Спосіб одержання сульфатів пептиділ-аргінінальдегідів

Изобретение к а с а е т с я п р о и з в о д ных п е п т и д о в , в ч а с т н о с т и получения сульфатов пептидил-аргининальдегида (СП). Цель - создание новых активных веществ пептидной природы с селективным торможением свертывания к р о в и . Синтез СП обшей ф-лы: R^R^" -DPhe-Pro-A-H - H , S 0 o где R, - Н; R 2 - С ! М - а л к и л ; R t и R 2 присоединены к NH 2 -группе D-фєнилаланина; А о с т а т о к L-аргинина, ведут к о н д е н с а цией аргинин-лактама с защищенной гуанидиновой группой и защищенного по концевой аминогруппе дипептида N-моноалкил (С1 4 ) - Ь - п р о л и н а . Полученный трипептидлактам в о с с т а н а в л и вают до альдегида и после отщепления защитных групп выделяют ц е л е вой продукт в виде сульфатной с о л и . Выход, %: R f ; !V] D°; б р у т т о - ф - л а : а) 7 5 ; 0 , 3 9 - 0 , 4 7 ; ( - 1 3 1 ) ° ; С H } p , N £ «7/8 (H^S0 4 ) • 2 , 5 ( Н 5 О ) ; б) 7 0 ; 0 , 4 0 , 5 ; н е т ; С 2 2 Н 3 Р ^ ' 5/6(H ? SO 4 ) * * 3 , 5 ( H 5 O ) ; в) 80; 0,64; н е т ; C y y ^ I V H . S O , 4 ( H 2 O ) ; д) 6 7 ; 0 , 8 5 0 , 7 ; н е т . Новые СП проявляют антитромбиновую активность (в сравнении с контролем в пять р а з у в е л и ч и в а е т ся время с в е р т ы в а н и я ) , оказывают влияние на плазминфибриновую р е а к цию, стабильны во времени, а их минимально активная доза 1-2 м г / к г . 3 табл. 00 00 СО !f 1 1384 203 было обнаружить перетекание основаИзобретение относится к способу ния. Ссупензию прибавляют к указанполучения сульфатов пелтидил-апьденому ниже смешанному ангидриду. гидов - новых биологически активных 50,9 г (0,1 моль) циклогексиламсоединений, которые могут найти монийной соли N-бензилоксикарбонилприменение в медицине. -Ы-метил-О-фенилаланин-Ь-пролина Цель изобретения - создание норастворяют в 200 мл диэтилового эфивых соединений пептидной природы, ра и 120 мл 1 н . раствора серной обладающих селективным торможением свертывания крови, но более с т а 10 кислоты. Фазу диэтчлового эфира три раза промывают водой, применяя кажбильных и не проявляющих склонности дый раз по 30 мл последней, сушат к необратимой циклизации. над безводным сернокислым натрием, а Rp-значения определяют с помощью затем упаривают на водяной бане при хроматографии в тонком слое на сили40°С и давлении 25-30 мбар. Полученкагеле (KieselgeL G " Р е а н а л " , Буда- 15 ный остаток и 11,2 мл (0,1 моль) пешт) при применении в качестве элюN-метилморфолина растворяют в 70 мл ирующего средства смеси растворитедиметилформамида, раствор охлаждалей. Этиловый эфир уксусной кислоты, ют до -15 С, после чего при указанпиридин, уксусная кислота и вода ной температуре смешивают с 13,2 мл при соотношениях ( 9 6 0 : 2 0 : 6 : 1 1 ) ; 20 (0,1 моль) изобутилоксикарбонилхло( 4 8 0 : 2 0 : 6 : 1 1 ) ; ( 2 4 0 : 2 0 : 6 : 1 1 ) ; (120: рида. Затем (через 3-5 мин) смесь :20:6:11); (60:20:6:11); (30:20:6: . дополнительно перемешивают в т е ч е :Ю. ' . ние 5 мин, после чего к полученному П р и м е р 1, Сульфат N-метил25 смешанному альдегиду прибавляют ука-1)-фенилаланин-1»-пролил-Ь-аргининзанную суспензию в диметилформамиальдегида. д е . Реакционную смесь перемешивают Стадия 1. N-Бензилоксикарбонилв течение 1 ч при -15°С и в т е ч е -Ы-метил-В-фенилаланин-Ь-пролил^ ние 1 ч при 0°С, затем смесь р а з б а в -бензилоксикарбонил-Ь-аргинин-лакляют прибавлением 200 мл бензола, 30 там. после чего выделивашийся в осадок 42,95 г (0,11 моль) N-трет-бутикристаллический продукт отфильтролоксикарбонил-N -бензилоксикарбовывают . нил-Ь-аргинин-лактама суспендируют Раствор продукта в бензоле и див 110 мл безводного хлороформа, посметилформамиде разбавляют прибавлеле чего суспензию при перемешивании 35 нием 150 мл воды, после чего произсмешивают с 275 мл раствора хлористоводят разделение ф а з . Нижнюю, содерго водорода в этиловом эфире уксусжащую воду,- диметилформамидную фазу ной кислоты (концентрация 0 , 1 1 три раза экстрагируют бензолом, при0,15 г / м л ) . После перемешивания в меняя каждый раз по 50 мл последнетечение 3 ч реакционную смесь р а з 40 г о . Объединенные бензольные растворы бавляют прибавлением 400 мл диэтитри р а з а промывают водой, применяя лового эфира, выделившуюся в осадок каждый раз по 30 мл последней, сукристаллическую массу отфильтровывашат над безводным сернокислым натриют, два раза промывают осадок диэтиловым эфиром, применяя каждый раз по 45 ем, а затем упаривают на водяной бане при температуре, составляющей 100 мл последнего, а затем промывамаксимум 40°С, и давлении 20-25 мбар, ют два раза ацетоном , применяя кажПолученный маслообразный остаток дый раз по 50 мл последнего. Затем растворяют в 60 мл смеси, состоящей продукт сушат в вакуумном эксикатоиз бензола и тетрагидрофурана ( 8 : 2 ) , ре над пятиокисью фосфора и гидро50 после чего раствор хроматографируокисью калия. После сушки приблизиют на колонке, заполненной 750 г тельно в течение 1 ч соединение растсиликагеля-60, при применении в к а воряют в 100 мл диметилформамида, честве элюирующего средства той же приготовленный раствор охлаждают до самой смеси растворителей. Фракции -15°С, после чего при указанной тем55 анализируют с помощью хроматографии пературе и при перемешивании прибав-, в тонком слое на силикателе при приляют в раствору сначала 20 мл, а менении в качестве элюирующего средзатем 10-15 мл триэтиламина таким ства смеси растворителей, состоящей образом, чтобы в газовой фазе нельзя 1384203 держащий воду, тетрагидрофурановыи из этилового -эфира уксусной кислоты, раствор два раза экстрагируют при пиридина, уксусной кислоты и воды применении 250 мл метиленклори4 8 0 : 2 0 : 6 : 1 1 . Целевой продукт имеет да, объединенные метиленхлоридные Rp-значение 0 , 7 0 - 0 , 7 6 . Фракции, в экстракты последовательно промывают которых содержится чистый основной два раза водой, применяя каждый раз продукт, объединяют и упаривают на по 50 мл последней, два раза 5%-ным водяной бане при температуре, с о с раствором кислого углекислого наттавляющей максимум 40 С, и давлении - п рия, применяя каждый раз по 60 мл 20-25 мбар до объема 100 мл. Полуэтого раствора, и вновь два раза воченный концентрат смешивают с 500 мл дой, применяя каждый раз по 50 мл петролейного эфира. Образовавшуюся последней t сушат над безводным серносуспензию фильтруют, остаток на кислым натрием, а затем упаривают фильтре два раза промывают петролей,j- на водяной бане при температуре, ным эфиром, применяя каждый раз по составляющей максимум 40°С, и давле100 мл последнего, и затем сушат в нии 20-25 мбар до объема 50-60 мл. вакуум-эксикаторе над серной кисОстаток смешивают со 100 мл бензолотой и парафиновыми стружками. 2 л а , а затем упаривают описанным Выход 45 г (65%). (УЗ D° = +13,5 (с = 1, тетрагидрофуран). К f = 0 , 7 0 - 20 способом. Полученный остаток разбавляют прибавлением 100 мл циклогекса0,76/ на, образовавшийся осадок отфильтроВычислено, %: С 6 5 , 0 8 ; Н 6,20; вывают, промывают два раза циклогекN 12,31. саном, применяя каждый раз по 30 мл C37H4,O7N6 (682,75) 25 .последнего, а затем сушат в вакуум"Найдено, %: С 6 5 , 4 ; Н 6 , 4 ; эксикаторе над парафиновыми стружN 12,1. ками. Стадия 2. N-БензилоксикарбонилВыход 27 г (70%) продукта, кото-Ы-метил-В-фенилаланин-Ь-пролил-Ы рый в соответствии с данными э л е -бензилоксикарбонил-Ь-аргининальде• ментиого анализа, содержит 1 моль 3 Q гид.циклогексана, R^ = 0 , 5 2 - 0 , 6 2 . 34,15 г (0,05 моль) N-бечзилокси[7п°= -29,9° (с - 1, 0,1 н . раствор гидроокиси натрия). Вычислено, %: С 6 7 , 7 9 ; Н 8 , 7 5 ; N 6,08. C t l H r ,O s N4/2 040) (230,30) 10 15 20 25 Найдено, %: С 6 7 , 2 ; Н 8 , 9 ; N 6,15. Стадия В. N-Бензилоксикарбонил-Ы-изобутил-Б-фенилаланин. 30 3,32 г (0,015 моль) N-изобутил-D-фенилаланина (пример 3, стадия А) вводят во взаимодействие аналогично примеру 2, стадия В. Выход 3,2 г (60%) маслообразного 35 продукта. R F = 0,6-0,7. Стадия С. N-Бензилоксикарбонил-Ы-изобутил-В-фенилаланин-Ь-пролин. 2,85 г (0,008 моль) N-бензилоксикарбонил-К-изобутил~В-фенилаланина 40 (пример 3, стадия В) вводят во взаимодействие аналогично примеру 2, стадия С , Выход 2,45 г (67%) маслообразного продукта, Ир = 0,65-0,70. 45 Проводят биологические испытания производных пептидил-аргининальдегидов, полученных в условиях предлагаемого способа. При проведении специальных иссле50 дований пептиды растворяют в воде (рН 6,0) в концентрациях 10 мг/см , после чего растворы хранят при 40 °С. В течение 5 дн, наблюдают за изменением антитромбиновой активности 55 растворенного вещества. Характеризующее активность значение определяют в системе, которая состояла из следующих составных частей, см : і 0,5%-ный фибриноген крупного рогатого скота в 0,9%-ном растворе поваренной соли 0,2; буферный раствор, содержащий трис-(оксиметил)~аминометан и хлористый водород (значение рН 7,2), который также содержит раствор исследуемого пептида, 0,3; 5 ед./см5 раствора US Standard Human Thrombin (NIH, Бетезда, Мэриленд, США), 0,1. Время свертывания этой системы без добавки пептида составляло в приборе Schnither Gross Coagulotnefer 15 с. Начальную тормозящую свертывание крови активность отдельных сульфатов трипептид-альдегидов обозначают такой молярной концентрацией, которая в сравнении с контрольным опытом вызывает пятикратное удлинение времени свертывания (1.0-значение) , Измеренные на первые, третьи и пятые сутки антитромбиновой активности отдельных пептидов в водном растворе при рН 6,0 и 40°С от начальной активности (нулевые сутки) и приведены в табл. 1. В течение периода наблюдения начальная активность сульфата D-фенилаланин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида уменьшается в два раза, в то время как N-метильное производное сохраняет свою первоначальную активность, а активность N-этильного и N-изобутильного соединений уменьшается лишь на 15-20%. В условиях проведения опытов следует считаться с частичной рецемизацией находящегося на конце молекулы L-аргининальдегида. Именно этим может быть объяснено незначительное падение активности N-этильного или N-изобутильного про-^ иэводного. Действие N-алкилтрипептидальдегидов на плазминфибриновую реакцию также исследуют и определяют на примере сульфата N-мeтил-D-фєнилaлaнин-І.-пролил-Ї4-аргининальдегида в і 5 следующей системе, см : 0,05%-ный фибриноген крупного рогатого скота в 0,9%-ном растворе поваренной соли ,0,2; содержащего трис-(оксиметил)аминометан и хлористый водород буферного раствора (значение рН 7,2) который также содержит исследуемый пептид 0,1; раствор US Standard Human Thrombin (NIH) Бетезда, Мэриленд, США/ 10 ед./см3 0,1; 0,1 ед. 17 8 1384203 плазмина в 0,1 мл буферного раствора (КАВІ, Стокгольм, Швеция). Время свертывания образовавшегося в системе фибринозного геля без добавления пептида 10 мин. В качестве контрольного соединения применяют сульфат D-фенилаланин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида, а также гемнсульфат трет-бутилокси— карбонил-П-фенилаланин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида. Действие трипептидальдегидов на плазминфибриновую реакцию показано в табл. 2 (время растворения фибринозных сгустков без добавления пептида 10 мин). Из приведенных в табл. 2 данных видно, что N-алкилированный трипептидальдегид ведет себя как известный, содержащий свободную расположенную на конце аминогруппу. При малых количествах образовавшиеся сгустки растворяются в течение контрольного времениs при больших количествах сгустки либо вообще не образуются, либо образуются со слабой гелевой структурой. Одновременно гемисульфат ацилтрипептидальдегида в зависимости от концентрации удлиняет время гидролиза плазмина фибринозных сгустков. Из описанных исследований следует, что новые трипептидальдегиды с алкилировэнными концевыми аминогруппами обладают значительно большей [стабильностью, чем известный сульфат О-фенилаланин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида9 но одновременно они представляют собой аналогичные селективные замедлители свертывания, поскольку они не оказывают влияния на плазминфибриновую реакцию. Новые N-алкилтрипептидальдегиды предлагаемой формулы обладают in vivo значительной тормозящей свертывание крови активностью. При проведении исследований паптиды вводят внутрь через рот или внутривенно новозеландским зайцам (вес 2-3 к г ) , причем пептиды вводят в физиологическом растворе соли. При внутривенном введении, в течение 3 ч вливания с дозами 0,5-2,0 мг/кг/ч введения производят со скоростью 6 мл/ч Через рот вводят внутрь 20-30 мг/кг пептида, растворенного в объеме 2 мл. После введения с интервалами в 30 мин из каудальной вены отбира 10 20 30 35 ли ют пробы крови, после чего в тромбоэластографе определяют время свертывания всей крови, одновременно также измеряют время ллазма-тромбиновон реакции. Тормозящее свертывание в живом организме действие N-алкилтрипептидальдегидов в опытах на самцах новозеландского зайца показано в табл, 3. ' Приведенные в табл. 3 данные показывают, что N-алкилтрипептидальдегиды обладают равной или близкой активностью по сравнению с веществом, примененным для сравнения. На основании исследований по внутривенному вливанию, осуществленных на зайцах, установлена доза для человека при внутривенном введении, составляющая 3-2 мг/кг/ч. Проведенные испытания показывают, что N-алкильные (С1 -С 4 )~производные сульфатов пептидилальдегидов в течение периода наблюдения не" значительно теряют свою первоначальную активность (N-этильные и N-изобутильные производные теряют активность на 15-20%), в то время как соединение сравнения дезактивируется за этот период на 60%, Кроме того, новые трипептидальдегиды с алкилированными концевыми аминогруппами более стабильны, чем известный сульфат В-фенилаланин-Ьпролил-Ь-аргннипальдегида, но одновременно они представляют собой аналогичные селективные замедлители свертывания, поскольку при эффективном торможении тромбин-фибриногеновой реакции они не оказывают влияния на плазминфибриновую реакцию. Ф о р м у л а 45 и з о б р е т е н и я Способ получения сульфатов пептиднл-аргининальдегидов общей формулы R Не — 50 где R t R2~ 55 водород; С .,-С 4 - а л к и л , причем R 1 и R^ присоединены к аминогруппе D-феншшланина; А - остаток L-аргинина, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что аргинин-лактам с защищенной г у а к и д и новой группой конденсируют с заїди 384203 19 щенным по концевой аминогруппе дипептидом Ы-моноалкил(С1-С4)-Ь-пролином, полученный защищенный трипептидлакгам восстанавпивают до соот 20 ветствующего трипептидальдегида и после отщепления защитной группы целевые продукты выделяют в виде соли. Т а б л и ц Пептидальдегид Начальная Активность, %, через активность, сутки і* /ИМ 0-е сут 1-е 3-й 5-е Сульфат N-метил-О-фенилаланин-L-rtpoлил-Ь-аргининальдегида 0,25 100 100 100 100 Сульфат N-этил-О-фенилаланин-Ь-пролил-L-аргининальдегида 0,21 100 1 00 100 85 80 Сульфат N-изобутил-D-фенилаланин-L-пролил-Ь-аргининальдегида 0,31 100 100 85 Сульфат D-фенилаланин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида (вещество для сравнения) 0,35 100 100 50 Концентрация пептида в реакционной смеси (,кМ), которая в сравнения с контрольным опытом вызывает пятикратное удлинение времени свертывания. Т а б л и ц а Пептидальдегид Содержание Время растворения фибринозных пептида, сгустков, мин (UM г Сульфат Ы-метил-Г-фенилаланин-L—пр олил-L-аргининальдегида 2 0,18 3 10 0,36 0,72 Нет сгустков (It 21 ПРОДОЛ 25 С 4 6 , 0 7 ; Н 7,13; (547,37) (H 2 SO 4 ) • 2,5 (Н->0) Найдено, %: С 4 6 , 4 ; N 15,05; S 5 , 0 . Н 7,2; Исходные вещества получают следующим образом. Ы-Бензилоксикарбонил-Ы-мётил-В- • фенилаланин-Ь-пролин. Стадия А. 2,4,5-Трихлорфениловый эфир бензилоксикарбонил-В-фенилаланина. 60,0 г (0,2 моль) бензилоксикарбонил-Р-фенилаланина и 39,4 г (0,2 моль) 2,4,5-трихлорфенола растворяют в 200 мл тетрагидрофурана, раствор охлаждают до 5-10°С, после чего охлажденный раствор при перемешивании смешивают приблизительно в течение 30 мин с 41,2 г (0,2 моль) дициклогексилкарбодиимида, затем реакционную смесь перемешивают в т е чение 6 ч без охлаждения. Выделившийся в осадок дициклогексилкарбамид отфильтровывают, три раза промывают его тетрагидрофураном, применяя каждый раз по 50 мл последнег о , и объединенные тетрагидрофурановые растворы упаривают в вакууме. Полученный остаток перекристаллизовывают из горячего этилового спирта, кристаллический продукт отфильтровывают, два раза промывают при 5-10°С этиловым стзир гом, применяя каждый 30 35 40 45 50 55 раз по S0 мп по с п елнего, и г\тат R вакуум-эксикаторе. Выход 72 г (75%) , т. пп П 9 141°С.ГоМ;, = +37° (с = 1, днметипформамид). Вычислено, X: С 57,70; Н 3,79; N 2,92; С1 22,22. C ? J H ) S O 4 N C 1 3 (478,75) Найдено, %: С 57,7; Н 3 , 9 ; N 3,0; С1 22,2. Стадия Б. Бензилоксикарбонил-D-фенилаланин-Ь-пролин. 71,8 г (0,15 моль) 2,4,5-трихлорфенилового эфира бензилоксикарбонил-О-фенилаланина (пример 1, стадия А) растворяют при перемешивании и комнатной температуре в 180 мл безводного пиридина, а затем приготовленный раствор смешивают с 17,3 г (0,15 мо"ль) L-пролина и 21,0 мл (0,15 моль)триэтиламчна. Перемешивание продолжают до полного растворения L-пролина» Затем реакционную смесь выдерживают в течение 4-6 ч , непосредственно после этого ее упаривают до объема 80-100 мл на водяной бане при температуре, составляющей максимум 40°С, и давлении І З " 20 мбар, после чего остаток смешивают с 250 мл воды и 90 мл диэтилового эфира. Водную фазу два раза экстрагируют диэтиловым эфиром, применяя каждый раз по 30 мл последнег о , объединенные эфирные растворы два раэа промывают 5%-ным раствором кислого углекислого натрия, применяя каждый раз по 30 мл этого р а с т вора, а затем объединенные водные растворы подкисляют до рН 2 посредством прибавления 3 н. раствора с о ляной кислоты. Выделившееся в о с а док маслообразное вещество три р а з а экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты, применяя каждый раз по 120 мл последнего, объединенные растворы продукта в этиловом эфире уксусной кислоты три раза промывают водой, применяя каждый раз по 40 мп последней, сушат над безводным сернокислым натрием, а затем упаривают на водяной бане до 50-100 мл при температуре, составляющей максимум 40°С, и давлении 15-20 мбар. Полученный остаток перекристаллизовыва~ ют из 200 мл диэтилового эфир-а. Кристаллический продукт отфильтровывают, два раза промывают диэтиловым эфиром, применяя каждый раз по 1384203. 8 растворяют в 600 мл бензола, раствор 40 мл последнего, и сушат на воздусмешивают с 12 мл (0,105 моль) цикхе. логексиламина, после чего смесь выВыход 50,4 г (85%). Т. п л . 132держивают в течение ночи при комнат133°С. Ы ] 200 ~ -46,4° (с = 2 , дименой температуре, Выделившийся в оса-. тилформамид) . R F = 0 , 5 . док кристаллический продукт отфильтВычислено, %: С 66,65; Н 6 , 1 0 ; ровывают, два раза промывают бензоN7,07 . • лом, применяя каждый раз по 200 мл C 2 i H M O f N 2 (396,43) последнего, и затем сушат в вакуумНайдено, %: С 6 6 , 4 ; Н 6 , 2 5 , 10 эксикаторе над парафиновыми стружN 7,2. ками. Стадия С. ЦиклогёксиламмониЙная Выход 38,2 г (75%). к\ = 0 , 5 3 соль Ы-бензилоксикарбонил-Ы-метил0,60 (циклогексиламнн 0,01-0,05). -О-фенилаланин-Ь-пролина. 39,6 г (0,1 моль) бензилоксикар- 15 Т. п л . ' 16О-163°С. ! > ' 7 в ° = + 1 2 , 1 ° ( с = 1., метиловый с п и р т ) . . бонил~1)-фенилаланин-Ь~пролина (приВычислено, %: С 6 8 , 3 4 ; Н 7 , 7 1 ; мер 1, стадия Б) и 50 мл ( 0 , 8 моль) N 8,25. йодистого метила растворяют в 300 мл N2-CtH13N (509,63). ? безводного тетрагидрофурана. ПригоН а й д е н о , %:' С 6 8 , 5 ; Н 7 , 8 ; товленный раствор охлаждают до 0 С, 20 К 8,3. • ' -. . ' . после чего при перемешивании приN -трет-Бутилокснкарбонил-N -бенбавляют к нему порциями і 3 , 2 г зилоксикарбонил-Ь-аргинин-лактам. (0,3 моль) гидрида натрия,. причем Стадия Д. Гидрат N-трет-бутилокколичество порций составляет 8-10, сикарбонил-ї^-бензилоксикарботшл-Ьзатем перемешивание продолжают при 25 аргишша; комнатной температуре в течение 2 ч . 65,8 г (0-,2 моль) гидрата хлорНепосредственно после этого к р е а к гидрата трет-бутилоксикарбонил-L-арционной смеси прибавляют 500 мл э т и гинина растворяют в 100 мл 4 н . лового эфира уксусной кислоты с ц е раствора гидроокиси натрия, приголью .разложения образовавшейся гидроокиси натрия, и дополнительно осто- 30 товленный раствор охлаждают до 510°С, затем при перемешивании его рожно прибавляют еще 10 мл воды для смешивают с 80 мл ( 0 , 5 моль) бензилразложения избыточного количества оксикарбонилхлорида и с ^'150 мл 4 н, гидрида натрия. Затем раствор упарираствора гидроокиси натрия .так, ч т о вают на водяной бане при температуре, 3 5 составляющей максимум 40°С, и давлебы значение рН раствора было выше 12, Непосредственно после этого ре-.' нии 15—20 мбар. Остаток растворяют акционную смесь дополнительно перев 250 мл воды и 100 мл диэтилового мешивают в течение 3-4 ч , затем р а з - . эфира, водную фазу промывают 100 мл бавляют ее прибавлением 150 мл воды, диэтилового эфира, после чего объединенные эфирные растворы промывают 40 после чего производят экстрагирование 100 мл диэтилового эфира» Обра50 мл 5%~ного раствора кислого углезовывалось три фазы. Две нижние фазы кислого натрия. Р.аствор кислого у г еще два раза промывают диэтиловым лекислого натрия и водную фазу объеэфиром, применяя каждый раз по ' ' ' диняют, подкисляют прибавлением 5 н . 45 J00 мл последнего, смешивают" с 300раствора сернокислого калия до рН 2, 400 мл метилового спирта для того, а затем два раза экстрагируют этилочтобы гомогенизировать фазы, после вым эфиром уксусной кислоты, примечего значение рН раствора, если не-, няя каждый р а з по 150 мл последнего. обходимо, доводят до 12 (лрибавле- і Объединенные растворы продукта в этиловом эфире уксусной кислоты по!- 50 ,нием 4 н . раствора гидроокиси нат- . р и я ) , Раствор выдерживают в течение следовательно промывают 100 мл воды, 6-8 ч , а затем его два раза экстра50 мл 10%-ного раствора тиосульфата гируют смесью диэтилового э^нра укнатрия, повторно 100 мл воды, сушат сусной кислоты и петролейного эфиорганическую фазу над безводным с е р нокислым натрием, а затем упаривают 55 ра, взятых в соотношении 1:1,' значение рН прибавлением ледяной уксусна водяной бане при температуре, ной кислоты доводят до 6-7 (приблисоставляющей максимум 40°С, и давлезительно 50 м л ) , три раза производят нии 15-20 мбар. Полученный остаток 384203 экстрагирование хлористым метиленом, применяя каждый раз по 140 мл последнего , Растворы продукта в хлористом метилене объединяют, два раза промывают водой, применяя каждый раз по 60 мл последней, а затем упаривают на водяной бане при 40°С и д а в лении 25-30 мбар. Полученный остаток смешивают с 300 мл бензола и 600 мл воды, смесь в течение 2-3 ч перемешивают при 20° С, затем выдерживают в течение ночи при 10°Св Выделившийся в осадок кристаллический продукт отфильтровывают, промывают последовательно 300 мл воды и 300 мл бенз о л а , после чего сушат в вакуум-эксикаторе над пятнокисью фосфора и .парафиновыми стружками. Выход 60 г (70%). Т. пл. 122124°С. д * -20,7° (с = 1, пиридин) , Вычислено, %: С 5 3 , 5 1 ; Н 7 ? О9; N 13,14. C T g H 2 f i O 6 N,-H^0 (426,46) Найдено, %: С 5 3 , 3 5 ; Н 7 , 2 ; N 13,1. 10 15 20 25 Стадия Е. №~-трет-Бутилоксикарбонил-№^-бензилоксикарбонил-]_,~ аргинин- _ л лактам. 59,7 г (0,14 моль) гидрата N"-трет-бутилоксикарбонил-К^-бензилоксикарбонил~Ь-аргииина (пример 1 s стадия Д) и 19,6 г (0,14 моль) триэтиламина растворяют в 200 мл т е т р а - 35 гидрофурана. Приготовленный раствор охлаждают до -10°С, после чего при указанной температуре и при перемешивании его смешиваю1*1 сначала с 18,5 мл (0,14 моль) изобутилоксикарбонилзшорида, а затем через 10 мин с 19,6 мл (0,14 моль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч при 0°С и еще в течение 1 ч без охлаждения, ^J причем после завершения перемешивания смесь выливают в 1 л ледяной воды. Выделившийся в осадок кристаллический продукт отфильтровывают, два р а з а промывают его недяной в о 50 дой, применяя каждый раз по 100 мл последней, и непосредственно после этого растворяют в 280 мл хлороформа. Хлороформный раствор промывают 100 мл ледяной воды, сушат над б е з - 55 водным кальцием и при температуре максимум 40°С и давлении 20-25 мбар упаривают на водяной бане. Кристал 0 лический остагок суспендируют в 70 мл петролейного эфира, продукт отфильтровывают, два раза промывают петролейчым эфиром, применяя каждый оаз по 30 мл последнего, и сушат в вакуум~эксикаторе над пятиокисью фосфора. Выход 44 г (81%). Т пл. 164!66°С. (У7 г р = -24° (с = 1, тетрагидрофуран). Вычислено, %: С 58,44; Н 6 , 7 1 ; N 14,45. C ^ H 2 4 0 5 N 4 (390,43) Найдено, %: С 5 8 , 7 ; Н 6 , 8 ; N 14,1. П р и м е р 2. Сульфат N-этил-О-фенилаланин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида. Стадия 1. N-Бензилоксикарбонил~М-этил~Е)-фенилаланин-Ь-пролил-Ы -бензилотссикарбонил-Ь-аргинин-лактам. 2,1 г (0,005 моль) N-бензилоксикарбонил-^М-этил-В-фенилаланин-Ъ-про-* лина и 2,15 г (0,0055 моль) Т^-трет-бутилоксикарбонил-Ы ы -бензилоксикарбонил-Іі-аргинин-лактама (пример 1, стадия Е) вводят во взаимодействие или в реакцию конденсации (по способу, описанному в примере 1, с т а дия 1 ) , при применении пропорциональных количеств реагента и растворителей. При обработке реакционной смеси и во время хроматографии на колонке фракции исследуют с помощью хроматографии в тонком слое при применении в качестве элюирующего средства смеси бензола и толуола ( 8 : 2 ) . Фракции, которые содержат чистый о с новной продукт (Е. f = 0 , 4 - 0 , 5 ) , объединяют, упаривают на водяной бане при температуре 40°С и давлении 1520 мбар, остаток обрабатывают диизопропиловым эфиром, отфильтровывают, промывают диизопропиловым эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над серной кислотой и парафиновыми стружками. Выход 1,9 г (54%). Rp = 0 , 7 5 0,85. Стадия 2. N-Бензилоксикарбонил'-N-3 тил-В-фенилаланин-Ъ-пролил-Ы -бензнлоксикарбонил-Ь-аргикинальдегид, 1,4 г (0,02 моль) N-бензилоксикарбонил-Ы-этип-О-фенилаланин-Ь-пролил-Ыы-бензилоксикарбонил-Ъ-аргининлактама (пример 2, стадия 1) вводят зо взаимодействие аналогично приме 11 1184203 py 1, стадия 2, при применении пропорциональных количеств р е а г е н т о в . Выход 1.15 г (72%) продукта, к о торый в соответствии с данными э л е ментного анализа содержит 1 моль циклогексана. Rp = 0 , 5 5 - 0 , 6 5 . Вычислено, %: С 6 7 , 4 9 ; Н 7 , 4 7 ; ' N 10,73. C 3 e H 4 , O 7 N c C 6 H, Z (782,95) Найдено, %: С 6 7 , 6 ; Н 7 , 5 ; N 10,5. Стадия 3 . Сульфат М-этил-О-фенилаланин-Ъ-пролил-Ь-арг ининальдегида. 0,78 г (0,001 моль) N-бензилоксикарбонил-Ы-этил-О-фенилаланин-Ь-пролил-N -бензилоксикарбонил-L-aprининальдегида (пример 2, стадия 2) вводят во взаимодействие аналогично примеру 1, стадия 3 , при применении пропорциональных количеств р е а г е н тов И растворителей. Выход 0,75 г (70%). R&F = 0 , 4 - 0 , 5 . Вычислено, %: С 4 5 , 9 3 ; Н 7 , 4 8 ; N 14,61; S 4,64. * C 2 5 H 3 4 O 3 N 6 5/6 (H 2 S0,) 3,5 (H5O) (575,27). _ . Найдено, %: С 4 6 , 1 ; Н 7 , 6 ; N 14,2; S 4,6. Исходное соединение, а именно Я-бензилоксикарбонил-^этил-Б-фенилаланин-Ь-пролин, может быть получено следующим образом. Стадия А. Ы-этил-О-фенилаланин. 8,25 г (0,05 моль) D-фенилаланина растворяют в 100 мл 20%-ного водного этилового спирта. Приготовленный раствор смешивают с 5,65 мл ( 0 , 1 моль) уксусного альдегида и 2 г 10%-ного палладия на у г л е , примененного в качестве к а т а л и з а т о р а , после чего в течение 2 д н . производят гидрирование. Затем катализатор отфильтровывают, промывают его 60 мл 2 н, раствора соляной кислоты, после чего р Н водного раствора доводят до значения 7 посредством прибавления 4 н . раствора гидроокиси натрия. Выделившийся в осадок продукт о т фильтровывают, три раза промывают | водой, применяя каждый раз по 20 мл последней, и сушат в вакуум-эксикаторе над безводным хлористым к а л ь цием. Выход 4,85 г (50%). [^]!г°= -53° (с = 1, 0,1 н . раствор гидроокиси натрия), Вычислено, %: С 6 8 , 3 7 ; Н 7,82; N 7,25. 5 10 15 20 25 30 35 12 C ? f H ^ O ? N (193,24) Найдено, %: С 6 8 , 5 ; Н 7,65; N 7,2. Стадия В. N-Бензилоксикарбонил-^-этил-Б-фенилаланин. 2,9 г (0,015 моль) N-этил-О-фенилаланина (пример 2, стадия А) растворяют в 22,5 мл 2 н. раствора гидроокиси натрия. Приготовленный р а с т вор смешивают сначала с 10 мл диокс а ч а , а затем после охлаждения до 5-10°С с ?,5 мл (приблизительно 0,017 моль) бензилоксикарбонилхлорид а , после чего реакционную смесь перемешивают при охлаждении в течение 3 ч. После этого реакционную смесь разбавляют прибавлением 40 мл воды, а затем производят экстрагирование 30 мл смеси, состоящей из диэтилового эфира и петролейного эфира в соотношении 1:1. В результате получают трехфазную систему. Две нижние фазы вновь экстрагируют 300 мл ди~ этилового эфира, и объединенные водные фазы подкисляют 1 н. раствором серной кислоты (рН 2 ) . Выделившийся в осадок продукт три р а з а э к с т р а гируют этиловым эфиром уксусной кислоты, применяя каждый раз по 30 мл последнего. Растворы продукта в э т и ловом эфире уксусной кислоты объединяют, два раза промывают водой, которую каждый раз берут в количестве 20 мл, сушат над безводным сернокислым натрием и упаривают затем на ' водяной бане при температуре, с о с тавляющей максимум 40°С, и давлении 15-20 мбар. Выход 2,7 г (55%) маслообразного продукта. R F = 0 , 5 - 0 , 6 . Стадия С. N-бензилоксикарбоншг-Ы-этил-Б-фенилаланин-Ь-пролин. 2,6 г (0,008 моль) N-бензилокси45 карбонил-Ы-этил-О-фенилаланина (пример 2 , стадия 2) растворяют в 10 мл тетрагидрофурана. Приготовленный раствор при 0°С смешивают с 1,6 г ( 0 , 0 0 8 моль) 2,4,5-трихлорфенола и сп 1,65 г (0,008 моль) дициклогексилкарбодиимида, после чего реакционную смесь выдерживают в течение 4 ч при комнатной температуре. Затем р е акционную смесь фильтруют и фильтрат упаривают на водяной бане при 5 5 температуре максимум 40 С и д а в л е нии 15-20 мбар. Полученный остаток растворяют в 40 мл бензола, раствор промывают два раза 5%-ным раствором 40 13 1384203 кислого углекислого натрия, применяя каждый раз по 20 мл этого раствора, и два р а з а водой, которую каждый раз 1 берут в количестве 20 мл. Непосредственно после этого раствор сушат над сернокислым натрием и затем упаривают на водяной бане при температуре максимум 40°С и давлении 1520 мбар. Маслообразный остаток р а с т воряют в 10 мл пиридина, раст.вор смешивают сначала с 0,92_г (0,008 моль) L-пролина, затем с. ~ \ 1,12 мл (0,008 моль) триэтиламина, после чего реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре до полного растворения L-пролина. Раствор выдерживают я течение 4-.э ч и непосредственно после этого упаривают на.водяной бане при температуре максимум 40 °С и давлении 15.; 20 мбар. Полученный остаток р а с т в о ряют в 25 мл воды и 10 мл диэтилового эфира, водную'фазу д в а ' р а з а промывают диэтиловым эфиром, применяя каждый раз по 10 мл последнего, а объединенные эфирные-растворы два р а з а промывают 5%-ным раствором кислого углекислого натрия, причем каждый раз применяют по 10 мл этого раствора. Объединенные водные фазы .подкисляют до рН 2 посредством прибавления 3 н . раствора соляной кислоты. Выделившийся в осадок продукт три раза экстрагируют бензолом, применяя каждый раз по 15 мл последнег о , объединенные бензольные экстракты трижды промывают водой, которую всякий раз берут в количестве 5 мл, сушат над безводным сернокислым натрием и затем упаривают на водяной бане при 40°С и давлении 15-20 мбар, 15 20 25 30 35 40 Выход 2,2 г (64%) маслообразного продукта. R F = 0 , 5 - 0 , 6 . П р и м е р 3. Сульфат N-изобу45 тил-О-фенилаланин-Ь-пролил^-аргининальдегида. Стадия 1. N-Бензилоксикарбонил-N-изобутил-D-фенилалaHHH-L-пролил-N -бензилоксикарбонил~1і-аргинин50 лактам. 2,26 г (0,005 моль) N-бенэилок-: сикарбонил-К-изобутил-Б-фенилалаHHH-L-пролина и N -трет-бутил-оксикарбонил-N -бензилоксикарбонил-L-apгинин-лактама (пример 1, стадия Е) 55 вводят во взаимодействие или в реакцию конденсации аналогично примеру 1 при применении пропорциональных ко 14 личёств реагентов и растворителей. . При обработке реакционной смеси и в ; процессе хроматографии на колонкефракции исследуют с помощью хроматографии в тонком слое в смеси р а с т ворителей, СОСТОЯЩеЙ ИЗ ЭТИЛ.ОВОГО эфира уксусной кислоты, пиридина, уксусной кислоты и воды 4 8 0 : 2 0 : 6 : 1 1 , и фракции, которые содержат чистый продукт с R'F = 0 , 7 5 - 0 , 8 5 , объединяют. Затем эти фракции упаривают на водяной бане при 40 С и при д а в л е нии 15-20 мбар, полученный о с т а т о к ' . обрабатывают петролейным эфиром, о т фильтровывают, -продукт промывают петролейным эфиром и сушат в вакуумэксикаторе над парафиновыми стружками. Выход 2,7 г (75%). Rp = 0 , 7 5 - 0 , 8 5 . Ы1 j° = -5,8° (с = I, тетрагидро фуран). Вычислено, % С 66,30; Н 6 , 9 5 ; N 10,87. (С 4 Н 8 О) (772,90) ' Найдено, %: С 6 5 , 0 ; Н 6 , 8 ; . N 10,80. Стадия 2. N-бензилоксикарбонил- ; -К-изобутил-Б-фенилаланин-Ь-пролил-N -бензилоксикарбонил-Ъ-аргинин— альдегид. ••'. . 1,45 г (0,002 моль) N-бензилокси-; карбонилЧЯ~изобутшг~В-фенилаланин-L-пролил-К -бензилоксикарбонил-L- ,' аргинйн-лактама (пример 3, стадия 1) .восстанавливают аналогично примеру 1, стадия 2, при .применении пропорциональных "количеств реагентов и •• • • ' растворителей. \ • Выход 1,0 г (62%). КІ = 0 , 2 4 . Ы7])= +2,3 (с = .1, тетрагидрофуран) . . Вычислено, %: С 6 6 , 6 4 ; Н 7,14; N 11,24. /4 (С в Н, г ) (747,89) : Найдено, %: С 6 6 , 3 ; Н 7 , 1 ; . N 11,2. Стадия 3 . Сульфат К-изобутил-Ц- . • -фенилаланинН-і-пролил-Ь-аргининаль- !; дегида. 0,81 г (0,001 моль) N-бензилоксиг карбонил-Ы~изобутилЧ)-фенилаланин-Ь-пролил-N -бензилоксикарбонил-Lаргининальдегида (пример 3 , с т а дия 2) вводят во взаимодействие а н а логично примеру 1, стадия 3, при применении пропорциональных количеств реагентов и растворителей. Выход 0,45 г (80%), R$ » 0 , 6 4 . 15 384703 16 0,5%-ный фибриноген крупного рогатоВычислено, %: С 45,84; Н 7,64; го скота в 0,9%-ном растворе поваN 13,36; S 5,1, ренной соли 0,2; буферный раствор, С ? , Н ! Й О ^ Й Н ^ 0 „ 4 (Н,0) содержащий трис-(оксиметил)-аминоме(628,74) тан и хлористый водород (значение Найдено, %: С 45,8; Н 7,2; рН 7,2), который также содержит N 13,4; S 4,9. раствор исследуемого пептида, 0,3; Исходное соединение, а именно 3 5 ед./см раствора US Standard Human Ы-бензилоксикарбонил-Ы-изобутил-ОThrombin (NIH, Бетезда, Мэриленд, -фенилаланин-Ь-пролин, может быть 10 СІНА) , 0,1. получено следующим образом. Время свертывания этой системы Стадия А. Н-ИэобутилЧ)-фенилалабез добавки пептида составляло в нин. приборе Schnither Gross Coagulomefer В качестве исходного вещества 15 с. применяют 8,25 г (0,05 моль) D-фе15 Начальную тормозящую свертывание нилаланина и осуществляют способ крови активность отдельных сульфааналогично примеру 2, стадия А, с тов трипептид-альдегидов обозначают тем отличием, что вместо уксусного альдегида применяют 9,1 мл (0,1 моль) такой молярной концентрацией, котоизомасляного альдегида. рая в ср-авнении с контрольным опы20 том вызывает пятикратное удлинение Выход 8,7 г (70%), 00?,° = -29,9° времени свертывания (1й0-значение). (с = 1, 0,1 н, раствор гидроокиси Измеренные на первые, третьи и натрия). пятые сутки антитромбиновой активносВычислено, %: С 67,79; Н 8,75; N 6,08. 25 ти отдельных пептидов в водном растворе при рН 6,0 и -40°С от начальной C, 5 H T ,O 2 N - 1/2 (Н 2 0) (230,30) активности (нулевые сутки) и привеНайдено, %: С 67,2; Н 8,9; дены в табл. 1. N 6,15. В течение периода наблюдения наСтадия В, N-Бензилоксикарбонилчальная активность сульфата D-фенил-ЇІ-изобутил-О-фенилаланин. 30 аланин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида 3,32 г (0,015 моль) N-изобутилуменьшается в два раза, в то время -D-фенилаланина (пример 3, стадия А) как К-метильное производное сохранявводят во взаимодействие аналогично ет свою первоначальную активность, примеру 2, стадия В. а активность N-этильного и N-изобуВыход 3,2 г (60%) маслообразного 35 тильного соединений уменьшается лишь продукта. Rр = 0,6-0,7. на 15—20%. В условиях проведения Стадия С, N-Бензилоксикарбонилt -Ы-изобутилЧЭ-фенилаланин-Ь-пролин. опытов следует считаться с частич2,85 г (0,008 моль) N-бензилоксиной рецемизацией находящегося на карбонкл-Я-изобутил-Б-фенилаланина 40 конце молекулы L-аргининальдегида. (пример 3, стадия В) вводят во взаИменно этим может быть объяснено имодействие аналогично примеру 2, незначительное падение активности стадия С . " N-этильного или N-изобутильного про-* Выход 2,45 г (67%) маслообразноизводного. го продукта, Rp = 0,65-0,70. Действие N—алкилтрипептидальдеги— 45 Проводят биологические испытания дов на плазминфибриновую реакцию производных пептидил-аргининальдегитакже исследуют и определяют на придов, полученных в условиях предлагамере сульфата її-метил-О-фенилалаемого способа. нин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида в При проведении специальных иссле50 следующей системе, см : 0,05%—ный дований пептиды растворяют в воде фибриноген крупного рогатого скота (рН 6,0) в концентрациях 10 мг/см , в 0,9%-ном растворе поваренной соли после чего растворы хранят при 40 °С. .0,2; содержащего трис-(оксиметил)В течение 5 дн. наблюдают за измеаминометан и хлористый водород буфернением антитромбиновой активности ного раствора (значение рН 7,2) ко55 торый также содержит исследуемый растворенного вещества. Характеризующее активность значение определяпептид 0,1; раствор US Standard ют в системе, которая состояла из Human Thrombin (NIH) Бетезда, Мэриследующих составных частей, см : ленд, США/ 10 ед./см 5 0,1; 0,1 ед. 17 1384203 плазмина в 0,1 мл буферного р а с т в о ра (КАВІ, Стокгольм, Швеция). Время свертывания образовавшегося в системе фибринозного геля без добавления пептида 10 мин. В качестве контрольного соединения применяют сульфат D-фенилаланин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида, а также гемисульфат трет—бутилоксикарбонил-В-фенилаланин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида. г значительно теряют свою первоначальную активность (N-этильные и N-изобутильные производные теряют активность на 15-20%), в то время как соединение сравнения дезактивируется за этот период на Ь07„. Кроме того, новые трипептидальдегиды с алкилированными концевыми аминогруппами более стабильны, чем известный сульфат Б-фенилаланин-Ьпролил-L-аргининальдегида, но одно35 временно они представляют собой аналогичные селективные замедлители свертывания, поскольку при эффективном торможении тромбин-фибриногеновой реакции они не оказывают влия40 ния на плазминфибриновую реакцию. Ф о р м у л а 45 и з о б р е т е н и я Способ получения сульфатов пелтидил-аргининальдегидов общей формулы R He -A-H-H. 50 где R j - водород; R 2 ~ С ^ С ^ а л к и л , причем R^ и R 2 присоединены к аминогруппе D-фенилаланина; 55 А - остаток L-аргинина, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что аргинин-лакт ам с защищенной гуанидиновой группой конденсируют с защи П84203 19 ценным по концевой аминогруппе дипептидом Л-моноалкил(С\, -С4)-Ь~пролином, полученный защищенный трипептидлакгам восстанавливают до соот 20 ветствующего трипептидальдегнда и после отщепления защитной группы целевые продукты выделяют в виде соли. Т а 6 л и ц Пептидальдегид Начальная Активность, %, через активность, сутки г і *во 1 0-е сут 1е 3-й 5-е Сульфат N-weTRn-D-фенилаланин-L-npoлил~Ь-аргининальдегида 0,25 100 100 100 00 Сульфат N-smn-D-фенилаланин-Ь-пролил-L-аргининальдегида 0,21 100 100 100 85 Сульфат N-изобутил-В-фенилаланин-Ь-пролил-Ъ-аргининальде гида 0,31 100 100 85 80 Сульфат D-фенилаланин-Ь-пролил-^-аргининальдегида (вещество Для сравнения) 0,35 100 100 50 40 концентрация пептида в реакционной смеси (^М), которая в сравнении с контрольным опытом вызывает пятикратное удлинение времени свертывания. Т а б л и ц а Пептидальдегид і Сульфат N—метил-Б-фенил— аланин-Ъ-пролил-Ь-аргининальдегида 2 Содержание Время растворепептида, ния фибринозных сгустков, мин г 3 0, 18 10 0,36 * 0,72 Нет сгустков ?: 21 габп . 2 1 J 0,18 Сульфат D-фенилаланин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида 1 ! 10 _. 0,36 0,72 0,18 20 0,72 Время растворения слабую структуру 10 0,36 Гемисульфаі трет-бутилоксикарбонил-Е-фенилаланйн-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида He і сгусі ков 40 нельчя измерить, сгустки имеют Т а б л и ц а Трипептидальдегид 3 Наименьшая активная доза, мг/кг/ч Внутривенно Через рот Сульфат N-метил-D-фенилаланин-Ь-пролил-Ь-ар г и нинальдегида 0,5 20 Сульфат N-этил-О-фенилаланин" -Ь-пролил-Ь-аргининальдегида 0,5 20 -пролил-Ь-аргининальдегида 0,5 20 Сульфат D-фенилаланин-Ъ-пролил-Ь-аргининальдегида (вешество для сравнения) 0,5 20 Сульфат N-изобутил -D -ф е н ил а л а нин -L ВНИИПИ Заказ 1356/58 Тираж 348 Подписное Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, k