Застосування arry-520 для лікування множинної мієломи у пацієнтів з низьким рівнем акг

Реферат: Винахід стосується застосування сполуки ARRY-520 для лікування множинної мієломи у пацієнтів з низькою [АКГ], при якому низька [АКГ] становить менше, ніж близько 1,1 г/л. UA 113017 C2 (12) UA 113017 C2 UA 113017 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 [0001] У даній заявці заявлено пріоритет за попередньою заявкою на патент США № 61/682682, поданою 13 серпня 2012; попередньою заявкою на патент США № 61/734149, поданою 3 січня 2013; попередньою заявкою на патент США № 61/829779, поданою 31 травня 2013; кожна з яких повною мірою включена в даний документ за допомогою посилання. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ [0002] ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ [0003] Винахід відноситься до ARRY-520 та лікування хворих на рак із низьким рівнем [AКГ]. [0004] ОПИС ВІДОМОГО РІВНЯ ТЕХНІКИ [0005] (S)-2-(3-амінопропіл)-5-(2,5-дифторфеніл)-N-метокси-N-метил-2-феніл-1,3,4-тіадіазол3 (2H) -карбоксамід, відомий також як «ARRY-520», має таку формулу: і є інгібітором білка веретена кінезина («БВК») (див. US 7449486, US 2010/0099697 і WO 2010/045624, зміст яких включено в даний опис повною мірою за допомогою посилання). Інгібування БВК призводить до затримки мітозу проліферуючих клітин і подальшої їх загибелі. ARRY-520 продемонстрував клінічну активність у пацієнтів з рецидивуючою та рефрактерною множинною мієломою («ММ»). Фармакокінетика («ФК») ARRY-520 варіює серед пацієнтів, незважаючи на внутрішньовенне введення («ВВ»). [0006] Зв'язування сироваткового білка з лікарськими препаратами може змінити їхні активність і ФК та, ймовірно, вплинути на клінічну активність. Людський сироватковий альбумін («ЛСА») і людський α 1-кислотний глікопротеїн («АКГ») є найбільш поширеними білками плазми із середніми фізіологічними концентраціями близько 40 г/л і 0,6-1,2 г/л відповідно. АКГ є сироватковим білком гострої фази, який продукується печінкою у відповідь на запалення та інфекцію. Незважаючи на те, що є дані про позапечінкову експресію, АКГ продукується переважно в печінці. Рівень АКГ іноді підвищується в крові хворих на рак, включаючи множинну мієлому. Рівень АКГ у плазмі може варіювати залежно від фізіологічних, патологічних і генетичних факторів. Зміни рівня АКГ в плазмі можуть безпосередньо впливати на концентрації незв'язаного лікарського препарату, і, таким чином, змінювати ФК лікарського препарату та його фармакодинаміку («ФД»). Висока концентрація АКГ пов'язана з ослабленням відповіді і скороченням виживаності без прогресування («ВБП») для лікарських препаратів, які міцно зв'язуються з АКГ (Bruno, Rene, et al. "α -1-Acid Glycoprotein As an Independent Predictor for Treatment Effects and a Prognostic Factor of Survival in Patients with Non-small Cell Lung Cancer Treated with Docetaxel." Clin. CancerRes.Vol. 9 (2003): pp. 1077-1082). На момент встановлення діагнозу, концентрація АКГ у пацієнтів з множинною мієломою становила від 0,4 до 4,1 г/л, при чому 24% з них мали високу концентрацію АКГ (Felliniemi Tarja-Terttu, et al. "Immunoreactive Interleukin-6 and Acute Phase Proteins as Prognostic Factors in Multiple Myeloma." Blood. Vol. 85, No. 3 (February 1, 1995): pp. 765-771). Див. також, Brown, Karin D., et al. "An Effective Screening Approach to Assess the Impact of α-1 Acid Glycoprotein Binding on the Fraction Unbound of a Drug." th 17 North American Regional International Society for the Study of Xenobiotics Meeting, Atlanta, Georgia, October 18, 2011, Abstract #25022, www.arraybiopharma.com/_documents/Publication/PubAttachment479.pdf. СУТЬ ВИНАХОДУ [0007] Несподівано було виявлено, що пацієнти, які отримували ARRY-520, демонстрували кращу відповідь за умови низької [АКГ] перед введенням ARRY-520. [0008] В одному аспекті даний винахід відноситься до застосування ARRY-520 для лікування раку у пацієнтів з низькою [АКГ]. [0009] В іншому аспекті пропонується застосування ARRY-520 для лікування раку у пацієнта, що включає в себе (а) аналіз біологічного зразка, отриманого від пацієнта, на [АКГ], (b) визначення того, чи має зразок низьку [АКГ], і (с) введення терапевтично ефективної кількості ARRY-520 пацієнтові з низькою [АКГ]. 1 UA 113017 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0010] В іншому аспекті пропонується застосування ARRY-520 для лікування раку у пацієнта, що включає в себе (а) отримання біологічного зразка від пацієнта, (b) аналіз [АКГ] у біологічному зразку, (с) визначення того, чи має зразок низьку [ АКГ], і (d) введення терапевтично ефективної кількості ARRY-520 пацієнтові з низькою [АКГ]. [0011] В іншому аспекті пропонується спосіб лікування раку у хворого на рак, визначеного як такий, що має низьку [АКГ], що включає етап лікування пацієнта ARRY-520, в тому числі: (а) визначення пацієнта як такого, що має низьку [АКГ] шляхом аналізу біологічного зразка, отриманого від пацієнта, і (b) введення терапевтично ефективної дози ARRY-520 пацієнтові з низькою [АКГ]. [0012] В іншому аспекті пропонується спосіб лікування раку у хворого на рак, визначеного як такий, що має низьку [АКГ], що включає етап лікування пацієнтів ARRY-520, в тому числі: (а) отримання біологічного зразка від пацієнта, (b) визначення пацієнта як такого, що має низьку [АКГ] шляхом аналізу біологічного зразка, отриманого від пацієнта, і (c) введення ARRY-520 пацієнтові з низькою [АКГ]. [0013] В іншому аспекті пропонується спосіб виявлення пацієнта, який з більшою ймовірністю піддається лікуванню ARRY-520, що включає в себе отримання і аналіз біологічного зразка від пацієнта для визначення [АКГ], за якого низька [АКГ] вказує на підвищену ймовірність відповіді пацієнта на лікування ARRY- 520. [0014] В іншому аспекті пропонується спосіб виявлення пацієнта, який з більшою ймовірністю піддається лікуванню ARRY-520, що включає отримання біологічного зразка від пацієнта, аналіз зразка для визначення [АКГ] і визначення підвищеної ймовірності відповіді пацієнта на лікування ARRY-520, за якого низька [АКГ] вказує на підвищену ймовірність відповіді пацієнта на лікування ARRY-520. [0015] В іншому аспекті пропонується спосіб підвищення ймовірності відповіді у хворого на рак, що включає: (а) класифікацію пацієнта як такого, що має низьку [АКГ] за допомогою аналізу біологічного зразка, отриманого від пацієнта; і (b) введення ARRY-520 пацієнтові, що має предиктор підвищеної ймовірності відповіді. [0016] В іншому аспекті пропонується спосіб підвищення ймовірності відповіді у хворого на рак, що включає: (а) отримання біологічного зразка від пацієнта; (b) аналіз зразка для вимірювання [АКГ]; (c) визначення того, чи має зразок низьку [АКГ]; (d) класифікацію пацієнта як такого, що має велику ймовірність відповіді, якщо пацієнт має низьку [АКГ]; і (е) введення ARRY520 пацієнтові, який з більшою ймовірністю піддається лікуванню. [0017] В іншому аспекті пропонується спосіб прогнозування підвищеної ймовірності терапевтичної відповіді пацієнта на спосіб лікування раку із застосуванням ARRY-520, що включає: (а) вимірювання [AКГ] в біологічному зразку, отриманому від пацієнта; (b) визначення того, чи має зразок низьку [АКГ]; (c) класифікацію пацієнта як такого, що має велику ймовірність відповіді, якщо пацієнт має низьку [АКГ]; і (d) введення ARRY-520 пацієнтові, який з більшою ймовірністю піддається лікуванню. [0018] В іншому аспекті пропонується спосіб прогнозування підвищеної ймовірності терапевтичної відповіді пацієнта на спосіб лікування раку із застосуванням ARRY-520, що включає: (а) отримання біологічного зразка від пацієнта; (b) вимірювання рівня [AКГ] в біологічному зразку, отриманому від пацієнта; (c) визначення того, чи має зразок низьку [АКГ]; (d) класифікацію пацієнта як такого, що має велику ймовірність відповіді, якщо пацієнт має низьку [АКГ]; і (е) введення ARRY-520 пацієнтові, який з більшою ймовірністю піддається лікуванню. [0019] В іншому аспекті пропонується спосіб визначення підвищеної ймовірності чутливості хворого на рак до лікування ARRY-520, що включає: (а) вимірювання рівня [AКГ] в біологічному зразку, отриманому від пацієнта; і (b) класифікацію пацієнта як такого, що має підвищену ймовірність чутливості до лікування ARRY-520, якщо біологічний зразок має низьку [АКГ]. [0020] В іншому аспекті пропонується спосіб визначення підвищеної ймовірності чутливості хворого на рак до лікування із застосуванням ARRY-520, що включає: (а) отримання біологічного зразка від пацієнта; (b) вимірювання рівня [AКГ] в біологічному зразку; і (с) класифікацію пацієнта як такого, що має підвищену ймовірність чутливості до лікування ARRY520, якщо біологічний зразок має низьку [АКГ]. [0021] В іншому аспекті пропонується спосіб застосування ARRY-520 для лікування пацієнта, у якого діагностовано рівень [AКГ] нижче, ніж близько 1,1 г/л, що включає введення однієї або більше стандартних доз ARRY-520. [0022] В іншому аспекті пропонується спосіб застосування ARRY-520 для лікування пацієнта, у якого діагностовано рівень [AКГ] нижче, ніж близько 1,1 г/л, що включає введення однієї або більше стандартних доз ARRY-520 вказаному пацієнтові у кількості, ефективній для 2 UA 113017 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 досягнення рівня незв'язаного ARRY-520, не меншої, ніж IC50, розрахована за результатами тестування in vitro. [0023] В іншому аспекті пропонується спосіб лікування раку у пацієнта з низьким рівнем [AКГ], що включає введення пацієнту ефективної кількості ARRY-520. [0024] В іншому аспекті пропонується спосіб лікування раку у ссавця з низьким рівнем [AКГ], що включає введення терапевтично ефективної кількості ARRY-520 ссавцю. [0025] В іншому аспекті пропонується спосіб лікування захворювання або порушення, модульованого KВБ, що включає введення ссавцю з низьким рівнем [AКГ], що потребує такого лікування, ефективної кількості ARRY-520. [0026] В іншому аспекті пропонується застосування ARRY-520 в виробництві лікарського засобу, призначеного для лікування раку у пацієнта знизьким рівнем [AКГ]. [0027] В іншому аспекті пропонується фармацевтична композиція для лікування хворого на рак і низьким рівнем [AКГ], що включає ARRY-520. [0028] В іншому аспекті пропонується фармацевтична композиція для лікування хворого на рак і низьким рівнем [AКГ], що включає ARRY-520 і фармацевтично прийнятний носій або наповнювач. КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР [0029] На Фігурі 1 представлений клітинний аналіз. [0030] На Фігурі 2 представлена імітаційна модель популяційної ФК («попФК»). [0031] На Фігурі 3 представлена імітаційна модель популяційної ФК людини («попФК»). [0032] На Фігурі 4 представлений аналіз клінічних випробувань на людях. [0033] На Фігурі 5 представлений аналіз клінічних випробувань на людях. [0034] На Фігурі 6 представлена варіабельність аналізу. [0035] На Фігурі 7 представлена лінійна регресія при порівнянні двох аналізів. [0036] На Фігурі 8 представлена лінійна регресія при порівнянні двох аналізів. [0037] На Фігурі 9 представлена лінійна регресія при порівнянні двох аналізів. [0038] На Фігурі 10 представлена лінійна регресія при порівнянні двох аналізів. ДОКЛАДНИЙ ОПИС СУТІ ВИНАХОДУ [0039] Далі будуть детально розглянуті деякі варіанти реалізації винаходу. Слід розуміти, що винахід не обмежується описаними нижче варіантами його реалізації. Навпаки, винахід направлено на охоплення всіх варіантів, модифікацій та еквівалентів, які можуть бути включені в об’єм даного винаходу, як визначено формулою винаходу. Фахівцеві відповідної галузі будуть зрозумілі багато способів і речовин, аналогічних або еквівалентних описаним в даному документі, які можуть бути використані в практиці даного винаходу. Даний винахід жодним чином не обмежується описаними способами і матеріалами. У випадку, якщо одна або більше позицій літератури, що використовується, та подібних матеріалів відрізняється або суперечить даній заявці, що включає, але не обмежується певними умовами, терміном використання, описаними методами тощо, дана заявка має перевагу. [0040] ВИЗНАЧЕННЯ [0041] Способи даного винаходу включають: способи лікування, попередження та/або стримування розвитку різних типів раку, а також захворювань і порушень, пов'язаних з або які характеризуються несприятливим ангіогенезом. Якщо не вказано інше, в даному документі термін «лікування» або «лікувати» відноситься до введення сполуки, заявленої у винаході, або іншої додаткової активної речовини після появи симптомів конкретного захворювання або порушення. Терміни «лікувати» або «лікування» відносяться також до лікувальних або паліативних процедур. Значущі або бажані клінічні результати включають, але не обмежуються ослабленням симптомів, зменшенням ступеню захворювання, стабілізацією (тобто відсутністю погіршення) захворювання, затримкою або уповільненням прогресування захворювання, поліпшенням або тимчасовим полегшенням хворобливого стану і ремісією (частковою або повною), як явними, так і прихованими. «Лікування» може також означати підвищення виживаності в порівнянні з очікуваною виживаністю пацієнта, який не отримує лікування. Пацієнти, які потребують лікування, включають тих, хто вже має або схильний мати відповідні стани або порушення. Якщо не вказано інше, термін «запобігання» в даному документі стосується введення лікарського засобу до появи симптомів, особливо пацієнтам, які мають ризик раку та інших захворювань і порушень, пов'язаних з або які характеризуються несприятливим ангіогенезом. Термін «попередження» поширюється на зменшення симптомів конкретного захворювання або порушення. Пацієнти з сімейною історією раку, а також захворювань і порушень, пов'язаних з або які характеризуються несприятливим ангіогенезом, є кращими кандидатами для профілактичних схем. Якщо не вказано інше, термін «стримування 3 UA 113017 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розвитку» в даному документі стосується запобігання рецидиву конкретного захворювання або порушення у пацієнта, що страждає від нього, та/або збільшення тривалості ремісії. [0042] Термін «близько» в даному документі означає приблизно, орієнтовно. Коли термін «близько» використовують у поєднанні з діапазоном числових значень, він змінює цей діапазон, розширюючи межі вище і нижче зазначених числових значень. В цілому, термін «близько» використовується в даному документі для зміни числового значення вище і нижче вказаного значення в межах 20%. [0043] Терміни «рак» і «раковий» відносяться до фізіологічного стану у ссавців, яке зазвичай характеризується аномальним або неконтрольованим ростом клітин. «Пухлина» включає одну або більше ракових клітин. Приклади раку включають, але не обмежуються карциномою, лімфомою, бластомою, саркомою і лейкозом або лімфоїдними злоякісними новоутвореннями. Більш конкретні приклади таких видів раку включають в себе плоскоклітинний рак (наприклад, епітеліальний плоскоклітинний рак), рак легенів, включаючи дрібноклітинний рак легенів, недрібноклітинний рак легенів («НДРЛ»), аденокарциному легенів і плоскоклітинний рак легені, рак очеревини, гепатоцелюлярний рак, рак шлунково-кишкового тракту, рак підшлункової залози, гліобластому, рак шийки матки, рак яєчника, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак молочної залози, рак товстої кишки, рак прямої кишки, колоректальний рак, карциному ендометрія або карциному матки, карциному слинних залоз, рак нирки, або ренальний рак, рак передміхурової залози, рак вульви, рак щитоподібної залози, карциному печінки, анальну карциному, карциному статевого члена, рак шкіри, включаючи меланому, а також рак голови і шиї. [0044] Фраза «фармацевтично прийнятний» означає, що речовина або композиція сумісні хімічно та/або токсикологічно з іншими інгредієнтами, що містяться в лікарському препараті, та/або з ссавцем, якого лікують ними. [0045] Фраза «фармацевтично прийнятна сіль» в даному документі відноситься до фармацевтично прийнятних органічних або неорганічних солей сполуки, описаної в даному документі. [0046] Фрази «терапевтично ефективна кількість» або «ефективна кількість» означають кількість сполуки, описаної в даному документі, яка при введенні ссавцю, що потребує такого лікування, є достатньою для (i) лікування або профілактики конкретного захворювання, стану або порушення, (iі) зменшення, полегшення або усунення одного або більше симптомів конкретного захворювання, стану або порушення, (iii) запобігання або затримки появи одного або більше симптомів конкретного захворювання, стану або порушення, описаних у даному документі. Кількість сполуки, яка буде терапевтично ефективною, може змінюватися в залежності від таких факторів, як конкретна сполука, стан хвороби і її тяжкість, індивідуальні особливості ссавця (наприклад, вага), який потребує лікування, але тим не менш може бути визначена за стандартною методикою фахівцем відповідної галузі техніки. [0047] Термін «ссавець» означає теплокровну тварину, яка має ризик розвитку захворювання, описаного в даному документі, і включає, але не обмежується морськими свинками, собаками, кішками, щурами, мишами, хом'яками і приматами, включаючи людину. [0048] ПАЦІЄНТИ З НИЗЬКОЮ [АКГ] [0049] В аналізах in vitro ARRY-520 демонструє низьку мікромолярну спорідненість з AКГ, але не з іншими сироватковими білками, такими як альбумін (Приклад 1). Виявлено, що лікування пацієнтів з низьким рівнем [AКГ] за допомогою ARRY-520 є ефективним. [0050] Термін «[AКГ]» означає концентрацію AКГ, виміряну в біологічному зразку, отриманому від пацієнта, перед введенням ARRY-520. Термін «низька [AКГ]» означає [AКГ] менше, ніж близько 1,1 г/л. Як показано у Прикладі 7, рівень 1,1 г/л вимірювали в плазмі крові за допомогою аналізу R&DSystemsQuantikine®. Як показано у Прикладі 8, існують відмінності в аналізі щонайменше на 8,6%. У певному варіанті реалізації винаходу термін «близько 1,1 г/л» означає 1,1 г/л ± 20%. В іншому варіанті реалізації винаходу термін «близько 1,1 г/л» означає 1,1 г/л ± 10%. В іншому варіанті реалізації винаходу термін «близько 1,1 г/л» означає 1,1 г/л ± 8,6%. В іншому варіанті реалізації винаходу низька [AКГ] означає [AКГ] менше, ніж близько 1,1 г/л в плазмі крові, як це визначено в аналізі R&D Systems Quantikine® (як описано у Прикладі 7). [0051] Слід розуміти, що для вимірювання [AКГ] можуть бути використані різні види аналізу. Інші аналізи можуть давати дещо відмінні результати. Якщо використовуються інші аналізи, то вони повинні корелювати з 1,1 г/л виміром в аналізі R&DSystemsQuantikine®, використаному в Прикладі 7. Наукові та статистичні методи, відомі у відповідній галузі техніки, використовуються для кореляції двох аналізів. Приклади кореляцій (перехресних порівнянь) показані в Прикладі 10. Інші аналізи можуть включати в себе, зокрема, іммунотурбідіметричні аналізи Randox Imola, RandoxDaytona, SiemensAdvia та іммунонефелометричний аналіз Siemens BNII. 4 UA 113017 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [0052] У деяких варіантах реалізації винаходу біологічним зразком для вимірювання [AКГ] є кров. Забір крові (одержання біологічного зразка) у пацієнта є добре відомою маніпуляцією у відповідній галузі техніки. У ще одному варіанті реалізації винаходу біологічним зразком для вимірювання [AКГ] є плазма. В іншому варіанті біологічним зразком для вимірювання [AКГ] є сироватка. При тестуванні була виявлена добра кореляція (>0,9) між [AКГ] в сироватці та плазмі в аналізах R&D SystemsQuantikine®, Siemens Advia, Siemens BNII і Randox Imola (всі аналізи були проведені згідно з протоколами виробника, якщо у Прикладах не вказано інше). [0053] ARRY-520, як правило, вводять внутрішньовенно. ARRY-520 зазвичай надається у вигляді ліофілізованого порошку, який міститься у флаконі з прозорого скла типу 1 для використання ВВ. Для отримання розчину порошок спочатку розчиняють у стерильній воді для ін'єкцій, потім розводять фізіологічним розчином перед ВВ введенням. [0054] Було виявлено, що основною дозолімітуючою токсичністю («ДЛТ») ARRY-520 є нейтропенія. У зв'язку з цим, з метою профілактики може застосовуватися гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор («Г-КСФ»). [0055] ARRY-520, як правило, вводять в 1-й і 2-й дні 14-денного циклу (1-й і 2-й дні, 1 раз на 2 2 2 тижні). ARRY-520, як правило, вводять в дозі 2,5 мг/м /цикл (1,25 мг/м /день) без Г-КСФ і 3,0 2 2 мг/м /цикл (1,5 мг/м /день) у поєднанні з профілактичним Г-КСФ. Проте ARRY-520 можна також вводити в 1-й день 14-денного циклу (1-й день; 1 раз на 2 тижні) або в 1-й і 15-й дні 28-денного циклу (1-й і 15 -й дні; 1 раз в 4 тижні). [0056] Було виявлено, що введення ARRY-520 пацієнтові, що має низьку [АКГ], підвищує ймовірність відповіді на ARRY-520. [0057] У зв'язку з цим в одному варіанті реалізації винаходу пропонується застосування ARRY-520 для лікування раку у пацієнта з низькою [AКГ]. [0058] Деякі варіанти реалізації винаходу пропонують застосування ARRY-520 для лікування раку у пацієнта, що включає в себе (а) аналіз біологічного зразка, отриманого від пацієнта, на [AКГ], (b) визначення того, чи має зразок низьку [АКГ], і (c) введення терапевтично ефективної кількості ARRY-520 пацієнтові, якщо він має низьку [AКГ]. [0059] Інший варіант реалізації винаходу пропонує застосування ARRY-520 для лікування раку у пацієнта, що включає в себе (а) отримання біологічного зразка від пацієнта; (b) аналіз біологічного зразка на [AКГ], (с) визначення того, чи має зразок низьку [АКГ], і (d) введення терапевтично ефективної кількості ARRY-520 пацієнтові, якщо він має низьку [AКГ]. [0060] Деякі варіанти реалізації винаходу пропонують спосіб лікування раку у хворого на рак, визначеного як такий, що має низьку [AКГ], що включає етап лікування пацієнта з ARRY-520, пропонує: (а) визначення пацієнта як такого, що має низьку [AКГ] шляхом аналізу біологічного зразка, отриманого від пацієнта, і (b) введення ARRY-520 пацієнтові, що має низьку [AКГ]. [0061] Інший варіант реалізації винаходу пропонує спосіб лікування раку у хворого на рак, визначеного як такого, що має низьку [AКГ], що включає етап лікування пацієнта ARRY-520, пропонує: (а) отримання біологічного зразка від пацієнта; (b) визначення пацієнта як такого, що має низьку [AКГ] шляхом аналізу біологічного зразка, отриманого від пацієнта, і (с) введення ARRY-520 пацієнтові, що має низьку [AКГ]. [0062] Деякі варіанти реалізації винаходу пропонують спосіб виявлення пацієнта, який з більшою ймовірністю піддається лікуванню ARRY-520, що включає отримання біологічного зразка від пацієнта і аналіз зразка для визначення [AКГ], за якого низька [АКГ] вказує на підвищену ймовірність відповіді пацієнта на лікування із застосуванням ARRY-520. [0063] Інший варіант пропонує спосіб виявлення пацієнта, який з більшою ймовірністю піддається лікуванню ARRY-520, що включає отримання біологічного зразка від пацієнта, аналіз зразка на [AКГ] і визначення підвищеної ймовірності відповіді пацієнта на лікування із застосуванням ARRY-520, за якого низька [АКГ] вказує на підвищену ймовірність відповіді пацієнта на лікування із застосуванням ARRY-520. [0064] Деякі варіанти реалізації винаходу пропонують спосіб підвищення ймовірності відповіді у хворого на рак, що включає: (а) визначення пацієнта як такого, що має низьку [AКГ] шляхом аналізу біологічного зразка, отриманого від пацієнта; і (b) введення ARRY-520 пацієнтові, класифікованому таким, що має підвищену ймовірність відповіді. [0065] Інший варіант реалізації винаходу пропонує спосіб підвищення ймовірності відповіді у хворого на рак, що включає в себе: (а) отримання біологічного зразка від пацієнта; (b) аналіз зразка для вимірювання [АКГ]; (с) визначення того, чи має зразок низьку [АКГ]; (d) класифікацію пацієнта, як такого, що має підвищену ймовірність відповіді, якщо пацієнт має низьку [AКГ]; і (е) введення ARRY-520 пацієнтові, класифікованому таким, що має підвищену ймовірність відповіді. 5 UA 113017 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0066] Деякі варіанти реалізації винаходу пропонують спосіб прогнозування підвищеної ймовірності терапевтичної відповіді пацієнта на спосіб лікування раку із застосуванням ARRY520. Спосіб включає: (а) вимірювання [AКГ] в біологічному зразку, отриманому від пацієнта; (b) визначення того, чи має зразок низьку [AКГ], (с) класифікацію пацієнта таким, що має підвищену ймовірність терапевтичної відповіді на спосіб лікування раку, якщо зразок має низьку [AКГ], і (d) введення ARRY-520 пацієнтові, класифікованому таким, що має підвищену ймовірність відповіді. [0067] Ще один варіант реалізації винаходу пропонує прогнозування підвищеної ймовірності терапевтичної відповіді пацієнта на спосіб лікування раку із застосуванням ARRY-520. Спосіб включає: (а) отримання біологічного зразка від пацієнта; (b) вимірювання [AКГ] у зразку, отриманому від пацієнта; (с) визначення того, чи має зразок низьку [AКГ], (d) класифікацію пацієнта таким, що має підвищену ймовірність терапевтичної відповіді на описаний спосіб лікування раку, якщо зразок має низьку [AКГ], і (е) введення ARRY-520 пацієнтові, класифікованому таким, що має підвищену ймовірність відповіді. [0068] Деякі варіанти реалізації винаходу пропонують спосіб прогнозування підвищеної ймовірності чутливості до лікування хворого на рак із застосуванням ARRY-520, що включає: (а) аналіз біологічного зразка, отриманого від пацієнта, на [AКГ]; і (b) визначення пацієнта як такого, що має підвищену ймовірність чутливості до лікування ARRY-520 при низькій [AКГ] у біологічному зразку. [0069] Деякі варіанти реалізації винаходу пропонують спосіб прогнозування підвищеної ймовірності чутливості до лікування хворого на рак із застосуванням ARRY-520, що включає: (а) отримання біологічного зразка від пацієнта; (b) вимір [AКГ] в біологічному зразку; і (с) ідентифікацію пацієнта як такого, що має підвищену ймовірність чутливості до лікування ARRY520 при низькій [AКГ] у біологічному зразку. [0070] Деякі варіанти реалізації винаходу пропонують спосіб застосування ARRY-520 для лікування пацієнта, у якого був виявлений рівень [АКГ] менше, ніж близько 1,1 г/л, що включає введення однієї або більше стандартних доз ARRY-520. [0071] Деякі варіанти реалізації винаходу пропонують спосіб застосування ARRY-520 для лікування пацієнта, у якого був виявлений рівень [AКГ] менше, ніж близько 1,1 г/л, що включає введення однієї або більше стандартних доз ARRY-520 вказаному пацієнтові у кількості, ефективній для досягнення рівня незв'язаного ARRY-520, не меншій, ніж IC50, розрахована за результатами тестування in vitro. У додатковому варіанті реалізації винаходу IC 50, розрахована за результатами тестування in vitro, становить близько 0,2 нг/мл. У додатковому варіанті реалізації винаходу IC50, розрахована за результатами тестування in vitro, становить 0,2 нг/мл. [0072] Деякі варіанти реалізації винаходу пропонують спосіб лікування раку у пацієнта з низькою [AКГ], що включає введення пацієнту ефективної кількості ARRY-520. [0073] Деякі варіанти реалізації винаходу пропонують спосіб лікування раку у ссавця з низькою [AКГ], що включає введення терапевтично ефективної кількості ARRY-520 ссавцю. [0074] Деякі варіанти реалізації винаходу пропонують спосіб лікування захворювання або порушення, модульованого БВК, що включає введення ссавцю, який потребує такого лікування, ефективної кількості ARRY-520, якщо ссавець має низьку [AКГ]. [0075] Інший варіант реалізації винаходу пропонує застосування ARRY-520 у виробництві лікарського засобу, призначеного для лікування раку у пацієнта, що має низький рівень AКГ. [0076] Один з варіантів реалізації винаходу пропонує фармацевтичну композицію, що містить ARRY-520, для лікування хворого на рак з низькою [AКГ]. Ще один варіант пропонує фармацевтичну композицію, що містить ARRY-520 разом з фармацевтично прийнятним носієм або наповнювачем для лікування хворого на рак з низькою [AКГ]. У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтично прийнятним наповнювачем є манітол. [0077] Також пропонуються способи лікування захворювання або патологічного стану шляхом введення ARRY-520. В одному з варіантів реалізації винаходу пацієнт – людина з низькою [AКГ] – отримує лікування ARRY-520 в комплексі з фармацевтично прийнятним носієм, ад'ювантом або наповнювачем у кількості, яка достовірно інгібує активність БВК. [0078] В іншому варіанті реалізації винаходу пропонується спосіб лікування або профілактики раку у ссавця, який потребує такого лікування, що включає введення вказаному ссавцю терапевтично ефективної кількості ARRY-520. [0079] У деяких варіантах реалізації винаходу рак вибирається серед раку молочної залози, раку яєчника, раку шийки матки, раку передміхурової залози, раку сім'яників, раку сечостатевої системи, раку стравоходу, раку гортані, гліобластоми, нейробластоми, раку шлунка, раку шкіри, кератоакантоми, раку легенів, плоскоклітинного раку, крупноклітинної карциноми, недрібноклітинного раку легені, дрібноклітинного раку, аденокарциноми легені, раку кісткового 6 UA 113017 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мозку, раку товстої кишки, аденоми, раку підшлункової залози, аденокарциноми, раку щитоподібної залози, фолікулярної карциноми, недиференційованої карциноми, папілярної карциноми, семіноми, меланоми , саркоми, карциноми сечового міхура, раку печінки і жовчних проток, раку нирки, мієлоїдних порушень, лімфоїдних порушень, раку ворсистих клітин, раку ротової порожнини і глотки (орального раку), раку губ, раку язика, раку рота, раку глотки, раку тонкого кишечника, раку ободової і прямої кишки, раку товстої кишки, раку прямої кишки, раку мозку і центральної нервової системи, хвороби Ходжкіна і лейкозу. [0080] У деяких варіантах реалізації винаходу рак являє собою гемобластоз. У деяких варіантах реалізації винаходу рак вибирається серед лімфоми, лейкозу та множинної мієломи. У деяких варіантах реалізації винаходу рак вибирається серед лейкозу і множинної мієломи. У деяких варіантах реалізації винаходу рак вибирається серед гострого міелоїдного лейкозу та множинної мієломи. У деяких варіантах реалізації винаходу пропонується призначення препарату при множинній мієломі. У деяких варіантах пропонується призначення препарату при гострому мієлоїдному лейкозі. [0081] У деяких варіантах реалізації винаходу рак являє собою солідну пухлину. В інших варіантах реалізації винаходу рак вибирається серед раку шкіри, раку молочної залози, раку головного мозку, цервікальної карциноми і раку яєчка. В інших варіантах реалізації винаходу рак вибирається серед раку молочної залози, колоректального раку, недрібноклітинного раку легені, раку підшлункової залози, раку сечового міхура, раку слинних залоз (аденокістозного), раку стравоходу, мезотеліоми і змішаного дрібноклітинного раку легені/недрібноклітинного раку легені. [0082] КОМБІНОВАНА ТЕРАПІЯ [0083] Сполуки, стереоізомери і фармацевтично прийнятні солі, описані в даному документі, можуть застосовуватися для лікування окремо або в поєднанні з іншими терапевтичними агентами. Сполуки, описані в даному документі, можуть застосовуватися у комбінації з одним або більше додатковим лікарським препаратом, наприклад, антигіперпроліферативним (або протираковим) агентом, який впливає на інший цільовий білок. Друга сполука з комбінованою фармацевтичною формулою або режимом дозування, як правило, має взаємодоповнюючу активність по відношенню до сполуки, описаної в даному документі, таким чином, що складові частини другої сполуки не спривляють негативного впливу одна на іншу. Такі молекули присутні у належній комбінації в кількостях, що ефективні для використання за призначенням. Сполуки можуть вводитися разом в єдиній фармацевтичній композиції або окремо. Введення окремо може відбуватися одночасно або послідовно в будь-якому порядку. Часові інтервали при послідовному введенні можуть бути короткими або тривалими. [0084] У деяких варіантах реалізації винаходу Г-СКФ вводять у комбінації з ARRY-520. [0085] У деяких варіантах реалізації винаходу дексаметазон вводять у комбінації з ARRY520. У деяких варіантах реалізації винаходу Г-СКФ вводять у комбінації з ARRY-520 і дексаметазоном. [0086] У деяких варіантах реалізації винаходу бортезоміб вводять у комбінації з ARRY-520. У деяких варіантах реалізації винаходу Г-СКФ вводять у комбінації з ARRY-520 і бортезомібом. [0087] У деяких варіантах реалізації винаходу карфілзоміб вводять у комбінації з ARRY-520. У деяких варіантах реалізації винаходу Г-СКФ вводять у комбінації з ARRY-520 і карфілзомібом. [0088] У деяких варіантах реалізації винаходу помалідомід вводять у комбінації з ARRY-520. У деяких варіантах варіантах реалізації винаходу Г-СКФ вводять у комбінації з ARRY-520 і помалідомідом. ПРИКЛАДИ [0089] Наступні Приклади наведені для ознайомлення. Потрібно розуміти, що ці Приклади не обмежують винахід і наведені виключно з метою пропозиції способу практичного застосування винаходу. [0090] В описаних нижче Прикладах, якщо не вказано інше, всі температурні значення наведені в градусах Цельсія. Реактиви були придбані у комерційних постачальників і використовувалися без додаткового очищення, якщо не вказано інше. Приклад 1 Методологія зв'язування ARRY-520 TRANSIL® [0091] Методологія зв'язування TRANSIL® (www.admecell.com) - Аналіз буферів: фосфатносольовий буфер («ФСБ»), рН 7,4 (Gibco 10010) і диметилсульфоксид («ДМСО»). Планшети: замовлення від ADMEcell (Аламеда, Каліфорнія). AGP – суцільний планшет: TBP-0211-0096; AGP – смуговий планшет: TBP-0211-1196; HSA – суцільний планшет: TBP-0210-0096; HSA – смуговий планшет: ТBP-0210-1196. Стоп-розчин: 100% ацетонітрил з додаванням внутрішнього стандарту (кінцева концентрація – 0,4 мкмоль). 7 UA 113017 C2 5 10 15 20 [0092] Розведення лікарського засобу: Розведення зразків лікарського засобу для досягнення кінцевої концентрації лікарського засобу 2 мкмоль (1% ДМСО) (використовується 360 мкл кінцевого розведеного лікарського засобу на тестування білка, тобто 720 мкл на AКГ і ЛСА). Вносили лікарський засіб в маточний розчин (10 ммоль) в ДМСО. Розводили маточний розчин (10 ммоль) до 200 мкМ (0,2 ммоль) (шляхом додавання 4 мкл маточного розчину (10 ммоль) в 196 мкл ДМСО). Розводили 200 мкМ маточного розчину до 20 мкМ (шляхом додавання 100 мкл 200 мкМ розчину ДМСО в 900 мкл ФСБ, рН 7,4). [0093] Розморожували аналітичний набір за кімнатної температури (приблизно 3 години) або в холодильнику за 4 °C протягом ночі. Планшети поміщали в інкубатор, СО 2 (5%) на 30 хвилин перед додаванням сполуки. Попередньо розбавляли сполуку (10-кратна концентрація для аналізу) (див. Розведення лікарського засобу вище). Розведений лікарський розчин нагрівали на водяній бані за 37ºC перед дозуванням сполуки. Увага! Ретельно проводьте попереднє розведення для будь-якого осаду і забезпечуйте достатню розчинність буфера і стабільність вашого тестового зразка. Розчин тестового зразка (45 мкл) додавали в пробірки/лунки готового набору та інкубували протягом 2 хвилин. Змішували десять разів, ресуспендуючи кульки. Ресуспендували приблизно половину загального об’єму флакона (загальний об’єм 450 мкл). Орбітальні шейкери не використовували. Флакони поміщали в поворотно-відкидну центрифугу на 10 хвилин при 750 г. 100 мкл обережно переносили в 96-лунковий планшет. Ацетонітрил (50 мкл) додавали в лабеталол в якості внутрішнього стандарту (кінцева концентрація 0,4 мкмоль). Планшети герметизували для аналізу. Концентрацію надосадової рідини кількісно оцінювали за допомогою рідинної хроматографії з мас-спектрометрією (РХ/МС) (API4000). Див. також: Brown, KarinD. supra. Результат в Таблиці 1 оцінювався за допомогою програмного забезпечення ACD/pKaDB. Розрахунки: общ корр своб белок своб общ своб корр белок TАБЛИЦЯ 1 Сполука Стан іонізації (pKa) ARRY520 базовий (9,7) Kd (мкM) – AVG AКГ ЧСА % Fu до плазми людини 7 5 147 Переваги кратності AКГ проти ЛСА 29 25 30 35 40 Приклад 2 Триденний аналіз виживаності клітин (NCIH929 MM) [0094] Аналіз проліферації клітин синього титру: ефект AКГ на цитотоксичну активність ARRY-520 в ММ лініях. [0095] Реактиви: RPMI-8226, H929, RPMI 1640 середовище, 10% ФСБ, GlutaMAX. [0096] Набір: Аналіз життєздатності клітин синього титру, PromegaCorp. (Медісон Вісконсін), № G8081 по каталогу. [0097] Склад: Маточний розчин (10 ммоль) ARRY-520 в ДМСО. 250 мг AКГ з людської плазми закуплено у Sigma-AldrichCo. LLC (St. Louis, MO) № G9885 по каталогу. Додавали 6,2 мл ФСБ → 40 мг/мл маточний розчин. Зберігали за 4 °C. [0098] Процедура: Розведення ARRY-520 в 96-лунковий планшет з V-подібним дном: Поміщали 10 мкл ДМСО в лунки B2-B11. Додавали 10 мкл 100 мкмоль ARRY-520 в лунку B2 і примушували піпетуванням вгору-вниз. З новим наконечником піпетки, переносили 10 мкл з лунки B2 в лунку B3 і змішували піпетуванням вгору-вниз. 8 UA 113017 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Повторювали процедуру до В10, потім відбраковували 10 мкл з B10. Лунка B11 була контрольною лункою ДМСО. Лунки В2-В10 тепер мають 10 мкл 1:2 кратних серійних розведень ARRY-520 (50 мкмоль до 200 нмоль). Додавали 190 мкл середовища росту в кожну лунку (1:20 розведення, 5% ДМСО) Планшет накривали кришкою і клали на бік. Готували розчини AКГ: 30 мг/мл: 150 мкл 40 мг/мл + 50 мкл ФСБ 20 мг/мл: 100 мкл 40 мг/мл + 100 мкл ФСБ 10 мг/мл: 100 мкл 40 мг/мл + 300 мкл ФСБ 5 мг/мл: 100 мкл 10 мг/мл + 100 мкл ФСБ Підраховували клітини ММ. 6 Поміщали 1,2 х 10 клітин в 8 мл поживного середовища і обережно перемішували для утворення клітинної суспензії (143 клітин/мкл). Додавали 10 мкл (1/10 об’єму) розведеної сполуки (див. вище) до двох 96-лункових планшетів для тканинних культур (з чорними стінками і прозорим дном) (Sigma-Aldrich, № CLS3904 по каталогу), як показано нижче. Переконувалися, що на дні кожного планшета міститься 10 мкл речовини. Розміщували 10 мкл розведення ARRY-520 з лунок B2-B11 планшета з V-подібним дном до до рядуів B-G 2-х однакових 96-лункових планшетів з чорними стінками. Додавали 80 мкл клітинної суспензії - 150 клітин/мкл (всього 12000 клітин/на лунку) до 2-11 стовпцідо рядуів B-G: Планшет 1 - RPMI 8226 і планшет 2 - NCIH929. Додавання AКГ: Додавали 10 мкл ФСБ до ряду В кожного планшета Додавали 10 мкл розчину AКГ 40 мг/мл до ряду C кожного планшета (4 мг/мл f.c.) Додавали 10 мкл розчину AКГ 30 мг/мл до ряду D кожного планшета (3 мг/мл f.c.) Додавали 10 мкл розчину AКГ 20 мг / мл до ряду E кожного планшета (2 мг/мл f.c.) Додавали 10 мкл розчину AКГ 10 мг / млдо ряду F кожного планшета (1 мг/мл f.c.) Додавали 10 мкл розчину AКГ 5 мг / мл до ряду G кожного планшета (0,5 мг/мл f.c.) Додавали 100 мкл середовища в інші зовнішні лунки планшетів Клітини висівали зі сполукою у кінцевому об’ємі 100 мкл, планшети поміщали в інкубатор за 37 °C (5% або 0% CO2) і аналізували через 24, 48 і 72 години: 20 мкл реактиву проліферації клітин синього титру додавали в кожну з лунок, змішували з допомогою планшетного шейкера протягом 10 секунд, і поміщали назад в інкубатор на 2-4 години. Після цього зчитували флуоресценцію на Gemini (зчитувальний пристрій флуоресценції, Spectramax, Molecular Devices) в Ex/Em 560/590 нм, з обмежуючим фільтром 590 нм. Отримана відносна одиниця флуоресценції (ВОФ) (флуоресцентний сигнал мінус фон) експортувалася в Excel і використовувалася для аналізу відповіді на дози з XLFit4 в емпіричному рівнянні з 4 параметрами: Fit = (+ ((BA) / (1 + ((C / X) ^ D)))). [0099] Результати: Підвищення рівня AКГ знижує чутливість клітин до ARRY-520 в обох клітинних лініях. Клітинна чутливість до ARRY-520 зменшується більше, ніж у 30 разів, при збільшенні АКГ в аналізі. Це узгоджується зі зниженим незв'язаним ARRY-520 при підвищенні [AКГ]. Див. Фігуру 1 результатів NCIH929. Приклад 3 Дослідження ARRY-520 у пацієнтів з пізніми стадіями раку [00100] Дослідження 1 фази ARRY-520. Див. clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00462358; та Goncalves P., et al., “A Phase 1 Safety and Pharmacokinetic Study of ARRY-520 in Solid Tumors”, 2010 American Society of Clinical Oncology Annual Meeting, Abstract # 2570, www.arraybiopharma.com/_documents/Publication/PubAttachment387.pdf, зміст якого включено в повній мірі в даний опис за допомогою посилання . Приклад 4 Дослідження ARRY-520 у пацієнтів з важким мієлоїдним лейкозом [00101] Дослідження 2 фази ARRY-520 в якості монотерапії. Див. Clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00637052; Garcia-Manero, Guillermo et al., "A Phase 1 DoseEscalation Study of the Novel KSP Inhibitor ARRY-520 in Advanced Leukemias", 2009 51st American Society of Hematology Annual Meeting and Exposition, Abstract # 22799, www.arraybiopharma.com /_documents/Publication/PubAttachment368.pdf; і Estrov, Z., et al., "A Phase 1 Dose-Escalation Study of the Novel KSP Inhibitor ARRY-520 in Advanced Leukemias", 2009 American Society of 9 UA 113017 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Clinical Oncology Annual Meeting, www.arraybiopharma.com/_documents/Publication/ PubAttachment347.pdf, зміст яких включено в повній мірі в даний опис за допомогою посилання. Приклад 5 Дослідження ARRY-520 у пацієнтів з рецидивуючою або резистентною множинною мієломою [00102] Дослідження 1/2 фази ARRY-520 і дексаметазону. Див. Clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00821249; Shah, J.J., et al., "A Phase 1/2 Trial of the KSP Inhibitor ARRY-520 in Relapsed / Refractory Multiple Myeloma", 2010 American Society of Hematology Meeting, Publication Number 1959, www.arraybiopharma.com/_documents/Publication /PubAttachment428.pdf; Shah, JJ, et al, "ARRY-520 Shows Durable Responses in Patients with Relapsed / Refractory Multiple Myeloma in a Phase 1 Dose-Escalation Study", 2011 American Society of Hematology Annual Meeting, www.arraybiopharma.com/_documents/Publication/ PubAttachment493.pdf; Lonial, S., et al., "The Novel KSP Inhibitor ARRY-520 Demonstrates SingleAgent Activity in Refractory Myeloma: Results From a Phase 2 Trial in Patients with Relapsed / Refractory Multiple Myeloma", 2011 American Society of Hematology Annual Meeting, Abstract # 2935, www.arraybiopharma.com/_documents/Publication/PubAttachment563.pdf; Shah, J.J., et al., "The Novel KSP Inhibitor ARRY-520 Is Active Both with and without Low-Dose Dexamethasone in Patients with Multiple Myeloma Refractory to Bortezomib and Lenalidomide: Results From a Phase 2 Study ", 2012 American Society of Hematology Meeting, www.arraybiopharma.com/_documents/Publication/PubAttachment556.pdf; Lonial, S., et al.," The Novel KSP Inhibitor ARRY-520 Demonstrates Single-Agent Activity in Refractory Myeloma: Results From a Phase 2 Trial in Patients with Relapsed / Refractory Multiple Myeloma ", 2011 American Society of Hematology Annual Meeting, Abstract 2935, www.arraybiopharma.com/_documents/Publication /PubAttachment563.pdf; і Lonial, Sagar, et al., "Single-Agent Activity of the Novel KSP Inhibitor ARRY-520 in Patients with Relapsed or Refractory Multiple Myeloma (RRMM): Results from Subgroup Analyses." 2013 InternationalMyelomaWorkshop, Poster # P-224, www .arraybiopharma.com / _documents / Publication / PubAttachment563.pdf, зміст яких включено в повній мірі в даний опис за допомогою посилання. Приклад 6 Моделювання ФК [00103] Моделювання ФК для людини («попФК») засновано на плазмових концентраціях ARRY-520 пацієнтів у Прикладах з 3 по 5. Оптимізація моделі була виконана з використанням системи QRPEMPhoenix 6.3 (PharsightCorporation, Сент-Луїс, штат Міссурі). Вибір моделі був заснований на порівнянні AIC і діагностичних графіків. Імітаційне моделювання проводилося 2 для типового пацієнта, який отримував у 2-й фазі дозу 1,5 мг/м в день 1-й і 2-й день зі змінною [AКГ]. Див. Фігуру 2. При [АКГ] більше, ніж 1,1 г /л стійка експозиція вище, ніж IC50 незв'язаного ARRY-520, розрахована за результатами тестування in vitro, не передбачається. [00104] Прогнозоване інгібування БВК не було стійким при підвищенні AКГ. Тривале інгібування БВК (більше 24 годин вище, ніж IC50 незв'язаного ARRY-520, що складає 0,2 нг/мл) може бути необхідним для клінічної ефективності. Вільна концентрація ARRY-520/час була змодельована в порівнянні з [AКГ] на основі моделі «попФК» (n=50 пацієнтів на рівень АКГ). Був розрахований прогнозований загальний час концентрації вільного ARRY-520 більше, ніж 0,2 нг/мл. Див. Фігуру 3. Приклад 7 Аналіз АКГ [00105] Імуноферментний аналіз людського α1-кислотного глікопротеїну R&DSystems, Inc. (Міннеаполіс, Міннесота) Quantikine® імуноферментний аналіз людського α1-кислого глікопротеїну (№ DAGP00 по каталогу) є 4,5-годинним твердофазним ІФА, який призначений для вимірювання AКГ людини в клітинних культурах супернатантах, сироватці, плазмі та сечі. У цьому аналізі використовується кількісний багатошаровий імуноферментний метод. На мікропланшет попередньо нанесено моноклональне антитіло, специфічне для AКГ. Стандарти та зразки переносилися піпеткою в лунки, і за наявності AКГ, останній зв'язувався імобілізованим антитілом. Після вимивання якої-небудь незв'язаної субстанції, ферментпов'язані поліклональні антитіла, специфічні для AКГ, додавали в лунки. Після промивання для видалення будь-яких незв'язаних речовин, в лунки додавали розчин субстрата. Пропорційно кількості зв'язаного AКГ на початковому етапі проявлявся колір. Коли формування кольору призупинялося, вимірювалася його інтенсивність. Аналіз проводили згідно інформації вкладиша в упаковці, за винятком випадків, коли нижче вказано інше. [00106] Матеріали, які надаються R&D Systems, Inc. Quantikine® Імуноферментний аналіз AКГ для людини (№ DAGP00 по каталогу), включають: 10 UA 113017 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 AКГ мікропланшет (партія 893786) – 96-лунковий мікропланшет з полістиролу (12 смужок по 8 лунок), покритий мишачим моноклональним антитілом проти AКГ. AКГ кон'югат (партія 893787) – 21 мл поліклонального антитіла проти AКГ, кон'юговані з пероксидазою хрону з консервантами. AКГ стандарт (партія 893788) – 3 флакони (400 нг/флакон) людського AКГ в буфері з консервантами; ліофілізований. Розріджувач для аналізу RD1-73 (партія 895541) – 12,5 мл буфера з консервантами. Концентрат калібрувального розріджувача RD5-20 (партія 89346) – 2 флакони (21 мл/флакон) буферного сурфактатнта з консервантами. Концентрат промивного буфера (партія 895003) – 21 мл 25-кратного концентрованого розчину буферного сурфактанта з консервантами. Реактив кольору А (партія 895000) – 12,5 мл стабілізованого перекису водню. Реактив кольору В (партія 895001) – 12,5 мл стабілізованого хромогену (тетраметилбензидину). Стоп-розчин (партія 895032) – 6 мл 2N сірчаної кислоти. Покриття планшета – 4 адгезивні смуги. [00107] Інші матеріали, необхідні для R&D Systems, Inc. Quantikine® Імуноферментний аналіз AКГ для людини (№ DAGP00 по каталогу), включають: Зчитувальний пристрій для мікропланшетів, здатний вимірювати оптичну щільність при довжині хвилі 450 нм, з набором корекції довжини хвилі при 540 нм або 570 нм. Піпетки і наконечники для піпеток. Деіонізована або дистильована вода. Розпилювач, різнобічний диспенсер, або автоматичний омивач мікропланшетів. Мірний циліндр на 500 мл. Інкубатор 2-8 °C. Пробірки для розведення стандартів і зразків. [00108] Відбір проб і зберігання: Сироватка – Використовували пробірку для відділення сироватки (ПВС) і залишали зразки для утворення згустку на 30 хвилин перед центрифугуванням (протягом 15 хвилин при 1000 х г). Видаляли сироватку і негайно проводили аналіз або аліквотувалиі і зберігали зразки за ≤ -20 °C. Уникали повторних циклів заморожування-відтавання. Плазма – Збирали плазму з використанням ЕДТА або гепарину в якості антикоагулянта. Протягом 30 хвилин після збору центрифугували 15 хвилин при 1000 х г. Негайно проводили аналіз або аліквотували і зберігали зразки за ≤-20 °C. Уникали повторних циклів заморожування-відтавання. Примітка: цитратна плазма не може використовуватися в цьому аналізі. [00109] Приготування зразка. Необхідно 10000-кратне розведення зразків сироватки та плазми. Пропоноване 10000-кратне розведення може бути здійснено шляхом додавання 10 мкл зразка до 990 мкл калібрувального розріджувача RD5-20 (1x). Завершували 10000-кратне розведення додаванням 10 мкл розведеного зразка до 990 мкл калібрувального розріджувача RD5-20 (1x). [00110] Приготування реактивів (всі реактиви довести до кімнатної температури перед використанням). Промивний буфер – Якщо в концентраті утворювалися кристали, його нагрівали до кімнатної температури і обережно перемішували, поки кристали повністю не розчинялися. Для приготування 500 мл промивного буфера 20 мл буферного концентрату для промивки розводили в деіонізованій або дистильованій воді. Калібрувальний розріджувач RD5-20 (1X) – Додавали 20 мл концентрату калібрувального розріджувача RD5-20 до 80 мл деіонізованої або дистильованої води, щоб приготувати 100 мл калібрувального розріджувача RD5-20 (1x). Розчин субстрату – Реактиви кольору А і B повинні бути змішані в рівних пропорціях не раніше, ніж за 15 хвилин до використання. Захищати від світла. На лунку потрібно 200 мкл отриманої суміші. AКГ Стандарт – Відновлювали AКГ Стандарт за допомогою 0,5 мл калібрувального розріджувача RD5-20 (1x). Це відновлення призводить до утворення маточного розчину 800 нг/мл. Змішувалистандарт для забезпечення повного розчинення і залишали протягом як мінімум 15 хвилин при обережному перемішуванні перед тим, як робити розведення. Піпетувати 250 мкл калібрувального розріджувача RD5-20 (1x) в кожну пробірку. Використовували маточний розчин AГК для отримання серій 2-кратного розведення. Ретельно змішували вміст кожної пробірки перед наступним перенесенням. Стандарт 800 нг/мл служив в 11 UA 113017 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 якості високого стандарту, калібрувальний розріджувач RD5-20 (1X) – нульового стандарту (0 нг/мл). [00111] Процедура: Усі реактиви та зразки перед використанням доводилися до кімнатної температури. Було рекомендовано, щоб всі зразки і стандарти аналізувалися, щонайменше, у двох екземплярах. 1. Готували всі реактиви, робочі стандарти та зразки, як описано вище. 2. Прибирали зайві смуги мікропланшетів з рамки, повертали їх в упаковку з фольги, яка містить вологопоглинальний пакет, і закупорювали. 3. У кожну лунку додавали 100 мкл розріджувача RD1-73. 4. Додавали 50 мкл стандарту або зразка в лунку (зразки сироватки та плазми потребують розведення, як описано вище). Накривали за допомогою наданої адгезивной смужки. Інкубували протягом 2 годин за кімнатної температури. Пристрій планшета призначений для запису стандартів і тестованих зразків. 5. Аспірували і промивали кожну лунку, повторюючи процедуру три рази протягом в загальній складності чотирьох промивок. Омивали шляхом заповнення кожної лунки промивальним буфером (400 мкл) за допомогою розпилювача, різнобічного диспенсера або автоматичного омивача. Повністю видаляли рідину на кожному етапі, що мало важливе значення для коректного результату. Після останньої промивки, видаляли залишки промивного буферу шляхом аспірації або зціджування. Перевертали планшет і промокали його чистими паперовими рушниками. 6. Додавали 200 мкл кон'югату AКГ в кожну лунку. Покривали новою адгезивною смужкою. Інкубували протягом 2 годин за кімнатної температури. 7. Повторювали аспірацію/промивання як у пункті 5. 8. Додавали 200 мкл розчину субстрату в кожну лунку. Інкубували протягом 30 хвилин за кімнатної температури. Захищали від світла. 9. Додавали 50 мкл стоп-розчину в кожну лунку. Колір в лунках повинен змінюватися з синього на жовтий. Якщо колір в лунках зелений або зміни кольору не відбувалося, акуратно постукували по планшету, щоб забезпечити ретельне змішування. 10. Визначали оптичну щільність кожної лунки протягом 30 хвилин за допомогою мікропланшетного зчитувального пристрою при 450 нм. Якщо можливо було скоректувати довжину хвилі, встановлювали 540 нм або 570 нм. Якщо корекція не була доступна – віднімали значення, отримані при 540 нм або 570 нм, від значень при 450 нм. Результат коректували з урахуванням оптичних дефектів в планшеті. Значення, отримані безпосередньо на довжині хвилі 450 нм без корекції, можуть бути неточними. [00112] Підрахунок результатів. Усереднювати значення повторів для кожного стандарту, контролю та зразка, і віднімали середнє нульове стандартне значення оптичної щільності. Будували стандартну криву шляхом скорочення даних з використанням програмного забезпечення, здатного генерувати чотири параметри логістичного (4-PL) підбору кривої. В якості альтернативи, будували стандартну криву, відкладаючи середню абсорбцію для кожного стандарту на осі «y» і концентрацію на осі «х» і вибирали найкращу криву через точки на графіку. Ці дані можуть бути лінеаризовані шляхом побудови логу концентрацій AКГ в порівнянні з логом OD Найбільш прийнятна лінія може бути визначена за допомогою регресійного аналізу. Ця процедура здійснюється за допомогою відповідної, але менш точної корекції даних. Якщо зразки були розріджені, концентрація, яка зчитується зі стандартної кривої, повинна бути помножена на коефіцієнт розрідження. [00113] Результати аналізу вихідних рівнів вільного ARRY-520 і [AКГ] еx vivo в зразках плазми пацієнтів (з Прикладу 5) при множинній мієломі показані на Фігурі 4. Зразки плазми пацієнтів з вищим вихідним рівнем [AКГ] корелювали з більш низькою концентрацією ARRY-520. Підвищений рівень [AКГ] прогнозує відсутність відповіді і зменшення часу на лікування, як показано на Фігурі 5. Більшість пацієнтів з «високим» вихідним рівнем [AКГ] (більше ніж 1,1 г/л) виключені з дослідження менш ніж за 5 місяців. Рівень [AКГ] всіх пацієнтів, які досягли клінічної відповіді (мінімальний відповідь («MВ») або часткова відповідь («ЧВ»), був нижче 1,1 г/л при скринінгу. Ризик припинення участі в дослідженні збільшувався в 2,5 рази з кожним збільшенням [AКГ] на 1,0 г/л (р