Спосіб очищення рекомбінантного фсг

Реферат: Винахід належить до способу очищення рекомбінантного фолікулостимулюючого гормону (ФСГ) або варіанта рекомбінантного ФСГ. Спосіб включас стадії, на яких рідину, що містить рекомбінантний ФСГ або варіант рекомбінантного ФСГ, піддають аніонообмінній хроматографії, хроматографії гідрофобної взаємодії і хроматографії по спорідненості до барвника, причому ці хроматографічні стадії можуть бути виконані в будь-якому порядку, і причому даний спосіб не включає ні слабку аніонообмінну хроматографію, ні хроматографію з оберненою фазою. В результаті способу очищения одержують високий вихід рекомбінантного ФСГ з необхідною мірою чистоти. Одержаний ФСГ є надзвичайно ефективним для профілактики і лікування захворювань і медичних показань, при яких препарати ФСГ вважаються ефективним засобом лікування. UA 106369 C2 (12) UA 106369 C2 UA 106369 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід стосується способу очищення рекомбінантного фолікулостимулюючого гормону (ФСГ) або варіанта рекомбінантного ФСГ. Спосіб включає стадії, на яких рідину, що містить рекомбінантний ФСГ або варіант рекомбінантного ФСГ, піддають аніонообмінній хроматографії, хроматографії гідрофобної взаємодії і хроматографії по спорідненості до барвника, причому ці хроматографічні стадії можуть бути виконані в будь-якому порядку, і причому даний спосіб не включає ні слабку аніонообмінну хроматографію, ні хроматографію з оберненою фазою. В результаті способу очищення одержують високий вихід рекомбінантного ФСГ з необхідною мірою чистоти. Одержаний ФСГ є надзвичайно ефективним при профілактиці і лікуванні захворювань і медичних показаннях, при яких препарати ФСГ вважаються ефективним засобом лікування. Фолікулостимулюючий гормон (ФСГ) продукується гонадотропними клітинами передньої частки гіпофіза і виділяється в кровотік. ФСГ діє спільно з лютеїнізуючим гормоном (ЛГ) при контролі дозрівання ооцитів у жінок і сперматогенезу у чоловіків. І ФСГ, і ЛГ належать до сімейства гетеродимерних глікопротеїнов, які складаються з двох нековалентно зв'язаних α- і βланцюгів, які кодуються різними генами. І α-, і β-ланцюги є глікозилованими. α-субодиниця складається з 92 амінокислотних залишків, в той час як β-субодиниця складається з 111 амінокислотних залишків, кожна з яких має дві потенційних аспарагінзв'язаних ділянки глікозилування. ФСГ людини використовують для лікування жінок, страждаючих відсутністю овуляції, для стимуляції множинної овуляції (суперовуляції) і при підготовці до штучного запліднення, такого як ЕКЗ, ІКСІ, GIFT (перенесення гамет в маточну трубу) або CIFT. Крім того, ФСГ людини використовують для стимуляції дозрівання фолікулів у жінок з низькою або відсутньою секрецією ФСГ і для стимулювання сперматогенезу у чоловіків, страждаючих олігоспермією. При стандартній схемі лікування для стимуляції овуляції, пацієнтці призначають щоденні ін'єкції ФСГ або варіанта (приблизно від 75 до 450 МО ФСГ/день) протягом періоду від приблизно 6 до приблизно 12 днів. При стандартній схемі лікування для контрольованої гіперстимуляції яєчників, пацієнтці призначають щоденні ін'єкції ФСГ або варіанта (приблизно від 150 до 600 МО ФСГ/день) протягом періоду від приблизно 6 до приблизно 12 днів. Для стимуляції сперматогенезу, схема лікування з використанням 150 МО ФСГ три рази на тиждень в комбінації з 2500 МО хоріонічного гонадотропного гормону людини (hCG) два рази на тиждень була результативна для досягнення підвищення числа сперматозоїдів у чоловіків, страждаючих гіпогонадотропним гіпогонадизмом. До 1980-х років основним джерелом людського ФСГ був ФСГ, присутній в сечі, виділений з сечі жінок дітородного віку. Далі, в 1990-х роках була представлена очищена форма високочистого ФСГ, одержаного з сечі, і в кінцевому результаті, рекомбінантний ФСГ був створений і широко розповсюджений з 1998 року. З появою методу рекомбінантних ДНК стало можливо синтезувати людський ФСГ в клітинних культурах, трансфекованих послідовностями нуклеїнових кислот, що кодують α- і β-ланцюг. Послідовності ДНК, що кодують α- і β-ланцюги, і способи синтезу рекомбінантного ФСГ були розкриті, наприклад, в міжнародній публікації WO 88/10270, WO 86/04589 і EP 0735139. На даний час існують два комерційних продукти рекомбінантного людського ФСГ на ринку Німеччини, GONAL-f® і Puregon®, обидва одержані в результаті експресії послідовностей ДНК, що кодують людські α- і β-ланцюги дикого типу в клітинах яєчника китайського хом'ячка (CHO). Внаслідок важливості ФСГ при лікуванні порушень фертильності, необхідне забезпечення рекомбінантним ФСГ високої чистоти і високої специфічної активності. Лікування за допомогою ФСГ вимагає багаторазових ін'єкцій. Високоочищені препарати ФСГ можна вводити підшкірно, що забезпечує введення ліків пацієнтом самостійно, без контролю лікаря, тим самим збільшуючи зручність застосування і додержання режиму лікування пацієнтом. У міжнародній патентній заявці WO 2006/051070 A1, що належить Ares Trading S.A., описаний спосіб очищення рекомбінантного ФСГ, який включає наступні стадії: 1) хроматографія по спорідненості до барвника, 2) хроматографія гідрофобної взаємодії і 3) хроматографія з оберненою фазою. Крім того, в WO 2006/051070 A1 розкритий спосіб очищення ФСГ, який включає стадії, на яких ФСГ піддають 1) аніонообмінній хроматографії, 2) хроматографії по спорідненості до барвника, 3) хроматографії гідрофобної взаємодії, 4) хроматографії з оберненою фазою і 5) аніонообмінній хроматографії. Міжнародна патентна заявка WO 2005/063811 A1, що належить Ares Trading S.A., стосується способу очищення рекомбінантного людського ФСГ, який включає стадії (1) іонообмінної хроматографії; (2) хроматографії з іммобілізованими іонами металу і (3) хроматографії гідрофобних взаємодій (HIC). 1 UA 106369 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У міжнародній патентній заявці WO 2007/065918 A2, що належить Ares Trading S.A., описаний спосіб очищення ФСГ, який включає стадії хроматографії: хроматографія по спорідненості до барвника, слабка аніонообмінна хроматографія, хроматографія гідрофобних взаємодій і сильна аніонообмінна хроматографія, які можуть бути виконані в будь-якому порядку. Існує постійна потреба в нових способах очищення рекомбінантного ФСГ і варіантів ФСГ. Зокрема, існує потреба в способах очищення, які дозволяють уникнути здійснення стадій хроматографії з оберненою фазою. Крім того, бажано мати спосіб очищення, який не оснований на імуноафінній хроматографії, але може бути здійснений без цієї дорогої стадії. Відповідно до даного винаходу, ця і додаткові проблеми вирішені за допомогою ознак, включених в основний пункт формули винаходу. Переважні варіанти здійснення визначені в залежних пунктах формули винаходу. Метою винаходу є розробка нового, ефективного способу очищення рекомбінантного ФСГ або варіанта рекомбінантного ФСГ. У першому аспекті, винахід стосується способу очищення рекомбінантного людського ФСГ або варіанта ФСГ, виходячи з рідини, що містить неочищений ФСГ, який включає наступні стадії: - аніонообмінна хроматографія, - хроматографія гідрофобних взаємодій і - хроматографія по спорідненості до барвника, які можуть бути здійснені в будь-якому порядку, причому даний спосіб дозволяє уникнути застосування будь-якої слабкої аніонообмінної хроматографії, а так само будь-якої хроматографії з оберненою фазою. У іншому варіанті здійснення, інші стадії хроматографії здійснюють в наступному порядку: (1) аніонообмінна хроматографія, (2) хроматографія гідрофобних взаємодій і (3) хроматографія по спорідненості до барвника. Аніонообмінна хроматографія (АЕС) основана на взаємодіях заряд-заряд між білками в даному зразку і зарядами, іммобілізованими на смолі. У аніонообмінній хроматографії зв'язуючі іони даних білків є негативними, а іммобілізована функціональна група є позитивною. Поширеними аніонообмінними смолами є Q-смола, четвертинний амін і смола DEAE (DiEthylAminoEthane, ДіЕтилАміноЕтан). Проте, в більшості випадків, стадія аніонообмінної хроматографії може бути здійснена зі всіма стандартними комерційно доступними аніонообмінними смолами або мембранами. Аніонообмінні смоли можуть бути використані у вигляді попередньо залитих колонок. Альтернативно, колонки можна підготувати самостійно. За винятком звичайних, не існує ніяких специфічних обмежень відносно місткості і конфігурації колонок. Фахівець знає, що кількість використовуваної аніонообмінної смоли залежить від загального вмісту білка в рідині клітинної культури або будь-якій іншій рідині, наприклад елюаті, одержаному на попередній стадії хроматографії, внесеній в колонку на стадії поглинання. Стандартні сильні аніонообмінні смоли, які можна використовувати з метою даного винаходу, містять такі функціональні групи, як: молекули четвертинного аміноетилу (QAE), смоли включають, наприклад, Toyopearl QAE (є в наявності у Tosoh Bioscience, Germany), Selectacel QAE (четвертинний аміноетил, похідне целюлози, є в наявності у Polysciences Inc., Pennsylvania USA) і інші; молекули четвертинного амонію (Q), смоли включають, наприклад, Q Sepharose XL, Q Sepharose FF, Q Sepharose HP (є в наявності у GE Healthcare, Germany), Resource Q (є в наявності у GE Healthcare, Germany), Macro Prep High Q (Bio-Rad, California, USA), Toyopearl Super Q (є в наявності у Tosoh Bioscience, Germany), UNOsphere Q (є в наявності у Bio-Rad, California, USA), і групи триметиламонійетилу (TMAE), смоли включають, наприклад, Fractogel EMD TMAE (є в наявності у Merck, Germany). Аніонообмінна хроматографія переважно являє собою сильну аніонообмінну хроматографію, яка здійснюється з використанням сильної аніонообмінної смоли, що має функціональні групи -N+(CH3)3, або смоли з аналогічними характеристиками. Переважні приклади сильних аніонообмінних смол, які можуть бути використані з метою винаходу, являють собою сильні аніонообмінні смоли з четвертинним амонієм, відомі в рівні техніки як UNOsphere Q, Q Sepharose HP і інші смоли, що мають молекули четвертинного амонію (Q). Характерними особливостями сильної аніонообмінної смоли UNOsphere Q є наступні: Функціональна група -N+(CH3)3 Загальна іонна місткість 120 мкекв./мл Динамічна зв'язуюча місткість 150 см/год. 2 UA 106369 C2 Транспортний протиіон Середній розмір частинок Рекомендований діапазон лінійної швидкості потоку Хімічна стабільність 5 10 15 180 мг/мл 600 см/год. 125 мг/мл Cl 120 мкм 50-1200 см/год. 1,0 M NaOH (20 °C) до 2000 годин 1,0 M HCl (20 °C) до 200 годин Зміни об'єму pH 4-10 30000 мТеоретичні тарілки 1 Колонки SuperdexTM PC 3.2/30 3,2×300 Розміри шару мм Об'єм шару 2,4 мл Рекомендований об'єм 2-25 мкл зразка 24 бар (348 Макс. тиск фунт/кв. дюйм, 2,4 МПа) Макс. швидкість потоку 0,100 (H2O при 25 °C) мл/хв. >30000 мТеоретичні тарілки 1 20 % Зберігання етиловий спирт від 4 °C Температура зберігання до 30 °C 5 10 15 20 25 30 Стадія SEC може бути здійснена відповідно до протоколу виробника. Наприклад, натрійфосфатний буфер можна використовувати при значенні рН від 6 до 8, переважно при рН приблизно 7,0. У переважному варіанті здійснення винаходу, спосіб за винаходом включає наступні стадії в наступному порядку: перша аніонообмінна хроматографія, хроматографія гідрофобних взаємодій, хроматографія по спорідненості до барвника, катіонообмінна хроматографія, друга аніонообмінна хроматографія і ексклюзійна хроматографія. У переважному варіанті здійснення стадію катіонообмінної хроматографії в способі за винаходом здійснюють на мембранному катіонообміннику. Переважно, катіонообмінну стадію проводять з сильним кислотним катіонообмінником сульфоновою кислотою, зафіксованою на мембрані, або з обмінником, що має аналогічні характеристики. Крім того, спосіб за винаходом включає одну або декілька стадій ультрафільтрації і/або нанофільтрації. Ультрафільтрація являє собою вид мембранної фільтрації, при якій гідростатичний тиск витісняє рідину через напівпроникну мембрану. Зважені речовини і розчинені речовини з високою молекулярною масою утримуються, в той час як вода і низькомолекулярні розчинені речовини проходять через дану мембрану. Ультрафільтрація являє собою поширений спосіб розділення для очищення і концентрування макромолекулярних розчинів, особливо білкових розчинів. Ультрафільтрація є схожою з нанофільтрацією, однак вони розрізнюються по розмірах утримуваних молекул. У концепції даного винаходу, переважним є ізолювання молекулярної ваги 10 кДа (10 кДа УФ). УФ-мембрани, крім того, можуть бути використані для діафільтрації, для видалення солей і інших мікрочастинок з розчину за допомогою повторного або безперервного розведення і реконцентрації. У переважному варіанті здійснення винаходу процес очищення включає одну або декілька стадій ультрафільтрації/діафільтрації і/або нанофільтрації. Ці стадії фільтрації можуть бути здійснені з використанням комерційно доступних фільтраційний пристроїв, наприклад, що є в наявності у GE Healthcare або Sartorius. Ультрафільтрацію переважно здійснюють з використанням касет Sartocon і касет Sartocon Slice, що випускаються фірмою Sartorius. 9 UA 106369 C2 Мембрана Ізольована молекулярна вага Фільтруюча поверхня Тиск подачі pH стабільності Робоча температура Очищення Дезінфекція Зберігання 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Поліефірсульфон (PESU) або Hydrosart® 10 кД від 0,02 до 0,7 м2 4 бар (58 фунт/кв. дюйм) максимум 1-14 50 °C максимум, при 20 °C 1 M NaOH, 40 °C 1 M NaOH, 40-50 °C, 30 хв. 0,1 M NaOH Поліефірсульфонова мембрана (PESU), використовувана в касетах з перехресним потоком, що випускаються фірмою Sartorius, являє собою стабільний мембранний полімер, який має широкий спектр значень рН і температури. Також можна використовувати ультрафільтраційні касети Hydrosart®, що випускаються компанією Sartorius. Hydrosart являє собою мембрану на основі стабілізованої целюлози, яка була оптимізована для біотехнологічного застосування. Ультрафільтраційні мембрани і касети Hydrosart доступні в наступних номінальних межах молекулярної маси: 2 кД, 5 кД, 10 кД і 30 кД. У переважному варіанті здійснення спосіб очищення включає стадію нанофільтрації. Нанофільтрація може бути здійснена з використанням будь-якого ефективного нанофільтруючого пристрою. Нанофільтрацію переважно здійснюють з використанням фільтрів Planova, що є в наявності у фірми Asahi Kasei Medical Co., Ltd. Фільтри Planova призначені для видалення вірусів під час виробництва біотерапевтичних готових лікарських форм, таких як біофармацевтичні препарати. Вони основані на мікропористій порожнистоволоконній мембрані, створеній з целюлози, регенерованої гідрофільним мідноаміачним розчином, з вузьким розподілом пор, фільтри Planova доступні у вигляді одноразових автономних модулів в чотирьох середніх розмірах пор 15 нм, 19 нм, 35 нм і 72 нм (Planova 15N, 20N, 35N і 75N, відповідно). У технологічному процесі за винаходом переважним є використання фільтра Planova 15N, тобто фільтра, що має середній розмір пор 15 нм. Фільтр використовують відповідно до протоколу постачальника. Переважно, щоб спосіб очищення ФСГ за винаходом не включав металоіонну афінну хроматографію. Крім того, також переважно, щоб спосіб за винаходом дозволяв уникнути використання імуноафінної хроматографії. Очищення ФСГ без стадії імуноафінної хроматографії виключає можливість виникнення взаємодії домішок або інфекційних агентів, одержаних під час підготовки антитіла, із сполукою ФСГ. У іншому варіанті здійснення, винахід стосується способу очищення рекомбінантного ФСГ або варіанта рекомбінантного ФСГ, який включає стадію, на якій рідину, що містить вказаний ФСГ або варіант ФСГ, піддають впливу мембранного катіонообмінника. У переважному варіанті здійснення, мембранний катіонообмінник являє собою сильний кислотний катіонообмінник сульфонову кислоту, зафіксовану на мембрані, або обмінник, що має аналогічні характеристики. Придатні мембранні адсорбери для використання в способі за винаходом відомі в рівні техніки і є в наявності у декількох постачальників. Наприклад, метод катіонообмінної хроматографії за винаходом може бути здійснений з використанням мембрани, яка виготовлена з регенерованої целюлози і має хроматографічний матрикс з сульфонової кислоти, сформований на даному целюлозному каркасі. Прикладом придатного мембранного адсорбера є мембранні адсорбери Sartobind S membrane Adsorbers, що випускаються фірмою Sartorius. Їх технічні деталі представлені вище. У іншому варіанті здійснення, спосіб очищення рекомбінантного ФСГ або варіанта рекомбінантного ФСГ включає стадію, на якій рідину, що містить ФСГ, піддають мембранному катіонообміну, що додатково включає хроматографію гідрофобної взаємодії. Метод хроматографії гідрофобної взаємодії за винаходом можна здійснити, як описано вище, застосовно до способу очищення рекомбінантного ФСГ або варіанта рекомбінантного ФСГ, який включає стадії, на яких рідину, що містить вказаний ФСГ або варіант ФСГ, піддають аніонообмінній хроматографії, хроматографії гідрофобних взаємодій і хроматографії по спорідненості до барвника, які здійснені в будь-якому порядку, причому спосіб не включає ні слабку аніонообмінну хроматографію, ні хроматографію з оберненою фазою, і його переважних варіантів здійснення. 10 UA 106369 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У переважному варіанті здійснення, хроматографію гідрофобних взаємодій здійснюють з використанням смоли, що складається з гранул перехреснозшитої агарози, дереватизованої фенільними або бутильними групами, або смоли, що має аналогічні характеристики. Якщо не вказане інше, наступні визначення призначені для пояснення і позначення значення і сфери застосування різних термінів, використаних для опису даного винаходу. Термін "ФСГ" стосується поліпептиду фолікулостимулюючого гормону як повнорозмірного зрілого білка, який включає, але не обмежуючись цим, ФСГ людини або "лФСГ", або одержаний рекомбінантним способом, або виділений з організму людини, наприклад з сечі жінок, що знаходяться в постклімактеричному періоді. Послідовність білка глікопротеїну людини і послідовність білка β-субодиниці ФСГ людини відомі фахівцю в даній галузі з наукової і патентної літератури (див., наприклад, WO 2004/087213). Амінокислотна послідовність α-ланцюга ФСГ людини представлена в SEQ ID NO: 1 і амінокислотна послідовність β-ланцюга ФСГ людини представлена в SEQ ID NO: 2, які додані до цього опису. Ці амінокислотні послідовності відповідають амінокислотним послідовностям дикого типу α- і β-ланцюгів ФСГ людини, як зареєстровано під інвентарним номером J 00152 в базі даних EMBL і під інвентарним номером NM_000510 в базі даних NCBI, відповідно. Послідовності нуклеїнових кислот дикого типу, що кодують ФСГ людини, представлені в SEQ ID NO: 3 (=α-ланцюг) і 4 (=β-ланцюг). Рекомбінантний ФСГ може кодуватися послідовністю нуклеїнової кислоти дикого типу, яка є природною для людей, або він може кодуватися зміненою послідовністю нуклеїнової кислоти, експресія якої в результаті приводить до ФСГ, що має амінокислотну послідовність дикого типу, тобто послідовність білка дикого типу, властиву людині. Послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує ФСГ людини, може, наприклад, бути змінена таким чином, що одна або обидві послідовності нуклеїнових кислот, які кодують α- і β-ланцюги ФСГ людини, є пристосованими для частоти використання кодонів в клітинах яєчника китайського хом'ячка (СНО), з метою підвищення рівня експресії і виходу рекомбінантного ФСГ в цих клітинах-хазяїнах. Приклад послідовностей нуклеїнових кислот, які кодують ФСГ людини і які були модифіковані з урахуванням частоти використання кодонів в клітинах СНО, описані в міжнародній патентній заявці WO 2009/000913. Модифікована послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує β-ланцюг ФСГ людини, являє собою кодуючу область послідовності нуклеїнової кислоти, описаної в SEQ ID NO: 5 (в SEQ ID NO: 5 що кодує область починається з нуклеотиду 56 і продовжується до нуклеотиду 442), і модифікована послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує α-ланцюг ФСГ людини, являє собою кодуючу область послідовності нуклеїнової кислоти, описаної в SEQ ID NO: 6 (в SEQ ID NO: 6 що кодує область починається з нуклеотиду 19 і продовжується до нуклеотиду 366). Клітинна лінія СНО, яка містить рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти, що включає першу модифіковану послідовність, що кодує β-ланцюг ФСГ людини, і другу модифіковану послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує α-ланцюг ФСГ людини, була депонована 28 березня 2007 в базі даних DSMZ в Braunschweig під депозитарним номером DSM ACC2833. У переважному варіанті здійснення, рідка композиція ФСГ за даним винаходом містить рекомбінантний ФСГ дикого типу людини, який одержаний в результаті експресії рекомбінантного гена з послідовностей нуклеїнових кислот ФСГ, які модифіковані з урахуванням частоти використання кодонів в клітинах СНО відносно як β-ланцюга ФСГ людини, так і α-ланцюга ФСГ людини. У іншому переважному варіанті здійснення, рекомбінантний ФСГ одержують в результаті експресії з послідовностей нуклеїнових кислот ФСГ, розкритих в WO 2009/000913. Термін "варіант ФСГ" охоплює молекули, які відмінні амінокислотним складом, характером глікозилування або міжсубодиничними зв'язками від ФСГ людини, але демонструють активність ФСГ. Приклади включають CTP-FSH, модифікований рекомбінантний ФСГ пролонгованої дії, що складається з α-субодиниці дикого типу і гібридної β-субодиниці, де карбоксикінцевий пептид hCG злитий з С-кінцем β-субодиниці ФСГ, як описано у LaPolt et al. (1992) Endocrinology, 131, 2514-2520; або Klein et al. (2003) Human Reprod., 18, 50-56. Також враховується одноланцюжковий CTP-FSH, одноланцюжкова молекула, описана у Klein et al. (2002) Fertility & Sterility, 77, 1248-1255. Інші приклади варіантів ФСГ включають молекули ФСГ, що мають додаткові ділянки глікозилування, вбудовані в α- і/або β-субодиницю, як розкрито в міжнародній публікації WO 01/58493, і молекули ФСГ зі зв'язками S-S між субодиницею, як розкрито в WO 98/58957. Інші приклади варіантів ФСГ розкриті в WO 2004/087213, для яких характерні карбоксикінцеві делеції β-субодиниці. Інші приклади варіантів ФСГ включають молекули ФСГ, що мають змінену міру глікозилування в порівнянні з ФСГ дикого типу в результаті змін 11 UA 106369 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислотної послідовності білка, за допомогою яких вводиться додаткова ділянка (ділянки) глікозилування або видаляється природна ділянка (ділянки) глікозилування. Крім того, ФСГ або варіант ФСГ за винаходом може являти собою молекулу ФСГ, яка була модифікована за допомогою хімічних речовин. Такі кон'югати ФСГ можуть, наприклад, містити поліалкіленгліколь (наприклад, ПЕГ), гідроксіалкілкрохмаль (наприклад, HES) або інші полімерні молекули. Гетеродимери ФСГ або гетеродимери варіанта ФСГ можуть бути одержані будь-яким придатним способом, наприклад рекомбінантно, за допомогою виділення або очищення з природних джерел або за допомогою хімічного синтезу, або за допомогою будь-якої їх комбінації. Використання терміна "рекомбінантний" стосується композицій ФСГ або варіанта ФСГ, які одержані в результаті застосування технологій рекомбінантних ДНК (див., наприклад, міжнародну публікацію WO 85/01958). Послідовності геномної і кДНК клонів ФСГ відомі для α- і β-субодиниць декількох біологічних видів. Різні способи одержання рекомбінантного ФСГ абоваріантів ФСГ з використанням рекомбінантної технології описані в попередньому рівні техніки, див., наприклад, європейську патентну заявку EP 0711894 і європейську патентну заявку EP 0487512. Переважно, ФСГ, очищений відповідно до винаходу, має α-субодиницю, відповідну послідовності SEQ ID NO: 1, і β-субодиницю, відповідну послідовності SEQ ID NO: 2. У іншому аспекті, винахід стосується очищеного білка ФСГ або варіанта ФСГ, одержаного в результаті застосування способу очищення за винаходом. Винахід додатково стосується фармацевтичної композиції, яка містить ФСГ або варіант ФСГ, очищений способом за винаходом, а також фармацевтично прийнятний ексципієнт. У переважному варіанті здійснення, фармацевтична композиція містить консервант і може бути використана для багаторазового застосування. Переважні фармацевтичні композиції описані в PCT/EP2009/051451. Крім того, винахід також стосується застосування ФСГ або варіанта ФСГ, очищеного способом за винаходом, або застосування фармацевтичної композиції, що містить вказаний ФСГ або варіант ФСГ в комбінації з фармацевтично прийнятними ексципієнтами, при лікуванні порушень фертильності. Рекомбінантний ФСГ людини очищають з супернатанту культури клітин-хазяїнів способом за винаходом. Рекомбінантний людський ФСГ або варіант ФСГ переважно одержують, як описано в міжнародній патентній заявці WO 2009/000913. Найбільш переважно, ФСГ являє собою людський ФСГ, одержаний рекомбінантно, зокрема переважно одержаний в клітинах яєчника китайського хом'ячка, трансфекованих вектором або векторами, що містять ДНК, яка кодує глікопротеїн α-субодиниці і β-субодиниці ФСГ людини, кодовані або послідовностями SEQ ID NO: 3 і 4 (= послідовності нуклеїнових кислот дикого типу), або послідовностями SEQ ID NO: 5 і 6 (= кодон-оптимізовані послідовності нуклеїнових кислот). ДНК, які кодують α- і β-субодиниці, можуть знаходитися в одному і тому ж або в різних векторах. Рекомбінантний ФСГ має декілька переваг над його аналогом, виділеним з сечі. Методи культивування і виділення з використанням рекомбінантних клітин забезпечують відповідність між експериментальними серіями. На відміну від цього, ФСГ, виділений з сечі, значно розрізнюється від серії до серії такими характеристиками, як чистота, характер глікозилування, сіалування і окислення субодиниць. В результаті кращої відповідності характеристик між серіями і чистоти рекомбінантного ФСГ, даний гормон може бути швидко ідентифікований і визначений кількісно з використанням таких технологій, як ізоелектричне фокусування (IEF). Простота ідентифікації і кількісного визначення рекомбінантного ФСГ дозволяє наповнювати ампули по масі гормону (заповнення по масі), а не на основі біооцінки. Термін "активність ФСГ" стосується здатності сполуки ФСГ викликати біологічні реакції, пов'язані з ФСГ, такі як збільшення маси яєчника в тесті Steelman-Pohley (Steelman et al. (1953) Endocrinology 53, 604-616) або фолікулярного росту у пацієнтки. Фолікулярний ріст у пацієнтки може бути оцінений за допомогою ультразвукового дослідження, наприклад, в перерахунку на фолікули, що мають середній діаметр приблизно 16 мм на 8 день стимуляції. Біологічну активність оцінюють відносно загальноприйнятого стандарту для ФСГ. Специфічна біоактивність рекомбінантного ФСГ in vivo знаходиться, звичайно, в діапазоні від приблизно 8000 МО ФСГ/мг білка до приблизно 16000 МО ФСГ/мг білка. Наприклад, рекомбінантний ФСГ в комерційно доступному продукті Puregon (Organon) має специфічну біоактивність приблизно 10000 МО/мг білка, а для Gonal-f від Serono біоактивність рекомбінантного ФСГ людини становить приблизно 13600 МО/мг білка. 12 UA 106369 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Активність ФСГ може бути визначена відомими способами, що стосуються ФСГ і інших гонадотропінів. Такі способи включають, наприклад, аналіз імунної активності ферменту (EIA) або аналіз гена-репортера. Біоактивність звичайно визначають за допомогою біотесту, описаного в 5 Виданні Європейської фармакопеї (European Pharmacopoeia, 5th Edition) для ФСГ, виділеного з сечі, біоактивність оцінюють в результаті порівняння ефекту ФСГ на збільшення яєчників нестатевозрілих щурів, підданих впливу хоріонічного гонадотропіну з таким же ефектом Стандартного Препарату. Біологічну активність ФСГ або варіанта ФСГ можна оцінити, порівнюючи, при заданих умовах, його ефект на збільшення яєчників нестатевозрілих щурів, підданих впливу хоріонічного гонадотропіну, з таким же ефектом, використовуючи міжнародний стандартний препарат або еталонний препарат, відкалібрований в Міжнародних Одиницях (Європейська Фармакопея, 5 Видання). Вимірювання активності ФСГ in vitro описане, наприклад, у Albanese et. al. (1994) Mol. Cell Endocrinol. 101: 211-219. Чистота ФСГ або варіанта ФСГ, одержаного способом за винаходом, складає щонайменше 95 %, переважно щонайменше 97 %, більш переважно щонайменше 99 % і найбільш переважно більше ніж 99 %. Міра чистоти може бути визначена за допомогою аналізу методом ВЕРХ. Придатні матеріали і протоколи для проведення такого аналізу можуть бути одержані від комерційних постачальників, таких як Vydac або TOSOH Bioscience. Подальші приклади представлені виключно для додаткової ілюстрації способу очищення за винаходом. Сфера застосування винаходу не повинна розглядатися як така, що усього лише складається з наступних прикладів. ПРИКЛАДИ Приклад 1 Одержання рекомбінантного ФСГ людини за допомогою рекомбінантних технологій Рекомбінантний ФСГ людини продукується в трансфекованих клітинах-хазяїнах СНО стандартними способами. Ці методи включають одержання клону клітини СНО, який продукує рекомбінантний ФСГ людини з однієї або декількох рекомбінантних молекул нуклеїнових кислот, що кодують α-ланцюг і β-ланцюг ФСГ людини, і культивування даних клітин-хазяїнів при відповідних умовах. Рекомбінантний ФСГ людини потім очищають з клітинної культури відповідно до винаходу. У переважному варіанті здійснення рекомбінантний ФСГ людини одержують, як описано в міжнародній патентній заявці WO 2009/000913. Приклад 2 Очищення ФСГ з клітинної культури Процедура очищення являє собою наступне: Стадія аніонообмінної хроматографії ↓ Стадія HIC (хроматографія гідрофобних взаємодій) ↓ Стадія хроматографії по спорідненості до барвника ↓ Вірусна інактивація ↓ 10 кДа УФ/ДФ (ультрафільтрація/діафільтрація) ↓ Катіонний мембранний адсорбер ↓ Стадія аніонообмінної хроматографії ↓ 10 кДа УФ (ультрафільтрація) ↓ Стадія ексклюзійної хроматографії ↓ Нанофільтрація Тривалість ферментації становила 28 днів і ферментаційний об'єм становив 30 л. Вихід становив 0,22 мкм, профільтрований і розбавлений RO-водою (вода, очищена за допомогою зворотного осмосу) в 3,5 разу. Стадія аніонообмінної хроматографії (AEC) 13 UA 106369 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Розбавлений одержаний супернатант клітинної культури піддавали аніонообмінній хроматографії з використанням сильної аніонообмінної смоли на основі четвертинного амонію, відомої в рівні техніки як UNOsphere Q. Цей матрикс є в наявності у BioRad. Для зрівноваження використовували три об'єми колонки (ОК) 50 мM Tris-HCl, pH 7,6. Колонку навантажували зібраним супернатантом (розбавленим RO-водою у співвідношенні 1:3,5; титр зібраного супернатанту становив приблизно 1,8 мкг ФСГ/мл) і відмивали за допомогою 50 мM Tris-HCl, pH 7,6 (5 ОК). Потім колонку відмивали за допомогою 50 мM TrisHCl, 15 мM NaCl, pH 7,6 (5 ОК), і білок був елюйований з використанням 50 мM Tris-HCl, 200 мM NaCl, pH 7,6 (8 ОК). На даній стадії вихід становив 90 % і більше. Стадія HIC HIC здійснювали з використанням смоли, що складається з гранул перехреснозшитої агарози, дериватизованої фенілом. Фенілсефароза 6 FF (є в наявності у GE Healthcare) є надзвичайно структурованим похідним на основі агарози. Ця речовина є фізично і хімічно стабільною, забезпечуючи високу швидкість потоку і підвищений термін експлуатації смоли. Технічні характеристики цієї смоли представлені вище. Вісім елюатів, одержаних на стадії АЕС, були об'єднані і розбавлені в 3 рази з використанням 50 мM Tris-HCl, 4,5 NaCl, pH 7,6. HIC-колонка була зрівноважена за допомогою 50 мM Tris-HCl, 3 M NaCl, pH 7,6 (4 ОК) і навантажена елюатом, одержаним на стадії АЕС, розбавленим у співвідношенні 1:3. Потім колонку відмивали з використанням 50 мM Tris-HCl, 3 M NaCl, pH 7,6 (3 ОК) і відмивали з використанням 50 мM Tris-HCl, 1,8 M NaCl, pH 7,6 (5 ОК). Було виявлено, що даний відмиваючий буфер з 1,8 M NaCl має хороший потенціал очищення без помітної втрати ФСГ. Даний білок потім був елюйований за допомогою 50 мM Tris-HCl, 0,8 M NaCl, pH 7,6 (6 ОК). Вихід ФСГ на даній HIC-стадії становив >95 % без яких-небудь значних втрат під час навантаження, і з хорошим потенціалом очищення загального білка з приблизним фактором 10. Ці результати демонструють, що проведена HIC-стадія являє собою дуже ефективну стадію очищення із задовільним виходом і якістю продукту. Стадія хроматографії по спорідненості до барвника На даній стадії хроматографії по спорідненості до барвника використовували Blue Sepharose FF, що є в наявності у GE Healthcare. Елюат, одержаний на стадії HIC, був розбавлений в 4 рази за допомогою 50 мM Tris-HCl, pH 7,6. Колонку зрівноважували за допомогою 50 мM Tris-HCl, pH 7,6 (3 ОК) і навантажували розбавленим у співвідношенні 1:4 елюатом, одержаним на стадії HIC. Колонку відмивали за допомогою 50 мM Tris-HCl, pH 7,6 (3 ОК), і білок ФСГ був елюйований задопомогою 50 мM Tris-HCl, 4 M NaCl, pH 7,6 (6 ОК). Після афінної хроматографії була проведена стадія вірусної інактивації за допомогою інкубування даного елюату в 15 % 2-пропанолі протягом 2 годин. Для цієї мети елюат, одержаний на стадії хроматографії по спорідненості до барвника, був розбавлений 2 рази за допомогою 50 мM Tris-HCl, 30 % 2-пропанолом, pH 7,6, в результаті одержавши 50 мM Tris-HCl, 15 % 2-пропанол, 2 M NaCl, pH 7,6. Після інкубування протягом 2 годин даний одержаний на стадії хроматографії по спорідненості до барвника вірусно інактивований елюат був розведений в 2 рази за допомогою 20 мM Tris-HCl, pH 7,0. 10 кДа УФ/ДФ Ультра- і діафільтрацію в більшості випадків проводили згідно зі стандартними протоколами. Ефективними пристроями для УФ/ДФ є ультрафільтраційні/діафільтраційні касети (поліефірсульфон (PESU), 10 кД) виробництва Sartorius (площа фільтра: 14000 см2, УФ-фактор: 13-20, ДФ-фактор: 8-10, навантаження: від 0,1 до 0,5 мг ФСГ/см2). Діафільтрацію з пристроями для УФ/ДФ в більшості випадків проводили з ультрафільтраційними (концентрація) факторами від 13 до 20 і діафільтраційними факторами від 8 до 10. Вірусно інактивований елюат, одержаний на стадії хроматографії по спорідненості до барвника, був діафільтрований в буфері Tris-HCl (20 мM Tris-HCl, pH 7,0) і навантажений безпосередньо на катіонний мембранний адсорбер. Стадія катіонного мембранного адсорбера Метод катіонообмінної хроматографії за даним винаходом був здійснений із застосуванням мембрани, яка виготовлена з регенерованої целюлози і має хроматографічний матрикс з сульфонової кислоти, сформований на даному целюлозному каркасі. Такий мембранний адсорбер є в наявності у Sartorius під комерційною назвою Sartobind S membrane adsorber. Мембранний адсорбер Sartobind S являє собою капсулу з декількома мембранними шарами, на яких іммобілізований ліганд. Мембранні адсорбери мають перевагу короткочасного технологічного процесу і малих об'ємів буфера. Собівартість тесту і часові витрати незначні у зв'язку з одноразовим використанням. 14 UA 106369 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Мембранний адсорбер зрівноважували за допомогою 20 мM Tris-HCl, pH 7,0 (200 мл) і навантажували ультраконцентратом 10 кДа УФ/ДФ (приблизно 100 мл). Даний адсорбер відмивали за допомогою 20 мM Tris-HCl, pH 7,0 (200 мл). Технологічний процес на основі мембранного адсорбера проходить в проточному режимі, що скорочує тривалість процесу. Крім того, немає необхідності в регулюванні умов навантаження відносно наступної стадії обробки (аніонообмінна хроматографія). Вихід продукту в даному проточному процесі був дуже хорошим. Фактично, не було втрати продукту під час процесу з використанням модуля Sartobind S при значеннях рН 6,0, 6,5 і 7,0 в різних буферних системах. Стадія з використанням катіонного мембранного адсорбера є дуже ефективною для очищення HCP (білок клітини-хазяїна). Вихід, від 90 до 95 %, є дуже сприятливим, оскільки очищуваний ФСГ не зв'язується з адсорбером при значенні рН 7,0 в буферній системі 20 мM Tris-HCl. Стадія аніонообмінної хроматографії Другу аніонообмінну хроматографію здійснювали з використанням сильної аніонообмінної смоли на основі четвертинного амонію, відомої в рівні техніки як Q Sepharose HP. Ця смола є в наявності у GE Healthcare. АЕС-колонку зрівноважували за допомогою 20 мM Tris-HCl, pH 7,0 (3 ОК). Одержану за допомогою проточного мембранного адсорбера рідину навантажували на колонку (3 ОК), і дану колонку спочатку відмивали за допомогою 20 мM Tris-HCl, pH 7,0 (2 ОК), потім за допомогою 20 мM Tris-HCl, pH 8,5 (3 ОК) і на закінчення відмивали за допомогою 20 мM Tris-HCl, 60 мM NaCl, pH 8,5 (5 ОК). Потім ФСГ елюювали за допомогою 20 мM Tris-HCl, 130 мM NaCl, pH 8,5 (6 ОК). Елюат, одержаний з Q Sepharose HP, має дуже високу міру чистоти, порівнянну з комерційним продуктом GONAL-f®. 10 кДа УФ Ультрафільтрацію 10 кДа проводили згідно зі стандартними протоколами з використанням ултрафільтраційної касети Sartocon (PESU, 10 кД) виробництва Sartorius (площа фільтра: 3000 см2, УФ-фактор: 10-30, навантаження: від 0,2 до 1,0 мг ФСГ/см2). Ультрафільтрацію проводили в більшості випадків з використанням ультрафільтраційних (концентрування) факторів від 10 до 30. Стадія ексклюзійної хроматографії (SEC) Ексклюзійну хроматографію здійснювали з використанням Superdex 75 pg, є в наявності у GE Healthcare. Колонку зрівноважували за допомогою 50 мM Na-PO4, pH 7,0 (2 ОК). Одержаний на стадії УФ 10 кД ретентат навантажували на дану колонку (0,025 ОК), і колонку відмивали за допомогою 50 мM Na-PO4, pH 7,0 (2 ОК). Елюат, одержаний на стадії SEC, має високу міру чистоти, в такому ж діапазоні, як комерційний продукт GONAL-f®. Нанофільтрація На закінчення, здійснювали нанофільтрацію елюату, одержаного на стадії SEC, використовуючи фільтри Planova 15N, що випускаються компанією Asahi Kasei Medical Co., Ltd., середній розмір пор становить 15 нм. Розрахункове максимальне навантаження становило 2,5 мл/см2. Дану фільтрацію здійснювали відповідно до протоколу фірми-постачальника. Чистоту очищеного ФСГ визначали за допомогою SE-HPLC (ексклюзійна ВЕРХ) і SDSPAGE. Чистота і передбачені домішки одержаного ФСГ були наступні: 45 SE-HPLC (димери і споріднені домішки з вищою молекулярною масою) SDS-PAGE red. (колоїдальний) HCP (родовий) ДНК 50 97 %