29 5 9 2 4 4 1 7 8 10 3 4 31 8 8 13 5 10 10 5 2 7 26 8 7 4 7 19 2 Таблица 1 с Кальцимиметические соединения, вызывающие реакцию сильнее 40% в концентрации ЗЗОнг/мл в клетках НЕК-293, жспрессирующих человеческий рецептор кальция Код соединения контрольные соединения R-568 17Р % активности в четырех концентрациях 3300 330 33 (нг/мл) 3,3 95 101 24 54 69 86 49 55374 50 Продолжение таблицы 1 с Код соединения % активности в четырех концентрациях (нг/мл) 3300 330 33 3,3 контрольные соединения 17Х 105 7Х ЗН 3L 160 8O/8Q 14А 23L 1Т 7W 4Н 8D 5М 4U 24Е 16М 4М 2S 17V 2Х 23D 4Р 5В/5С ЗМ 16К 5D 4D 24В 24Н 5L 2Y 5G 3V 2Q 14В 13Z 8А 24D 1D 131 ЗВ 8С 14Н 7U 5Е 13Н 13Y 4J 141 4В 3D 3R ЗА 14J 41 85 84 81 81 80 78 77 76 76 77 75 73 72 71 68 68 67 66 66 66 65 65 64 62 62 61 61 60 60 59 58 56 56 55 54 54 53 53 52 52 51 49 49 48 48 47 47 45 45 45 45 41 41 40 129 124 98 107 94 130 91 91 78 76 81 75 93 87 85 112 88 106 80 55 93 51 28 21 14 10 37 2 0 7 9 37 21 35 11 34 29 27 15 35 32 20 19 36 18 13 34 32 16 10 16 14 4 11 22 6 4 -1 13 8 11 13 4 5 34 39 3 15 1 5 5 7 36 2 8 11 8 4 2 7 6 9 12 4 7 5 55374 51 52 Таблица 2 Арилалкиламиновые кальцимиметики по фиг 1, активные по отношению к рецептору кальция паращитовидной железы in vitro (EC50 ^ 5мкМ) Код соединения (по фиг 1) NPS R-467 NPS R-568 3U 3V 4А 4В 4С 4D 4G 4Н 4J 4М 4N 4Р 4R/6V 4S 4T/4U 4V 4W 4Y 4Z/5A 5В/5С 5W/5Y 6Е 6F(R,R-) 6R 6Т 6Х 7W 7Х 8D 8J 8К 8R 8S 8Т 8U 8Х 8Z 9С 9D 9R 9S 10F 11D ЕС5о (мкМ) 2,0 0,60 0,64 1,8 1,4 2,0 2,0 4,4 1,8 >3,0 2,2 2,1 0,8 1,6 4,2 3,3 1,6 2,5 2,3 1,3 4,4 2,8 3,6 2,7 0,83 3,4 2,9 2,5 3,2 1,1 2,5 0,78 1,3 2,6 1,7 1,8 0,44 0,76 0,40 0,60 1,4 0,25 4,8 0,89 1,8 Примеры 6-17 Синтез соединений Соединения, описанные в настоящем документе, могут быть синтезированы стандартными способами, например, как описано в Nemeth et al , PCT/US93/01642, международная публикация № WO 94/18959 Ниже приведены примеры типичных процедур синтеза соединений, описанных в настоящем документе Соединения 9R, 14U и 17Р были приготовлены посредством восстановительного аминирования промышленного альдегида или кетона первичным амином в присутствии цианборгидрида натрия или триацетоксиборгидрида натрия Со Код соединения (по фиг 1) 11Х 11Y 12L 12U 12V 12W 12Y 12Z 13Q 13R 13S 13U 13Х 14L 14Q 14U 14V 14Y 15G 16Q 16R 16Т 16V 16W 16Х 17М 170 17Р 17R 17W 17Х 20F 20I 20J 20R 20S 21D 21F 21G 210 21Р 21Q 21R 25С 25D ЕС5о (мкМ) 0,83 2,8 1,7 1,2 0,42 3,2 2,0 0,11 са 0,8 0,25