Зернові рослини pv-zmir13 (mon863) та композиції і способи їх виявлення

1. Молекула ДНК, яка містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 або комплементарні їм послідовності. 2. Молекула ДНК за п.1, яка містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NО:3, SEQ ID NО:4 або комплементарні їм послідовності. 3. Молекула ДНК за п.2, яка по суті складається з нуклеотидних послідовностей SEQ ID NО:5, SEQ ID NО:7, SEQ ID NО:20, SEQ ID NО:8 і 2 (19) 1 3 SEQ ID NО:1 або SEQ ID NО:2, або шляхом проведення реакції гібридизації нуклеїнової кислоти вказаного щонайменше одного нащадка рослини b), де відбирають нащадка, що гібридизується із зондом, який гібридизується при жорстких умовах гібридизації з однією або декількома послідовностями ДНК, вибраними з групи, яка складається з SEQ ID NО:1 і SEQ ID NО:2; де вказане потомство є рослиною кукурудзи, резистентною до інвазії комахами. 12. Спосіб одержання рослини кукурудзи, резистентної до інвазії комахами, що включає: а) трансформацію клітини рослини кукурудзи молекулою ДНК за будь-яким з пп.1-3; і b) регенерацію рослини кукурудзи з вказаної трансформованої клітини, де вказана рослина кукурудзи містить вказану молекулу ДНК і є резистентною до інвазії комахами. 13. Спосіб захисту рослини кукурудзи від інвазії паразитами, що включає додавання до кукурудзяного корму комах ряду Жорсткокрилих ефективної для досягнення інсектицидного ефекту кількості клітини(ин) або тканини(ин) трансгенної рослини кукурудзи, або її частин, за будь-яким з пп.5, 7 і 8. 14. Спосіб за п.13, де вказана комаха ряду Жорсткокрилі вибрана з групи, яка складається з Diabrotica vergifera, Diabrotica undecimpunctata і Leptinotarsa decemlineata. 15. Пара молекул ДНК, яка містить: першу молекулу ДНК і другу молекулу ДНК, де молекули ДНК мають довжину послідовних нуклеотидів послідовності SEQ ID NО:3, або комплементарної їй послідовності, достатню для функціонування як ДНКпраймерів або зондів для діагностики ДНК, екстрагованої з рослини кукурудзи MON863 або її потомства. 16. Пара молекул ДНК за п.15, де вказана перша молекула ДНК містить 11 або більше послідовних нуклеотидів будь-якої частини трансгенної ділянки послідовності SEQ ID NО:3, або комплементарної їй послідовності, і вказана друга молекула ДНК містить 5'-фланковану ділянку геномної ДНК кукурудзи послідовності SEQ ID NО:3, або комплементарну їй послідовність, аналогічної довжини. 17. Пара молекул ДНК за п.16, де вказана перша молекула ДНК містить 11 або більше послідовних нуклеотидів 5'-трансгенної ділянки послідовності ДНК із послідовністю SEQ ID NО:7, або комплементарної їй послідовності, і де вказана друга молекула ДНК містить 5'-фланковану ділянку геномної ДНК кукурудзи послідовності SEQ ID NО:5, або комплементарну їй послідовність, аналогічної довжини. 18. Пара молекул ДНК за п.17, де вказана перша молекула ДНК містить послідовність, яка є гомологічною або комплементарною послідовності SEQ ID NО:7, і вказана друга молекула ДНК містить послідовність, гомологічну або комплементарну SEQ ID NО:5, аналогічної довжини. 19. Пара молекул ДНК за будь-яким з пп.15-18, де вказана перша молекула ДНК містить послідовність SEQ ID NО:10 і вказана друга молекула ДНК містить послідовність SEQ ID NО:9. 20. Пара молекул ДНК, яка містить: першу молекулу ДНК і другу молекулу ДНК, де молекули ДНК 87808 4 мають довжину послідовних нуклеотидів послідовності SEQ ID NО:4, або комплементарної їй послідовності, достатню для функціонування як ДНКпраймерів або зондів для діагностики ДНК, екстрагованої з рослини кукурудзи MON863 або її потомства. 21. Пара молекул ДНК за п.20, де вказана перша молекула ДНК містить 11 або більше послідовних нуклеотидів будь-якої частини трансгенної ділянки послідовності SEQ ID NО:4, або комплементарної їй послідовності, і вказана друга молекула ДНК містить 3'-фланковану ділянку геномної ДНК кукурудзи послідовності SEQ ID NО:4, або комплементарної їй послідовності, аналогічної довжини. 22. Пара молекул ДНК за п.21, де вказана перша молекула ДНК містить 11 або більше послідовних нуклеотидів 3'-трансгенної області послідовності ДНК SEQ ID NО:8, або комплементарної їй послідовності, і вказана друга молекула ДНК містить 3'фланковану ділянку геномної ДНК кукурудзи послідовності SEQ ID NО:6, або комплементарної їй послідовності, аналогічної довжини. 23. Пара молекул ДНК за п.22, де вказана перша молекула ДНК містить послідовність, яка є гомологічною або комплементарною послідовності SEQ ID NО:8, і вказана друга послідовність ДНК містить послідовність, гомологічну або комплементарну послідовності SEQ ID NО:6, аналогічної довжини. 24. Пара молекул ДНК за будь-яким з пп.20-23, де вказана перша молекула ДНК містить послідовність SEQ ID NО:11 і вказана друга молекула ДНК містить SEQ ID NО:12. 25. Спосіб детектування наявності молекули ДНК, вибраної з групи, яка складається з послідовностей SEQ ID NО:3 і SEQ ID NО:4, у біологічному зразку, який включає: (а) контактування вказаного біологічного зразка з парою ДНК-праймерів, які містять молекули ДНК з послідовними нуклеотидами послідовності SEQ ID NО:3, або комплементарної їй послідовності, SEQ ID NО:4, або комплементарної їй послідовності, довжиною, достатньою для функціонування як ДНК-праймерів або зондів для діагностики ДНК, екстрагованої з рослини кукурудзи MON863 або її потомства; b) забезпечення умов для реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти; c) здійснення вказаної реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з одержанням молекули амплікону ДНК; і (с) детектування вказаної молекули амплікону ДНК, де детектування амплікону, який містить щонайменше одну послідовність SEQ ID NО:1, SEQ ID NО:2 і комплементарні їм послідовності, є індикатором наявності вказаної молекули ДНК у вказаному біологічному зразку. 26. Спосіб за п.25, де вказаний біологічний зразок являє собою зразок ДНК, екстрагований з рослини кукурудзи. 27. Спосіб детектування наявності молекули ДНК, вибраної з групи, яка складається з послідовностей SEQ ID NО:3 і SEQ ID NО:4, у біологічному зразку, який включає: 5 87808 6 (а) контактування вказаного біологічного зразка із ДНК-зондом, що гібридизується в жорстких умовах із вказаною молекулою ДНК, і не гібридизується в жорстких умовах з біологічним зразком, який не містить вказану ДНК; (b) забезпечення жорстких умов гібридизації для вказаного біологічного зразка і зонда ДНК; c) детектування гібридизації вказаного ДНК-зонда із вказаним біологічним зразком, де детектування гібридизації є індикатором наявності вказаної молекули ДНК у вказаному біологічному зразку. 28. Спосіб за п.27, де вказаний біологічний зразок являє собою зразок ДНК, екстрагований з рослини кукурудзи. 29. Спосіб за п.27 або 28, де вказаний зонд ДНК містить SEQ ID NО:1 або SEQ ID NО:2 або комплементарні їм послідовності. 30. Спосіб за п.25 або 27, де вказаний біологічний зразок вибраний з групи, яка складається з кукурудзяного борошна, кормового кукурудзяного борошна, кукурудзяної патоки, кукурудзяної олії, кукурудзяного крохмалю і каші, виготовлених так, щоб вони повністю або частково містили субпродукти з кукурудзи. 31. Набір для детектування ДНК, що містить щонайменше одну молекулу ДНК із послідовних нуклеотидів, гомологічних або комплементарних послідовності SEQ ID NО:3 або SEQ ID NО:4, довжиною, достатньою для функціонування як ДНК-праймера або зонда, специфічного для трансформанта кукурудзи MON863 і/або його нащадків. 32. Набір для детектування ДНК за п.31, де вказана щонайменше одна молекула ДНК містить SEQ ID NО:1, SEQ ID NО:2 або комплементарні їм послідовності. 33. Набір для детектування ДНК за п.32, де вказана щонайменше одна молекула ДНК являє собою SEQ ID NО:1, SEQ ID NО:2 або комплементарні їм послідовності. 34. Набір для детектування ДНК за п.31, де вказаний набір містить пару молекул ДНК за будь-яким з пп.15-24. 35. Спосіб визначення зиготності ДНК рослини кукурудзи, у тому числі трансформанта кукурудзи MON863, у біологічному зразку, який включає: (а) контактування зразка з набором праймерів, які містять SEQ ID NО:9, SEQ ID NО:10 і SEQ ID NО:12, або набором праймерів, який містить SEQ ID NО:10, SEQ ID NО:11 і SEQ ID NО:12; так, що (1), якщо при реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти, яка містить ДНК трансформанта кукурудзи MON863, і (2) при реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти, що містить геномну ДНК кукурудзи, відмінну від трансформанта кукурудзи MON863, продукується другий амплікон, який є діагностичним для геномної ДНК кукурудзи, відмінної від ДНК MON863; (b) здійснення реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти; і (с) детектування отриманого таким чином амплікону, при цьому детектування наявності обох ампліконів вказує на те, що ДНК трансформанта кукурудзи MON863 у зразку є гетерозиготною, а детектування тільки одного амплікону вказує на те, що ДНК трансформанта кукурудзи MON863 у зразку є гомозиготною. Даний винахід відноситься до галузі молекулярної біології рослин. Більш конкретно, даний винахід відноситься до рослини кукурудзи (Zea mays), резистентної до твердокрилих, PV-ZMIR13 і позначеної MON863; а також до насіння і до потомства вказаної рослини кукурудзи MON863. Рослина кукурудзи MON863 і її потомство є, зокрема, резистентними до Diabrotica vergifera, Diabrotica undecimpunctata i Leptinotarsa decemlineata. Більш конкретно, даний винахід також відноситься до ДНК-конструкції, вбудованої в геном рослини-трансформанту (event) кукурудзи MON863 для надання йому резистентності до зараження комахами загону Твердокрилих (Coleopteran). Даний винахід також відноситься до аналізів на детекцію присутності ДНК рослини кукурудзи MON863 в зразку і її композицій. Кукурудза є цінною сільськогосподарською культурою і головним джерелом харчування в багатьох регіонах світу. Для поліпшення агрономічних показників і якості продуктів, що виробляються з рослин кукурудзи, застосовуються методи біотехнології. Відомо, що експресія чужорідних генів в рослинах залежить від їх положення на хромосомі, що визначається структурами хроматину (наприклад, гетерохроматину) або безпосередньою близькістю елементів регуляції транскрипції (наприклад, енхансерів) до сайту інтеграції (Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22:421-477, 1988). З цієї причини, часто виявляється необхідним скринувати велике число трансформантів для ідентифікації трансформанту, що характеризується оптимальною експресією потрібного вбудованого гена. Як відомо, наприклад, зі спостережень рослин та інших організмів, у різних трансформантів, рівні експресії вбудованого гена можуть широко варіюватись. Можуть також спостерігатись відмінності в типах просторової або часової експресії, наприклад, відмінності у відносній експресії трансгену в різних тканинах рослин, які можуть не відповідати очікуваному характеру експресії, що оцінюється виходячи з елементів регуляції транскрипції, присутніх у вбудованій генній конструкції. З цієї причини, звичайно продукуються сотні або тисячі різних трансформантів, і ці трансформанти скринують з метою пошуку одного трансформанту, який має бажані рівні і типи експресії трансгену, необхідні для промислового застосування. Трансформант, який має потрібні рівні або типи експресії трансгену, може бути використаний для інтрогресії трансгену в інший генетичний фон шляхом статевого ауткросингу з використанням стандарт 7 них методів селекції. Потомство таких кросів зберігає експресійні властивості трансгену, характерні для вихідного трансформанту. Ця стратегія використовується для гарантії надійної експресії гена у рослин різних сортів, добре адаптованих до умов зростання в певній місцевості. Для того, щоб визначити, чи містить потомство кросу, одержаного статевим схрещуванням, потрібний трансген, переважно детектувати конкретний продукт трансформації. Крім того, спосіб детекції конкретного трансформанту може виявитись корисним з точки зору додержання правил, що передбачаються Регуляторними органами, які дають дозвіл на надходження даного продукту на ринок і що вимагають, наприклад, наявності на упаковці харчового продукту інформації про те, що він зроблений з рекомбінантних сільськогосподарських рослин. Присутність трансгену може бути встановлена будь-яким добре відомим методом детекції нуклеїнових кислот, таким як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) або ДНК-гібридизація з використанням нуклеїновокислотних зондів. Ці методи детекції звичайно спрямовані на генетичні елементи, що часто використовуються, такі як промотори, термінатори, маркерні гени і т.п.А тому такі методи не можуть бути використані для ідентифікації різних трансформантів, а зокрема, тих трансформантів, які продукуються з використанням тих же самих ДНК-конструкцій, за винятком тих випадків, коли послідовність хромосомної ДНК, сум: хна з вбудованою ДНК ("фланкуючі ДНК"), є відомою. Трансформант-специфічний ПЛР-аналіз обговорюється, наприклад, в роботі Windels et al (Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent. 64/5b:459-462, 1999), де був ідентифікований резистентний до гліфосату трансформант сої 40-3-2 ПЛР-методом з використанням серії праймерів, що охоплюють стик між вставкою і фланкуючою ДНК, а зокрема, одного праймера, який включає послідовність, що починається від вставки, і другого праймера, який включає послідовність, що починається від фланкуючої ДНК. У переважному варіанті свого здійснення, даний винахід відноситься до композицій і до способів детекції присутності ділянки-вставки "трансген/ген" в новій рослині кукурудзи PV-ZMIR13, позначеній MON863. Даний винахід відноситься до ДНК-послідовностей, які містять щонайменше одну послідовність стику в MON863, вибрану з групи, що складається з послідовності SEQ ID NО:1 (стику "довільно встановлена 5'-кінцева вставка - геном") і послідовності SEQ ID NО:2 (стику "довільно встановлена 3'-кінцева вставка - геном") і їх комплементів, де вказана послідовність стику охоплює ділянку стику між гетерологічною ДНК, вбудованою в геном кукурудзи, і ДНК клітини кукурудзи, фланкуючої сайт інсерції, і є діагностичною ознакою для даного трансформанту. В іншому переважному варіанті здійснення винаходу описані, наприклад, ДНК-послідовності, які містять нову ділянку-вставку "трансген/ген", SEQ ID NО:3 (послідовність, що містить довільно встановлений 5'-кінець вбудованої ДНК) і SEQ ID NО:4 (послідовність, що містить довільно встановлений 3’-кінець вбудованої ДНК). 87808 8 У ще одному переважному варіанті здійснення винаходу також описані ДНК-послідовності, які містять щонайменше приблизно від 11 до 50 або більше нуклеотидів 5'-трансгенної частини ДНКпослідовності SEQ ID NО:7 і 5'-фланкуючу ДНКпослідовність кукурудзи SEQ ID NО:5 аналогічної довжини, або 3’-трансгенну частину ДНКпослідовності кукурудзи SEQ ID NО:8 аналогічної довжини і 3’-фланкуючу ДНК кукурудзи SEQ ID NО:6 аналогічної довжини, і які використовуються як ДНК-праймерів в методах ампліфікації ДНК. Амплікони, продуковані з використанням цих праймерів, є діагностичними показниками присутності трансформанту кукурудзи МОК 863. В одному зі своїх аспектів, даний винахід відноситься до амплікону, продукованого першим ДНКпраймером, гомологічним або комплементарним послідовності SEQ ID NО:7, і пов'язаним з другим ДНК-праймером, гомологічним або комплементарним послідовності SEQ ID NО:5, де обидва цих праймери присутні в реакційній суміші разом з ДНК трансформанту кукурудзи MON863 в зразку. В іншому своєму аспекті, даний винахід відноситься до амплікону, продукованого третім ДНКпраймером, гомологічним або комплементарним послідовності SEQ ID NО:8, і пов'язаним з четвертим ДНК-праймером, гомологічним або комплементарним послідовності SEQ ID NО:6, де обидва ці праймери присутні в реакційній суміші разом з ДНК трансформанту кукурудзи MON863 в зразку. В інших своїх аспектах, даний винахід відноситься до рослини кукурудзи MON863 і до її потомства, що походить від рослин, які містять вказані ДНКпослідовності, що використовуються в реакції ампліфікації ДНК для одержання одного або декількох діагностичних ампліконів. У ще одному переважному варіанті, даний винахід відноситься до способів детекції присутності ДНК, відповідної ДНК трансформанту кукурудзи MON863, в зразку. Вказані способи включають стадії: (а) контактування біологічного зразка, що, вірогідно, містить ДНК трансформанту MON863, з парою праймерів, які, при використання в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з вказаної ДНК, продукують амплікон, який є діагностичним показником присутності трансформанту кукурудзи MON863; (b) проведення реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з продукуванням амплікону; і (с) детекції вказаного амплікону. Конкретно проілюстровані тут амплікони відповідають першому амплікону, що має приблизно 508 пар нуклеотидів, і представленому в SEQ ID NО:3, і другому амплікону, що має приблизно 584 пар нуклеотидів, і представленому в SEQ ID NО:4, або більш довгим або більш коротким ампліконам, де вказаний перший амплікон містить щонайменше нуклеотидну послідовність, відповідну SEQ ID NО:1, і що тягнеться приблизно від нуклеотиду 1 до нуклеотиду 11, або приблизно від нуклеотиду 10 до нуклеотиду 20, а вказаний другий амплікон містить щонайменше нуклеотидну послідовність, відповідну SEQ ID NО:2, і що тягнеться приблизно від нуклеотиду 1 до нуклеотиду 11, або приблизно від нуклеотиду 10 до нуклеотиду 20. 9 В іншому своєму переважному варіанті, даний винахід відноситься до способів детекції присутності ДНК, відповідної трансформанту MON863, в зразку. Вказані способи включають стадії: (а) контактування біологічного зразка, що, вірогідно, містить ДНК трансформанту MON863, із зондом, який гібридизується в жорстких умовах гібридизації з вказаної ДНК, і не гібридизується в жорстких умовах гібридизації з ДНК контрольної рослини кукурудзи, що не містить вбудовану ДНК, яка походить від pMON25097; (b) створення жорстких умов гібридизації для вказаного зразка і зонда; і (с) детекції гібридизації вказаного зонда з геномного ДНК, де детекція зв'язування зонда з вказаною ДНК є діагностичним показником присутності ДНК трансформанту MON863 у вказаному зразку. В іншому своєму переважному варіанті, даний винахід відноситься до нової рослини кукурудзи MON863, яка включає ДНК-послідовності, що містять нові ділянки вставки трансген/ген, і представлені в SEQ ID NО:3 і SEQ ID NО:4. В інших своїх варіантах, даний винахід відноситься до насіння рослин MON863, до потомства рослин MON863 і до способів продукування рослини кукурудзи шляхом схрещування рослини кукурудзи MON863 з цією ж рослиною або з іншою рослиною кукурудзи. Вищезгадані та інші переважні варіанти даного винаходу будуть більш зрозумілими з нижченаведеного докладного опису. Опис графічного матеріалу На Фіг.1 проілюстрований експресуючий вектор PV-ZMIR13, також позначений pMON25097, за допомогою якого був генерований трансформант рослини кукурудзи MON863, резистентний до кукурудзяного листоїду, методом бомбардування прискореними частинками з використанням рестрикційного Mlul-фрагмента, розташованого приблизно від положення нуклеотиду 149 до положення нуклеотиду 4840. На Фіг.2 представлена графічна схема, що ілюструє загальну організацію елементів, які містять гетерологічні послідовності нуклеїнової кислоти, вбудовані в геном трансформанту кукурудзи MON863, і вказані основні положення, в яких вбудовані послідовності нуклеїнової кислоти приєднані до геномних ДНК-псслідовностей кукурудзи, що називаються тут як геномні послідовності нуклеїнової кислоти кукурудзи, фланкуючі кінці вбудованих гетерологічних ДНК-послідовностей; нижче охарактеризований трансформант кукурудзи MON863, який містить наступні послідовності: геномну ДНК кукурудзи, [1], фланкуючу довільно встановлений 5'-кінець повнорозмірної первинної функціональної вбудованої ДНК-послідовності і що є суміжною з неприродною промоторною послідовністю CaMV35S AS4, [2], (P-CaMV.AS4 SEQ ID NО:17), функціонально приєднаної до нетрансльованої лідерної послідовності зв'язувального білка А/В хлорофілу пшениці, [3], (L-Ta.hcbl, SEQ ID NО:18), яка функціонально приєднана до інтронної послідовності актину рису, [4], (I-Os.Actl, SEQ ID NО:19), яка, в свою чергу, функціонально приєднана до неприродної послідовності, що кодує варіант білка Сrу3Вb, [5], (SEQ ID NО:20) і функціонально приєднаної до послідовності термінації 87808 10 транскрипції і послідовності поліаденілування білка теплового шоку Hsp17 пшениці, [6], (T-Ta.Hsp17, SEQ ID NО:21), і повнорозмірну первинну функціональну вбудовану ДНК-послідовність, фланковану геномною ДНК кукурудзи у довільно встановленого 3'-кінця, [7], де стик між [1] і [2] ([8]) відповідає SEQ ID NО:1, а стик між [6] і [7] ([9]) відповідає SEQ ID NО:2. Опис послідовностей SEQ ID NО:1 відповідає послідовності стику між геномною і вбудованою ДНК кукурудзи, яка є діагностичною ознакою для довільно встановленого 5'-кінця повнорозмірної первинної функціональної вбудованої ДНК-послідовності в трансформанті кукурудзи MON863. SEQ ID NО:2 відповідає послідовності стику між геномною і вбудованою ДНК кукурудзи, яка є діагностичною ознакою для довільно встановленого 3’-кінця повнорозмірної первинної функціональної вбудованої ДНК-послідовності в трансформанті кукурудзи MON863. SEQ ID NО:3 відповідає послідовності, представленій, в основному, послідовностями [1] і [2] на Фіг.2. SEQ ID NО:4 відповідає послідовності, представленій в основному, послідовностями [6] і [7] на Фіг.2. SEQ ID NО:5 відповідає неповної геномній ДНК-послідовності кукурудзи, яка є суміжною з довільно встановленим 5'-кінцем неповної Сrу3Вbкодуючої ДНК-послідовності, вбудованої в трансфoрмант кукурудзи MON863, і фланкує вказаний 5'-кінець. SEQ ID NО:6 відповідає неповній геномній ДНК-послідовності кукурудзи, яка є суміжною з довільно встановленим 3’-кінцем неповної Сrу3Вbкодуючої ДНК-послідовності, вбудованої в трансформант кукурудзи MON863, і фланкує вказаний 3’-кінець. SEQ ID NО:7 відповідає послідовності довільно встановленого 5'-кінця неповної Сrу3Вbкодуючої ДНК-послідовності, вбудованій в трансформант кукурудзи MON863. SEQ ID NО:8 відповідає послідовності довільно встановленого 3’-кінця неповної Сrу3Вbкодуючої ДНК-послідовності, вбудованій в трансформант кукурудзи MON863. SEQ ID NО:9 відповідає 5'-праймерній послідовності (праймер А), комплементарної частини геномної ДНК-послідовності кукурудзи, ідентифікованої як послідовність, фланкуюча довільно встановлений 5'-кінець повнорозмірної первинної функціональної ДНК-послідовності, вбудованої в трансформант кукурудзи MON863, і, при спаровуванні з праймером, відповідним оберненому комплементу послідовності, представленої в SEQ ID NО:10 і з матричної ДНК трансформанту кукурудзи MON863, продукує амплікон, що містить SEQ ID NО:3, який є діагностичним показником присутності ДНК трансформанту кукурудзи MON863 в зразку. SEQ ID NО:10 відповідає оберненому комплементу 3’-праймерної послідовності (праймер В), комплементарної частини довільно встановленої 5'-кінцевої повнорозмірної первинної функціональ 11 ної ДНК, вбудованої в геном кукурудзи в трансформанті кукурудзи MON863, і, при спаровуванні з праймером, відповідним послідовності, представленій в SEQ ID NO:9 і матричній ДНК трансформанту кукурудзи MON863, продукує амплікон, що містить SEQ ID NО:3, який є діагностичним показником присутності ДНК трансформанту кукурудзи MON863 в зразку. SEQ ID NО:11 відповідає 5'-праймерній послідовності (праймер С), комплементарної частини довільно встановленої 3’-кінцевої послідовності повнорозмірної первинної функціональної ДНК, вбудованої в геном кукурудзи в трансформант: MON863, і, при спаровуванні з праймером, · відповідним оберненому комплементу послідовності, представленої в SEQ ID NО:12, і з матричної ДНК трансформанту кукурудзи MON863, продукує амплікон, що містить SEQ ID NО:4, який є діагностичним показником присутності ДНК трансформанту кукурудзи MON863 в зразку. SEQ ID NО:12 відповідає оберненому комплементу 3’-праймерної послідовності (праймер D), комплементарної частини геномної ДНКпослідовності кукурудзи, ідентифікованої як послідовність, фланкуюча довільно встановлений 3'кінець повнорозмірної первинної функціональної ДНК, вбудованої в трансформант кукурудзи MON863, і, при спаровуванні з праймером, відповідним послідовності, представленій в SEQ ID NО:11, і з матричної ДНК трансформанту кукурудзи MON863, продукує амплікон, що містить SEQ ID NО:4, який є діагностичним показником присутності ДНК трансформанту кукурудзи MON863 в зразку. SEQ ID NО:13 відповідає 5'-праймеру 1 для "прогулянки по геному". SEQ ID NО:14 відповідає 5'-праймеру 2 для "прогулянки по геному". SEQ ID NО:15 відповідає 3’-праймеру 1 для "прогулянки по геному". SEQ ID NО:16 відповідає 3’-праймеру 2 для "прогулянки по геному". SEQ ID NО:17 відповідає промоторній послідовності CaMV35S AS4. SEQ ID NО:18 відповідає нетрансльованій лідерній послідовності зв'язувального білка А/В хлорофілу пшениці (L-Ta.hcb1). SEQ ID NО:19 відповідає інтронній послідовності актину рису (I-Os.Act1). SEQ ID NО:20 відповідає неприродній послідовності, що кодує варіант білка СrуСВb. SEQ ID NО:21 відповідає послідовності термінації транскрипції і послідовностям поліаденілування білка теплового шоку Hsp17 пшениці (ТTa.Hsp17). Нижче наводяться визначення термінів і опис методів для кращої характеризації дано винаходу і для полегшення його практичного здійснення. Терміни, які не визначені конкретно в нижченаведеному описі, потрібно розуміти в їх звичайно прийнятому значенні. Визначення загальних термінів в молекулярній біології можна також знайти в роботах Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1991, і у Lewin, Genes V, Oxford University Press: 87808 12 New York, 1994. Номенклатура для основ ДНК використовується згідно зі ст.37 Звід федеральних правил (CFR) §1.822. При використанні в даному описі терміну "біологічний зразок" або "зразок" передбачається, що він включає нуклеїнові кислоти, полінуклеотиди, ДНК, РНК, тΡΗΚ, кДНК і т.п.в композиції з субстратом або фіксовані на субстраті, який дозволяє проводити аналіз зразка з використанням молекулярного зонда або термоампліфікацію з використанням олігонуклеотидних зондів і/або праймерів. Термін, що використовується тут, "кукурудза" означає Zea mays або маїс і охоплює всі сорти рослин, які можуть бути схрещені з кукурудзою, включаючи дикі види маїсу. Термін, що використовується тут, "що містить" означає "той, що включає, але не обмежується". Термін, що використовується тут, "діагностичний" відноситься до показника, що використовується з метою ідентифікації послідовностей нуклеїнової кислоти, що міститься в трансформанті кукурудзи MON863 або що походить від цього трансформанту; причому, будь-яка одна або декілька нових описаних тут ДНК-послідовностей повинні містити геномні фланкуючі послідовності кукурудзи, суміжні і пов'язані з довільно встановленими кінцями вбудованих гетерологічних ДНКпослідовностей, що є необхідним і достатнім для опису відмітних ознак геному трансформанту кукурудзи MON863, за умови, що дана послідовність містить щонайменше частину одного з кінців вбудованої гетерологічної ДНК-послідовності або кукурудзяної геномної послідовності, фланкуючої один з цих кінців або суміжної з цим кінцем, і включає щонайменше два нуклеотиди, тобто динуклеотид, що містить сайт, в якому кукурудзяна геномна послідовність і вбудована гетерологічна ДНК-послідовність приєднані одна до одної фосфодіефірним зв'язком. Фахівцям добре відомо, що якщо послідовність, яка є діагностичною ознакою для конкретного трансформанту, такого як трансформант кукурудзи, що описується тут, MON863, не присутня в конкретному зразку, що містить геномні нуклеїнові кислоти кукурудзи, то це є показником того, що даний зразок не містить діагностичної послідовності, а означає, у вказаному зразку дані нуклеїнові кислоти відсутні, або ці нуклеїнові кислоти не походять від геному трансформанту кукурудзи MON863 і не містяться в геномі цього трансформанту. Крім того, в трансформанті кукурудзи MON863 присутні описані тут додаткові нові і діагностичні послідовності, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NО:1, SEQ ID NО:2, SEQ ID NО:3 і SEQ ID NО:4 і їх комплементів. "Трансгенний трансформант" ("event") продукується шляхом трансформації клітин рослини гетерологічної ДНК, тобто нуклеїновокислотною конструкцією, яка включає потрібний трансген, з подальшою регенерацією популяції рослин в результаті вбудовування трансгену в геном рослини і відбору конкретної рослини, що характеризується наявністю вставки в конкретному положенні геному. Термін "трансформант" ("event") означає вихідний трансформант і потомство цього трансформанту, яке включає гетерологічну ДНК. Термін 13 "трансформант" ("event") також означає потомство, продуковане шляхом статевого ауткросингу між даним трансформантом та іншим сортом, який включає гетерологічну ДНК. Навіть після повторного зворотного схрещування (беккросингу) з рекурентним батьком, вбудована ДНК і фланкуюча ДНК від трансформованого батька присутня в потомстві цього кросу в тому ж самому положенні хромосоми. Термін "трансформант" ("event") також означає ДНК від вихідного трансформанту, що містить вбудовану ДНК і фланкуючу геномну послідовність, безпосередньо суміжну з вбудованою ДНК, яка, як очікується, повинна передаватись потомству, яке успадковує вбудовану ДНК, що включає потрібний трансген, переданий в результаті статевого схрещування батьківської лінії, що містить вбудовану ДНК (наприклад, вихідний трансформант і потомство, одержане в результаті самозапилення), з батьківською лінією, яка не містить вбудованої ДНК. Потрібно також зазначити, що можуть бути також схрещені дві різні трансгенні рослини з продукуванням потомства, яке містить два або більше екзогенних гени, що незалежно сегрегуються, (термін "екзогенні гени" означає нуклеотидні послідовності, які не зустрічаються в природному геномі даної рослини, тобто є гетерогенними для даної рослини кукурудзи). В результаті самозапилення відповідного потомства можуть продукуватись рослини, які є гомозиготними за будь-якою комбінацією цих екзогенних генів. В даному винаході також розглядається беккросинг з батьківською рослиною і ауткросинг з нетрснсгенною рослиною, а також вегетативне розмноження. Опис інших методів схрещування, які звичайно використовуються для одержання різних фенотипів і культур, можна знайти в одній з декількох робіт, наприклад, Fehr, Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox, J. ed. American Society of Agronomy, Madison WI (1987). "Зонд" являє собою виділену нуклеїнову кислоту, до якої може бути приєднана або з якою може бути пов'язана стандартна детектована мітка або репортерна молекула, наприклад, радіоактивний ізотоп, ліганд, хемілюмінесцентний агент або фермент. Такий зонд є комплементарним послідовності, присутній в нуклеїновій кислоті-мішені, а у випадку даного винаходу, послідовності геномної ДНК, що походить від трансформанту кукурудзи MON863, або від рослини кукурудзи, або із зразка, який включає ДНК даного трансформанту. Зонди даного винаходу включають не тільки дезоксирибонуклеїнові або рибонуклеїнові кислоти, але також і поліаміди та інші матеріали-зонди, які специфічно зв'язуються з ДНК-послідовністю-мішенню і можуть бути використані для детекції на присутність такої ДНК-послідовності-мішені. "Праймери" являють собою виділені нуклеїновокислотні зонди, які, у випадку будь-якого одного з даних праймерів, випалюються з комплементарною ДНК-послідовністю-мішенню, за допомогою гібридизації нуклеїнових кислот з утворенням гібриду між праймером і ДНК-послідовністюмішенню, з подальшим подовженням вздовж ланцюга ДНК-мішені під дією полімерази, наприклад, 87808 14 ДНК-полімерази. Термін "пари праймерів" даного винаходу означає дві або більше різні праймерні послідовності, що використовуються для ампліфікації послідовності нуклеїнової кислоти, яка присутня між послідовностями-мішенями і пов'язана з цими послідовностями-мішенями, названими оберненим комплементом або, по суті, оберненим комплементом праймерів, і де вказана ампліфікація здійснюється, наприклад, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або іншими стандартними методами ампліфікації нуклеїнових кислот. Зонди і праймери звичайно мають довжину, приблизно, від 11 нуклеотидів або більше, переважно, приблизно, від 18 нуклеотидів або більше, більш переважно, приблизно, від 24 нуклеотидів або більше, а найбільш переважно, приблизно, від 30 нуклеотидів або більше. Такі зонди і праймери специфічно гібридизуються з послідовністюмішенню в умовах гібридизації високої жорсткості. Зонди і праймери даного винаходу, переважно, мають повну послідовність, аналогічну послідовності-мішені, хоча згідно зі стандартними методами можуть бути сконструйовані зонди, відмінні від послідовності-мішені і що зберігають здатність гібридизуватись з послідовностями-мішенями. Методи одержання і використання зондів і праймерів описані, наприклад, в керівництві Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol.1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (далі названому "Sambrook et al., 1989"); Current Protocols in Molecular Biology ed. Ausubel et al., Greene Publisching Associates and Wiley Interscience, New York, 1992 (з періодичними виправленнями) (далі званому "Ausubel et al., 1992"); і Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Пари ПЛР-праймерів можуть бути одержані з відомої послідовності, наприклад, з використанням комп'ютерних програм, таких як програма "Primer", призначена для цих цілей (Version 0,5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA). Праймери і зонди, сконструйовані на основі фланкуючої ДНК, послідовностей-вставок і послідовностей стиків, описаних в даній заявці, можуть бути використані для підтвердження присутності послідовностей, що розглядаються в зразку стандартними методами, наприклад, шляхом повторного клонування і секвенування таких послідовностей. Будь-який окремо взятий нуклеїновокислотний зонд або праймер даного винаходу гібридизується зі специфічною ДНК-послідовністю-мішенню в жорстких умовах. Для ідентифікації присутності ДНК, що походить від трансген-вмісного трансформанту в зразку, можуть бути використані будь-які методи гібридизації або ампліфікації. Молекули нуклеїнової кислоти або її фрагменти специфічно гібридизуються з іншими молекулами нуклеїнової кислоти в певних умовах. Відповідно до даного винаходу, вважається, що дві різні молекули нуклеїнової кислоти, що використовуються тут, кожна з яких містить різні послідовності, специфічно гібридизують 15 ся одна з одною, якщо вказані дві молекули утворюють антипаралельну дволанцюгову структуру нуклеїнової кислоти. Молекула нуклеїнової кислота вважається "комплементарною" іншій молекулі нуклеїнової кислоти, якщо ці молекули мають повну комплементарність. Вважається, що молекули, які використовуються тут, мають "повну комплементарність", якщо кожний нуклеотид однієї молекули комплементарний нуклеотиду іншої молекули. Відповідно до даного винаходу вважається, що дві молекули мають "мінімальну комплементарність", якщо вони можуть гібридизуватись одна з одною із стабільністю, достатньою для їх гібридизації одна з одною щонайменше в стандартних умовах "низької жорсткості". Аналогічним чином, вважається, що дані молекули є комплементарними, якщо вони можуть гібридизуватись одна з одною із стабільністю, достатньою для їх гібридизації одна з одною щонайменше в стандартних умовах "високої жорсткості". Стандартні умови жорсткості описані у Sambrook et al., 1989, і у Haymes et al. (Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC, 1985). Тому відхилення від повної комплементарності допускається за умови, що такі відхилення абсолютно не перешкоджають здатності даних молекул утворювати дволанцюгові структури. Для того, щоб молекула нуклеїнової кислоти служила як праймер або зонд, необхідно лише, щоб вона була досить комплементарною послідовності, здатній утворювати стабільну дволанцюгову структуру в конкретному розчиннику і в конкретних концентраціях солі. Термін "специфічний для (послідовностімішені)" вказує на те, що зонд або праймер гібридизується в жорстких умовах гібридизації тільки з послідовністю-мішенню в зразку, що містить таку послідовність-мішень, і що така гібридизація є детектованою. Термін, що використовується тут, "виділена нуклеїнова кислота" означає нуклеїнову кислоту, яка є, в основному, відділеною або очищеною від інших послідовностей нуклеїнової кислоти в клітині даного організму, в якій звичайно присутня дана нуклеїнова кислота, тобто від інших хромосомних і позахромосомних ДНК і РНК, стандартними методами очищення нуклеїнових кислот. Цей термін також включає рекомбінантні нуклеїнові кислоти і хімічно синтезовані нуклеїнові кислоти. Термін, що використовується тут, "по суті, гомологічна послідовність" означає послідовність нуклеїнової кислоти, яка специфічно гібридизується з комплементом послідовності нуклеїнової кислоти, з якою вона порівнюється, тобто з послідовністю-мішенню, в умовах високої жорсткості. Відповідні умови жорсткості, які забезпечують гібридизацію ДНК, такі як, наприклад, використання 6,0´ хлориду натрію/цитрат натрію (SSC) приблизно при 45°С, і промивання 2,0´SSC при 50°С, є відомими, або їх опис можна знайти в керівництві Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6., 1989. Так, наприклад, концентрація солі в стадії промивання може бути вибрана з концентрації, що використовується в умовах низької жорсткості, і складає приблизно 2,0´SSC при 50°С, і концентрації, що використову 87808 16 ється в умовах високої жорсткості, і складає приблизно 0,2´SSC при 50°С. Крім того, температура в стадії промивання може бути збільшена від кімнатної температури, що використовується в умовах низької жорсткості і складає приблизно 22°С, до температури, що використовується в умовах високої жорсткості і складає приблизно 65°С. Температура реакції і концентрація солі можуть одночасно варіюватись, або температура може залишатись постійною, а концентрація солі варіюватись, або навпаки. У переважному варіанті, нуклеїнова кислота даного винаходу може специфічно гібридизуватись з однією або декількома молекулами нуклеїнової кислоти, представленими або в SEQ ID NО:1, або в SEQ ID NО:2, або з їх комплементами або фрагментами в умовах помірної жорсткості, наприклад, приблизно у присутності 2,0´SSC і при температурі приблизно 65°С. В особливо переважному варіанті, нуклеїнова кислота даного винаходу може специфічно гібридизуватись з однією або декількома молекулами нуклеїнової кислоти, представленими або в SEQ ID NО:1, або в SEQ ID NО:2, або з їх комплементами або фрагментами в умовах високої жорсткості. Нуклеїнова кислота даного винаходу, яка гібридизується з послідовністю нуклеїнової кислоти, що містить SEQ ID NО:1, або з послідовністю нуклеїнової кислоти, що містить SEQ ID NO:3, необов'язково повинна гібридизуватись з послідовністю нуклеїнової кислоти, що містить SEQ ID NО:2 або послідовністю нуклеїнової кислоти, що містить SEQ ID NО:4, і навпаки. В одному з аспектів даного винаходу, переважна маркерна молекула нуклеїнової кислоти даного винаходу має послідовність, представлену в SEQ ID NО:1 або SEQ ID NО:2, або її комплемента або фрагменти. В іншому аспекті даного винаходу, переважна маркерна молекула нуклеїнової кислоти даного винаходу на 80% - 100% або на 90% 100% ідентична послідовності нуклеїнової кислоти, представленій в SEQ ID NО:1 і SEQ ID NО:2, її комплементу або фрагментам. В іншому аспекті даного винаходу, переважна маркерна молекула нуклеїнової кислоти даного винаходу на 80%-100% ідентична послідовності нуклеїнової кислоти, представленій в SEQ ID NО:1 і SEQ ID NО:2, її комплементу або фрагментам. SEQ ID NО:1 і SEQ ID NО:2 можуть бути використані як маркери для ідентифікації потомства генетичних кросів в методах схрещування рослин, аналогічних методам, описаним для простого аналізу на наявність ДНКмаркерів послідовностей, що повторюються, як описано в "DNA markers: Protocols, Applications, and Overviews, 173-185, Cregan et al., eds., WileyLiss NY, 1997. Гібридизація зонда з молекулою ДНК-мішені може бути детектована різними методами, відомими фахівцям, і такими методами є, але не обмежуються ними, методи з використанням флуоресцентних міток, радіоактивних міток, міток на основі антитіл і хемілюмінесцентних міток. Що стосується ампліфікацій послідовності нуклеїнової кислоти-мішені (наприклад, за допомогою ПЛР), що проводяться з використанням конкретної пари праймерів для ампліфікації, то "жорсткими умовами" є такі умови, які дозволяють 17 окремим праймерам в даній парі праймерів гібридизуватись тільки з окремою і унікальною послідовністю нуклеїнової кислоти-мішені, з якою повинен зв'язуватись кожний праймер, що містить відповідну послідовність дикого типу (або її комплемент), а переважно, продукувати унікальний продукт ампліфікації, амплікон, в реакції термоампліфікації ДНК. Термін, що використовується тут, "трансформація" означає перенесення фрагмента нуклеїнової кислоти в геном організму-хазяїна, такого як рослина-хазяїн, в результаті генетично стабільного успадкування. Рослини-хазяїни, що містять трансформовані фрагменти нуклеїнової кислоти, називаються "трансгенними рослинами". Термін, що використовується тут, "ампліфікована ДНК" або "амплікон" означає продукт ампліфікації послідовності нуклеїнової кислоти-мішені, яка є частиною матричної нуклеїнової кислоти. Так, наприклад, для того, щоб визначити, містить або не містить дана рослина кукурудзи, одержана в результаті статевого схрещування, геномну ДНК трансгенної рослини, що походить від рослини кукурудзи MON863 даного винаходу, ДНК, екстрагована зі зразка тканини рослини кукурудзи, може бути піддана нуклеїновокислотній ампліфікації з використанням пари праймерів, яка включає один праймер, що походить від фланкуючої послідовності в геномі рослини, суміжної з сайтом інсерції вбудованої гетерологічної ДНК, і другий праймер, що походить від вбудованої гетерологічної ДНК, в результаті чого буде продукуватись амплікон, який є діагностичною ознакоюприсутності трансгенної ДНК. Амплікон має довжину і послідовність, які також є діагаостичними показниками присутності трансгенної ДНК. Довжина цього амплікону може складати в межах від загальної довжини пар праймерів плюс одна пара нуклеотидів, переважно, плюс приблизно п'ятдесят пар нуклеотидів, більш переважно, плюс приблизно двісті п'ятдесят пар нуклеотидів, і навіть більш переважно, плюс приблизно ч риста п'ятдесят пар нуклеотидів. Альтернативно, пара праймерів може похо і від фланкуючої послідовності з обох сторін від вбудованої ДНК, так, щоб міг продукуватись амплікон, який включає всю вставку нуклеотидної послідовності. Член пари праймерів, що походить від геномної послідовності рослини, може бути локалізований на певній відстані від вбудованої ДНКпослідовності, причому ця відстань може варіюватись в межах, приблизно, від однієї пари нуклеотидів до двадцяти тисяч пар нуклеотидів. Зокрема, термін, що використовується тут, "амплікон" виключає димери праймерів, які можуть утворюватись в реакції термоампліфікації ДНК. Ампліфікація нуклеїнових кислот може бути здійснена різними відомими методами ампліфікації нуклеїнових кислот, включаючи полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР). Такі методи ампліфікації відомі фахівцям і описані, inter alia, в патентах США №№4683195 і 4683202 і в керівництві PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press: San Diego, 1990. Методи ПЛР-ампліфікації були розроблені для ампліфікації до 22 т.п.н. геномної ДНК і до 42 т.п.н. ДНК бак 87808 18 теріофагу (Cheng et al., Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 91:5695-5699, 1994). Ці методи, а також інші методи, відомі фахівцям в галузі ампліфікації ДНК, можуть бути використані для здійснення даного винаходу. Послідовність гетерологічної ДНК-вставки або фланкуючої послідовності, що походить від трансформанту кукурудзи MON863, може бути підтверджена (і за необхідності скоригована) шляхом ампліфікації таких послідовностей вказаного трансформанту, з використанням прайм§рів, що походять від описаних тут послідовностей, і подальшого проведення стандартного ДНКсеквенування ПЛР-амплікону або клонованої ДНК. Амплікон, продукований цими методами, може бути детектований багатьма способами. Одним з таких способів є аналіз генетичного коду (Nikiforov et al., Nucleic Acid Res., 22:4167-4175, 1994), де конструюють ДНК-олігонуклеотид, що перекривається як із суміжною фланкуючою геномною ДНКпослідовністю, так і з вбудованою ДНКпослідовністю. Вказаний олігонуклеотид іммобілізують на ямках мікроямкового планшета. Після проведення ПЛР потрібної ділянки (з використанням одного праймера у вбудованій послідовності і одного праймера в суміжній фланкуючій геномній послідовності), одноланцюговий ПЛР-продукт може бути гібридизований з іммобілізованим олігонуклеотидом і може служити як матриця для реакції подовження на одну основу з використанням ДНКполімерази і міченими ddNTP, специфічними до наступної передбачуваної основи. Зчитування даних може бути здійснене за допомогою флуоресцентного аналізу або ELISA-аналізу. При успішній ампліфікації, гібридизації і подовженні на одну основу, сигнал вказує на присутність вставки/фланкуючої послідовності. Іншим методом є метод піросеквенування, описаний Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). У цьому методі конструюють олігонуклеотид, що перекривається зі стиком суміжної геномної ДНК і ДНК-вставки. Цей олігонуклеотид гібридизують з одноланцюговим ПЛР-продуктом, що походить від потрібної ділянки (з одним праймером у вбудованій послідовності і одним праймером у фланкуючій геномній послідовності), та інкубують у присутності ДНК-полімерази, АТФ, сульфурилази, люциферази, апірази, аденозин-5'фосфосульфату і люциферину. Потім окремо додають DNTP, і його включення продукує світловий сигнал, який вимірюють. При успішній ампліфікації, гібридизації і подовженні на одну або множину основ, цей світловий сигнал вказує на присутність трансгенної вставки/фланкуючої послідовності. Флуоресцентна поляризація, описана Chen et al. (Genome Res. 9:492-498, 1999), являє собою метод, який може бути використаний для детекції амплікону даного винаходу. З використанням цього методу був сконструйований олігонуклеотид, який перекривається зі стиком геномної фланкуючої послідовності і вбудованої ДНК. Цей олігонуклеотид гібридизують з одноланцюговим ПЛРпродуктом, що походить від потрібної ділянки (з одним праймером у вбудованій ДНК і одним праймером у фланкуючій геномній ДНК-послідовності), та інкубують у присутності ДНК-полімерази і флуо 19 ресцентно міченого ddNTP. Подовження на одну основу приводить до включення ddNTP. Таке включення може бути виміряне за зміною поляризації з використанням флуориметру. При успішної ампліфікації, гібридизації і подовженні на одну основу, зміна поляризації вказує на присутність трансгенної вставки/фланкуючої послідовності. Метод Такмана (Taqmano) (ΡΕ Applied Biosystems, Foster City, CA) описаний як метод детекції і кількісного визначення присутності ДНКпослідовності і його повне пояснення наводиться в інструкціях виробника. Коротко, був сконструйований олігонуклеотидний зонд FRET, який перекривається зі стиком геномної фланкуючої послідовності і ДНК-вставки. Зонд FRET і ПЛР-праймери (один праймер у вбудованій ДНК і один праймер у фланкуючій геномній ДНК-послідовності), піддають циклам гібридизації у присутності термостабільної полімерази і dNTP. Гібридизація зонда FRET приводить до відщеплення і вивільнення флуоресцентної частини від нефлуоресціюючої частини на зонді FRET. При успішній ампліфікації, гібридизації і подовженні на одну основу, флуоресцентний сигнал вказує на присутність фланкуючої послідовності/трансгенної вставки. Молекулярні сигнальні індикатори, що використовуються для детекції послідовностей, описані в роботі Tyangi et al. (Nature Biotech. 14: 303-308, 1996). Коротко, був сконструйований олігонуклеотидний зонд FRET, який перекривається зі стиком геномної фланкуючої послідовності і ДНК-вставки. Зонд FRET і ПЛР-праймери (один праймер у вбудованій ДНК і один праймер у фланкуючій геномній ДНК-послідовності), піддають циклам гібридизації у присутності термостабільної полімерази і dNTP. Після успішної ПЛР-ампліфікації, гібридизація зонда FRET з послідовністю-мішенню приводить до видалення вторинної структури зонда і просторового відділення флуоресцентної частини від нефлуоресціюючої частини. В результаті цього продукується флуоресцентний сигнал. При успішній ампліфікації і гібридизації, цей флуоресцентний сигнал вказує на наявність фланкуючої послідовності/трансгенкої вставки. Всі вищезгадані способи можуть бути модифіковані з метою визначення типу зиготності конкретного зразка нуклеїнових кислот, що походять від одного джерела. Так, наприклад, трансформант рослини кукурудзи MON863, який є гомозиготним за трансгенним алелем 863, містить в своєму геномі дві копії даного трансгенного алелю 863, що є характерною і діагностичною ознакою геному цього трансформанту кукурудзи MON863, а тому при самозапиленні повинна продукуватись чистосортна рослина. Альтернативно, гомозиготна рослина трансгенної кукурудзи MON863 може бути схрещена з іншим сортом кукурудзи, і в результаті такого схрещування повинні продукуватись рослини, які є гетерозиготними за трансгенним алелем MON863. Розглядаються методи, за допомогою яких кожний фахівець може визначити тип зиготності конкретної рослини за трансгенним алелем MON863. Так, наприклад, використання трьох різних праймерів в реакції ампліфікації ДНК трансформа 87808 20 нту кукурудзи MON863 як матриці, і в окремій і паралельній реакції ампліфікації ДНК кукурудзи негативного контролю, яка не є MON863, тобто не містить вбудовану ДНК, присутню в ДНК MON863, повинно приводити до двох різних результатів, в залежності від типу зиготності ДНК кукурудзи, що містить ДНК трансгенної кукурудзи. Відповідні праймери можуть бути вибрані з групи, що складається з SEQ ID NО:9, SEQ ID NО:10 і SEQ ID NО:12. Ампліфікація ДНК H6-MON863 з використанням цієї групи праймерів буде, у випадку пари праймерів SEQ ID NО:10 і SEQ ID NО:12, приводити до продукування першого амплікону, відповідного безперервній геномній послідовності кукурудзи, в яку була вбудована послідовність PVZMR13, тобто ампліфікованій послідовності, в основному, відповідній комбінації пов'язаних SEQ ID NО:5 і SEQ ID NО:6. При цьому, передбачається, що вказаний перший амплікон повинен знаходитись в рослині, яка є гетерозиготною за трансгенним алелем кукурудзи MON863, однак, гетерозигота також повинна продукувати другий амплікон, відповідний послідовності SEQ ID NО:3 і утворений в результаті подовження пари праймерів, відповідних SEQ ID NO: 9 і SEQ ID NО:10. Рослина кукурудзи, що містить ДНК, яка є гомозиготною за алелем MON863, повинна продукувати лише другий амплікон. Аналогічним чином, третій амплікон повинен продукуватись в результаті реакції термоампліфікації, в якій використовуються праймери SEQ ID NО:10, SEQ ID NО:11 і SEQ ID NО:12 з матричної ДНК, що походить від рослини кукурудзи MON863, де вказаний третій амплікон відповідає SEQ ID NО:4. Цей третій амплікон повинен являти собою амплікон, продукований лише з використанням даної конкретної комбінації праймерів і матричної ДНК, якщо вказана рослина є гомозиготною за апелем MON863, однак, використання гетерозиготної матричної ДНК повинно приводити до ампліфікації першого і третього ампліконів, а використання матричної ДНК He-MON863 повинна приводити до ампліфікації ' тільки першого амплікону. За допомогою молекулярної характеризації, авторами даного винаходу було визначено, що трансформант кукурудзи MON863 містить первинну функціональну вставку, що включає значну частину трансформуючої плазміди, PV-ZMIR13. Цей сегмент є детектованим і діагностичним показником присутності послідовностей нуклеїнової кислоти трансформанту MON863 у зразку, а зокрема, у рослинах, які були піддані самозапиленню після продукування трансформанту MON863. Існує багато методів трансформації молекул нуклеїнової кислоти Сrу3Вb в клітини рослини, таких як клітини рослини кукурудзи, для продукування потрібного трансформанту, такого як MON863. Очевидно, що відповідними методами є, фактично, будь-які методи, за допомогою яких молекули нуклеїнової кислоти можуть бути введені в дані клітини, наприклад, за допомогою інфікування Agrobacterium або за допомогою прямої доставки молекул нуклеїнової кислоти, яка може бути здійснена шляхом ПЕГ-опосередкованої 21 трансформації, електропорації і бомбардування прискореними частинками, покритими ДНК, і т.п.(Pottykus, Ann. Rev. Plant. Physiol. Plant. Моl. Biol. 42: 205-225, 1991; Vasil, Plant Мої. Biol. 25:925-937, 1994). Так, наприклад, електропорація була використана для трансформації протопластів Zea mays (Fromm et al., Nature 312:791-793, 1986). В основному, загальними методами доставки гена в клітини, що найчастіше використовуються, є наступні чотири типи методів: (1) хімічні методи (Graham and van der Eb, Virology, 54: 536-539, 1973), (2) фізичні методи, такі як мікроінжекція (Capecchi, Cell 22: 479-488, 1980), електропорація (Wong and Neumann, Biochem. Biophys. Res. Commun. 107: 584-587, 1982; Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 5824-5828, 1985, патент США №5384253) і "вистрілювання" гена (Jonhston & Tang, Methods Cell Biol. 43: 353-365, 1994); (3) метод з використанням вірусних векторів (Clapp, Clin. Perinatol. 20: 155-168, 1993; Lu et al., J. Exp. Med. 178: 2089-2096, 1993; Eglitis & Anderson, Biotechniques 6: 608-614, 1988) і (4) метод на основі опосередкованих рецепторами механізмів (Curiel et al., Hum. Gen. Ther. 3: 147-154, 1992; Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 60996103,1992). Трансформація протопластів рослини може бути досягнута методами на основі преципітації фосфатом кальцію, обробки поліетиленгліколем, електропорації і їх комбінації. Див., наприклад, Potrykus et al., Мої. Gen. Genet., 205: 193-200, 1986; Lorz et al., Моl. Gen. Genet, 199:178, 1985; Fromm et al., Nature, 319: 791,1986; Uchimiya et al., Моl. Gen. Genet. 204:204,1986, Callis et al., Genes and Development, 1183, 1987; Marcotte et al., Nature, 335: 454, 1988). Застосування цих систем до різних видів рослин залежить від здатності рослини даного виду регенеруватись з протопластів. З цих методів, відповідними методами для кукурудзи є методи, описані в патенті США №5569834 і в патенті США №5416011; McCabe et al., Biotechnology 6:923, 1988; Christou et al., Plant Physiol., 87: 671-674, 1988). Прикладами методів регенерації зернових культур з протопластів є також методи, описані Fujimura et al., Plant Tissue Culture Letters, 2: 74, 1985; Toriyama et al., Theor. Appl. Genet. 205: 34, 1986; Yamada et al., Plant Cell Rep.4: 85,1986; Abdullah et al., Biotechnology, 4: 1087,1986). Трансгенна рослина, така як трансгенна рослина кукурудзи MON863, продукована методами трансформації, звичайно містить один додатковий ген Сrу3Вb на одній хромосомі. Така трансгенна рослина може називатись гетерозиготною за додатковим геном Сrу3Вb. Більш переважним є трансгенна рослина, гомозиготна за додатковим геном Сrу3Вb, тобто трансгенна рослина, що містить два додаткових гени Сrу3Вb, один ген в одному і тому ж локусі на кожній з пари хромосом. Гомозиготна трансгенна рослина може бути одержана шляхом статевого схрещування (самозапилення) незалежно сегрегованої трансгенної рослини, яка містить один додатковий ген Сrу3Вb, пророщування деякого продукованого насіння; і 87808 22 аналізу одержаних рослин на присутність гена Сrу3Вb. Потрібно зазначити, що дві різних трансгенних рослини можуть бути також схрещені з одержанням потомства, яке містить два додаткових гени Сrу3Вb, що незалежно сегрегуються. Самозапилення відповідного потомства може продукувати рослини, які є гомозиготними за обома додатковими генами Сrу3Вb, що кодують поліпептиди Сrу3Вb. В даному винаході також розглядається зворотне схрещування з батьківською рослиною і ауткросинг з нетрансгенною рослиною, а також вегетативне розмноження. Зокрема, спосіб продукування рослини кукурудзи, резистентної до зараження комахами загону Твердокрилих, може бути здійснений шляхом проведення наступних стадій: 1) статевого схрещування першої рослини кукурудзи, вирощеної з насіння трансгенної кукурудзи MON863, що містить молекулу ДНК, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NО:1, SEQ ID NО: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NО:4 і SEQ ID NО:20, і яка надає резистентності до зараження комахами загону Твердокрилих, і другої рослини кукурудзи, що не володіє резистентністю до зараження комахами загону Твердокрилих, і продукування в результаті цього схрещування множини рослин першого потомства; 2) відбору рослин першого потомства, які є резистентними до зараження комахами загону Твердокрилих; 3) самозапилення рослини вказаного першого потомства з продукуванням множини рослин другого потомства; і 4) відбору з вказаних рослин другого потомства рослини, резистентного до зараження комахами загону Твердокрилих. Рослина першого потомства, яка є резистентною до зараження комахами загону Твердокрилих, або рослина другого потомства, яка є резистентною до зараження комахами загону Твердокрилих, може бути піддана зворотному схрещуванню з другою рослиною кукурудзи або з третьою рослиною кукурудзи з одержанням рослини кукурудзи, резистентної до зараження комахами загону Твердокрилих. Методи регенерації, виведення і культивування рослин, таких як рослини MON863, з трансформантів або різних трансформованих експлантатів добре відомі фахівцям (Weissbach & Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology. Eds., Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1988). Такий спосіб регенерації і культивування звичайно включає стадії відбору трансформованих клітин, що містять екзогенні гени Сrу3Вb, культивування цих спеціалізованих клітин шляхом проведення звичайних стадій ембріонального розвитку, з подальшим проведенням стадії вкорінення проростків. Трансгенні ембріони і насіння регенеруються аналогічним чином. Одержані трансгенні кореневі паростки потім висаджують у відповідне середовище для вирощування рослин, таке як ґрунт. Методи регенерації рослин, що містять чужорідний екзогенний ген, який кодує потрібний білок, добре відомі фахівцям. Як описано в даному винаході, регенеровані рослини, такі як регенеровані рослини MON863, що містять нуклеїнові кислоти Сrу3Вb, або дикого типу, або хімічно синтезовані, і кодуючі білки Сrу3Вb, можуть бути, переважно, 23 піддані самозапиленню з одержанням гомозиготних трансгенних рослин кукурудзи, що обговорюються нижче. В іншому випадку, пилок, одержаний від вказаних регенерованих рослин кукурудзи, може бути підданий схрещуванню з пилком вирощених з насіння рослин агрономічно цінних ліній. І навпаки, пилок від цих цінних ліній може бути використаний для запилення регенерованих рослин. Трансгенна рослина MON863 даного винаходу може бути культивована методами, добре відомими фахівцям. Існують різні методи регенерації рослин з рослинних тканин. Вибір конкретного методу регенерації залежить від тканини вихідної рослини і від конкретного виду регенерованої рослини. Трансформація однодольних рослин методами електропорації, бомбардування частинками та інфікування Agrobacterium також описана в літературі. Трансформація і регенерація рослини може бути здійснена для багатьох однодольних рослин, включаючи кукурудзу, спаржу, ячмінь і пшеницю і т.п.(Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84: 5345, 1987; Wan & Lemaux, Plant Physiol 104: 37,1994; Rhodes et al., Science 240: 204,1988; Gordon-Kamm et al., Plant Cell, 2: 603, 1990; Fromm et al., Bio/Technology 8: 833, 1990; Armstrong et al., Crop Science 35: 550-557, 1995; Vasil et al., Bio/Technology 10: 667,1992; патент США №5631152). Крім процедур, що обговорюються вище, фахівці-практики знайомі з відомими джерелами, в яких описані конкретні умови, процедури конструювання, модифікації і виділення макромолекул (наприклад, молекул ДНК, плазмід і т.п.), генерування рекомбінантних організмів, а також скринінг і виділення клонів (див., наприклад, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989; Maliga et al., Methods in Pland Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press, 1995; Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA, 1, Cold Spring Harbor, New York, 1997). Набори для детекції ДНК можуть бути розроблені з використанням описаних тут композицій і методів, добре відомих фахівцям в галузі детекції ДНК. Такі набори можуть бути використані для ідентифікації ДНК трансгенної кукурудзи MON863 в зразку і для виведення рослин кукурудзи, що містять ДНК MON863. Ці набори містять одну або декілька ДНК-послідовностей, що містять щонайменше 11 суміжних нуклеотидів, гомологічних або комплементарних послідовностям, вибраним з групи, що складається з SEQ ID NО:1, SEQ ID NО:2, SEQ ID NО:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NО:5, SEQ ID NО:6, SEQ ID NО:7, SEQ ID NО:8, SEQ ID NО:9, SEQ ID NО:10, SEQ ID NО:11, SEQ ID NО:12, SEQ ID NО:13, SEQ ID NО:14, SEQ ID NО:15, SEQ ID NО:16, SEQ ID NО:17, SEQ ID NО:18, SEQ ID NО:19, SEQ ID NО:20, SEQ ID NО:21 і їх комплементів. Ці ДНК-послідовності можуть бути використані в реакціях ампліфікації ДНК або як зонди в методі гібридизації ДНК. Нижченаведені приклади наводяться з метою ілюстрації деяких переважних варіантів здійснення винаходу. Для кожного фахівця очевидно, що у способах, описаних в цих прикладах, в яких автори 87808 24 детально викладають принципи здійснення даного винаходу, закладені основні ідеї, необхідні для здійснення даного винаходу, а тому ці способи можуть розглядатись як приклади здійснення переважних варіантів даного винаходу. Однак, для кожного фахівця очевидно, що, виходячи з представленого опису винаходу, в конкретні варіанти винаходу може бути внесена множина змін, в результаті яких можуть бути одержані такі ж або аналогічні результати, що не виходять за рамки сутності і об'єму даного винаходу. Приклади Приклад 1. Виділення і характеристика ДНКпослідовностей, фланкуючих трансгенну вставку MON863 Трансформовану кукурудзу MON863 генерували методом бомбардування прискореними частинками з використанням виділеного з агарозного гелю рестрикційного 4,7 т.п.н.-МіuІ-фрагмента, що походить від плазмідного вектора PV-ZMIR13 (pMON25097, Фіг.1). Експресуючий рослинний вектор ρΜΟΝ25097 містить першу експресійну касету, що включає неприродну промоторну послідовність CaMV35S AS4 (P-CaMV.AS4 SEQ ID NО:17), функціонально приєднану до нетрансльованої лідерної послідовності зв'язувального білка А/В хлорофілу пшениці (L-Ta.hcb1, SEQ ID NO: 18), яка функціонально приєднана до інтронної послідовності актину рису (I-Os.Act1, SEQ ID NО:19), функціонально приєднаної до неприродної послідовності, що кодує варіант білка Сrу3Вb (SEQ ID NО:20) і функціонально приєднаної до послідовності термінації транскрипції і послідовності поліаденілування білка теплового шоку Hsp17 пшениці (T-Ta.Hsp17, SEQ ID NО:21). Експресуючий рослинний вектор pMON25097 містить другу експресійну касету, приєднану до Сrу3Вb-експресійного кластера, який повідомляє трансформованій тканині рослини резистентність до паромоміцину (тобто 3'-кінець Сrу3Вb-експресійної касети приєднаний до 5'-кінця другої експресійної касети, що повідомляє резистентність до паромоміцину). Ця касета, яка повідомляє резистентність, складається з енхансерної промоторної послідовності CaMV35S (патент США №5164316), яка функціонально приєднана до послідовності, що кодує неоміцинфосфотрансферазу (патент США №5569834) і функціонально приєднаної до послідовності термінації транскрипції і послідовності поліаденілування нопалін-синтази (Fraley et al., Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 80: 4803-4807, 1983). Трансгенні рослини кукурудзи, резистентні до паромоміцину, одержували, в основному, як описано в патенті США №5424412. Молекулярна характеризація вставки в трансгенну кукурудзи MON863 продемонструвала, що у вказаній ;грансгенній кукурудзі MON863 присутня одна копія ДНК-фрагмента, що використовується для трансформації. Для розробки трансформантспецифічних методів ПЛР-ідентифікації, послідовності ДНК кукурудзи, фланкуючі 5’- і 3’-кінці вставки в трансформанті кукурудзи MON863, були визначені з використанням технології "прогулянки по геному" (GenomeWalker™, Clontech Laboratories, Inc.) відповідно до інструкцій вироб 25 ників. Вказаний метод "прогулянки по геному", GenomeWalker™, передбачає спочатку повний гідроліз очищеної ДНК кукурудзи MON863 різними рестриктуючими і затуплювальними кінці ферментами, що є в наборі GenomeWalker™. Потім, очищені геномні ДНК-фрагменти з тупими кінцями лігували з адаптерами GenomeWalker™, що містять відомі фрагменти нуклеїнової кислоти. Після цього, кожний продукт лігування ампліфікували в першій ПЛР-реакції з використанням зовнішнього праймера-адаптора, SEQ ID NО:22 (5’GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’), що поставляється GenomeWalker™, і зовнішнього генспецифічного праймера (SEQ ID NО:13, 5'GAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCC-3’ і SEQ ID NO: 15, 5’-GCGAGTCTGATGAGACATCTCTGTAT3’, для 5’- і 3’-кінців трансгенної вставки, відповідно). Потім першу суміш ПЛР-продукту розводили і використовували як матрицю для другої або "гніздової" ПЛР з "гніздовим" праймером-адаптором, SEQ ID NО:23 (5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’), що поставляється GenomeWalker™, і з "гніздовим" генспецифічним праймером (SEQ ID NО:14, 5’TCGGCAGAGGCATCTTGAATGATAGC-3’ і SEQ ID NО:16, 5’-AATTTGGTTGATGTGTGTGCGAGTTCT31 для 5і- і 3’-кінців трансгенної вставки, відповідно). Вторинний ПЛР-продукт, який починається з відомих генспецифічних послідовностей і тягнеться до невідомої суміжної геномної ДНК, може бути потім секвенований методами, добре відомими фахівцям. Після визначення фланкуючих геномних послідовностей кукурудзи були розроблені ПЛРаналізи, за допомогою яких може бути детектована присутність ДНК рослини кукурудзи PV-ZMR13 (MON863) в зразку. Після проведення цієї процедури, нуклеотидна послідовність, представлена в SEQ ID NО:5, була охарактеризована як геномна послідовність кукурудзи, яка є безпосередньо суміжною з довільно встановленим 5'-кінцем ДНК-фрагмента pMON25097 і розташованою вище від цього фрагмента, який був вбудований в геном кукурудзи, в результаті чого був сконструйований і виділений трансгенний трансформант кукурудзи MON863. Фахівцеві в даній галузі, або навіть будь-якому середньому фахівцеві повинно бути відомо, що додаткова інформація про нуклеотидну послідовність може бути легко одержана навіть в тому випадку, якщо ця послідовність розташована на більш далекій відстані від послідовності стику, представленої в SEQ ID NО:1, але, при цьому, знаходиться в геномі кукурудзи, ніж послідовність довжиною в 242 нуклеотиди, представлена в SEQ ID NО:5, і послідовність, що тягнеться від нуклеотиду в положенні 267 до нуклеотиду в положенні 508 і представлена в SEQ ID NО:3. Аналогічним чином, нуклеотидна послідовність, представлена в SEQ ID NО:6, була охарактеризована як геномна послідовність кукурудзи, яка є безпосередньо суміжною з довільно встановленим З-кінцем ДНКфрагмента pMON25097 і розташованою нижче від цього фрагмента, який був вбудований в геном кукурудзи, в результаті чого був сконструйований і виділений трансгенний трансформант кукурудзи MON863. Фахівцеві в даній галузі також відомо, що 87808 26 додаткова інформація про нуклеотидну послідовність може бути легко одержана навіть в тому випадку, якщо ця послідовність розташована на більш далекій відстані від послідовності стику, представленої в SEQ ID NО:2, але, при цьому, знаходиться в геномі кукурудзи, ніж послідовність довжиною в 224 нуклеотиди, представлена в SEQ ID NО:6, і послідовність, що тягнеться від нуклеотиду в положенні 361 до нуклеотиду в положенні 584 і представлена в SEQ ID NО:4. Приклад 2. Детекція присутності ДНК MON863 в зразку Нижче наводиться необмежувальний приклад ПЛР-аналізів, розроблених для детекції наявності ДНК MON863 в зразку. ДНК екстрагували приблизно з 100 мг тканини дробленого зерна з використанням міні-набору (Qiagen Dneasy Plant Mini Kit (catalog # 68163, Valencia CA) відповідно до протоколу, рекомендованого виробниками, з одним лише виключенням. А саме, перед екстракцією, зерно, що використовується, витримували в холодильнику при -80°С, і не подрібнювали у присутності рідкого азоту з використанням ступки і товкача безпосередньо перед екстракцією. Кількісну оцінку ДНК проводили методами, добре відомими фахівцям, з використанням флуориметру Hoeffer DNA Quant 2000 Fluorometer і молекулярного маркера IX Boehringer Mannhiem (Indianapolis, IN), як ДНК-стандарт для калібрування. ПЛР-аналіз геномних ДНК-послідовностей, фланкуючих 5'-кінець вставки в MON863, здійснювали з використанням одного праймера (праймера А), що походить від 5'-геномної фланкуючої послідовності (SEQ ID NО:9, 5’GTCTTGCGAAGGATAGTGGGAT-3'), і спареного з другим праймером (праймером В), локалізованим біля 5'-кінця вбудованої ДНК в промоторі 35S (SEQ Ш NO:10, 5'-CATATGACATAAGCGCTCTTGG-3'), охоплюючи ділянку в 508п.н. ПЛР-аналіз геномних ДНК-послідовностей, фланкуючих 3’-кінець вставки в MON863, здійснювали з використанням одного праймера (праймера D), що походить, від 3’геномної фланкуючої послідовності (SEQ ID NО:12, 5'-AGACTCTATGCTCTGCTCATAT-3'), і спареного з другим праймером (праймером С), локалізованим в послідовності поліаденілування taHsp17 біля 3'-кінця вставки, охоплюючи ділянку в 584п.н. (SEQ ID NО:11, 5'CTGATCATTGGTGCTGAGTCCTT-3') (Фіг.2). ПЛРаналізи проводили з використанням 50 нг геномної ДНК трансгенної кукурудзи MON863 або матриці геномної ДНК нетрансгенної MON863 в реакційному об'ємі 50мкл, що містить Mg2+ в кінцевій концентрації 1,5мМ, 0,4мкМ кожного праймера, 200мкМ кожного dNTP і 2,5 одиниць ДНК-полімерази Taq. Реакцію здійснювали в наступних умовах: 1 цикл при 94°С протягом 3 хвилин; 38 циклів при 94°С протягом 30 секунд, при 60°С протягом 30 секунд, і при 72°С протягом 1,5 хвилини; і 1 цикл при 72°С протягом 10 хвилин. ПЛР-продукти (20мкл) очікуваного розміру, які являють собою геномну послідовність, фланкуючу 5'- і 3'-кінці вставки, виділяли за допомогою гельелектрофорезу в 2,0% агарозному гелі при 60 В 27 протягом ~1 години, і візуалізували шляхом фарбування етидійбромідом. ПЛР-фрагменти, що являють собою 5і- і 3’-фланкуючі послідовності, вирізали з гелю і очищали з використанням набору для гель-фільтрації QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, catalog #28704) відповідно до процедури, рекомендованої виробником. Потім, очищені ПЛРпродукти секвенували з використанням вихідних ПЛР-праймерів хімічним методом обриву ланцюга барвником. Як і очікувалось, контрольні реакції, що не містять матрицю, а також реакції, що містять нетрансгенну ДНК кукурудзи, не генерували ПЛР-продукт з будь-яким набором праймерів. У ПЛР-аналізах ДНК резистентного до листоїду трансформанту MON863, що проводяться з використанням праймерів А і В, що мають послідовності SEQ ID NО:9 і 10, генерувались продукти очікуваного розміру в 508п.н., які являють собою 5'-фланкуючу послідовність (SEQ ID NO:3), а в ПЛР-аналізах, що проводяться з використанням праймерів D і С, що мають послідовності SEQ ID NО:11 і 12, генерувались продукти розміром в 584 п.н., які являють собою 3’-фланкуючу послідовність (SEQ ID NО:4). Дані, одержані для цих послідовностей показали, що 5'-амплікон, тобто SEQ ID NО:3, складається з 266п.н. 5'-кінця промотору 35S у 5'-кінця вставки, за якою слідують 242п.н. геномної фланкуючої ДНК кукурудзи. Дані для цих послідовностей показали, що 3’-амплікон, тобто SEQ ID NО:4, складається з 360п.н. 3’-послідовності поліаденілування tahsp17, яка визначає 3’-кінець вставки, за якою безпосередньо слідують 224п.н. геномної фланкуючої ДНК кукурудзи. Агрономічно і економічно цінні продукти і/або їх композиції, якими є, але не обмежуються ними, корм для тварин, основні продукти харчування, а також продукти і субпродукти з кукурудзи, і які можуть бути використані як харчові продукти або як композиції, призначені для вживання в їжу, включаючи, але не обмежуючись ними, кукурудзяну муку, кормову кукурудзяну муку, кукурудзяну патоку, кукурудзяну олію, кукурудзяний крохмаль, попкорн, кукурудзяні коржики, кукурудзяні пластівці і 87808 28 субпродукти з кукурудзи і т.п., також входять в об'єм даного винаходу, якщо ці продукти і їх композиції містять детектовані кількості нуклеотидних послідовностей, описаних в даній заявці і що є діагностичними показниками для ідентифікації трансгенної кукурудзи MON863. Насіння, що містить трансген кукурудзи MON863, було депоноване заявником 17 жовтня 2000р. в Американській колекції типових культур (АТСС), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, USA ZIP 20110-2209. Заявнику була видана розписка АТСС про прийом депозиту трансформанту кукурудзи Zea mays MON863 PV-ZMIR13, якому був присвоєний реєстраційний номер АТСС №РТА-2605. Однак, для кожного фахівця очевидно, що, виходячи з представлених прикладів, у вищезгадані аналізи, які використовуються для детекції ДНК, що походить від трансформанту кукурудзи MON863, в зразку, може бути внесена множина змін. Так, наприклад, може бути розглянута серія праймерів, що містить один праймер, комплементарний геномній ДНК кукурудзи, та інший праймер, комплементарний послідовностям, що знаходяться всередині вставки. Крім того, можуть бути також розглянуті будь-які інші раніше описані аналізи гібридизації з використанням ДНК-зондів, комплементарних новим послідовностям нуклеїнової кислоти, локалізованим в місці стику "трансген/ген". При цьому, очевидно, що відповідно до проілюстрованих і описаних вище принципів даного винаходу, кожний фахівець може внести зміни в загальну структуру і конкретні деталі опису винаходу, що не виходять за рамки вказаних принципів. Авторами даного винаходу заявлені всі зміни, що не виходять за рамки сутності і об'єму винаходу, сформульованої в прикладеній нижче формулі винаходу. Всі публікації і опубліковані патенти, цитовані в даній заявці, вводяться в даний винахід за допомогою посилання, так, як якби кожна окрема публікація або патентна заявка була конкретно і окремо введена в даний винахід за допомогою посилання. 29 87808 30 31 87808 32 33 87808 34 35 87808 36 37 87808 38 39 87808 40 41 87808 42 43 87808 44 45 Комп’ютерна верстка Т. Чепелева 87808 Підписне 46 Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601