Препарат гуманізованого b-ly1 антитіла

Реферат: Винахід стосується складів з гуманізованим B-Ly1 антитілом, їх застосування для лікування СD20-асоційованих захворювань. UA 101487 C2 (12) UA 101487 C2 UA 101487 C2 5 10 15 20 25 30 Даний винахід відноситься до складу з анти-CD20 моноклональним антитілом, до способу виготовлення зазначеного складу й застосуванням даного складу. Рівень техніки Молекула CD20 (також називана людським B-лімфоцитарним антигеном диференціювання або Bp35) являє собою гідрофобний трансмембранний білок з молекулярною масою приблизно 35 кДа, що перебуває на пре-B і зрілих B-лімфоцитах (Valentine et al. (1989) J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287; і Einfield et al. (1988) EMBO J. 7(3):711-717). CD20 перебуває на поверхні більше 90 % В-клітин периферичної крові або лімфоїдних органів, експресується у ранньому пре-B-клітинному розвитку й зберігається до етапу диференціації плазматичних клітин. CD20 є присутнім і на нормальних В-клітинах, і на злоякісних В-клітинах. Зокрема, CD20 експресується на більше ніж 90 % В-клітин неходжкінських лімфом (non-Hodgkin's lymphomas, NHL) (Anderson et al. (1984) Blood 63(6): 1424-1433)), але він не знайдений на гемопоетичних стовбурних клітинах, в-B-клітинах, нормальних плазматичних клітинах або інших нормальних тканинах (Tedder et al. (1985) J, Immunol. 135(2):973-979). 85-амінокислотна ділянка карбоксильного кінця білка CD20 перебуває у цитоплазмі. Довжина цієї ділянки відрізняється від довжини інших специфічних В-клітинних поверхневих структур, таких як IgM, IgD і важкі ланцюги IgG або антигени гістосумісності класу I1 α- або ßланцюгів, які мають порівняно короткі внутрішньоцитоплазматичні ділянки з 3, 3, 28, 15 і 16 амінокислот відповідно (Komaromy et al. (1983) NAR 11:6775-6785). З останніх 61 амінокислот карбоксильного кінця 21 є кислотним залишком, тоді як тільки 2 є основними, вказуючи, що ця ділянка має сильний негативний заряд. Номер у ГенБанку (GenBank Accession No) NP-690605. Вважається, що CD20 можуть брати участь у регулюванні першого етапу(ів) процесів активації й диференціювання В-клітин (Tedder et al. (1986) Eur. J. Immunol. 25 16:881-887) і можуть функціонувати як канали для іонів кальцію (Tedder et al. (1990) J. Cell. Biochem. 14D: 195). Існує два різних типи анти-CD20-антитіл, що значно відрізняються у характері їхнього зв'язування CD20 і біологічних активностей (Cragg, M.S., et al, Blood, 103 (2004) 2738-2743; і Cragg, M.S., et al, Blood, 101 (2003) 1045-1051). Антитіла I типу, такі як ритуксимаб, є потужними у відношенні опосередкованої комплементом цитотоксичності, у той час як антитіла II типу, такі ® як тозитумомаб (Bexxar , В1), 11B8 і AT80, ефективно ініціюють смерть клітини-мішені шляхом каспаза-незалежного апоптозу із супутнім вивільненням фосфатидилсерину. Загальні особливості анти-CD20 антитіл I і II типу наведені у таблиці 1. Таблиця 1 Властивості анти-CD20 антитіл I і II типу анти-CD20 антитіла I типу епітоп CD20 I типу Локалізація CD20 на ліпідних рафтах Збільшена CDC (при ізотипі IgG1) Антитілозалежна клітинна цитотоксичність (при ізотипі IgG1) Повна єднальна здатність Гомотипова агрегація Апоптоз при перехресному зшиванні 35 40 45 анти-CD20 антитіла II типу епітоп CD20 II типу Немає локалізації CD20 на ліпідних рафтах Зменшена CDC (при ізотипі IgG1) Антитілозалежна клітинна цитотоксичність (при ізотипі IgG1) Зменшена єднальна здатність Більше сильна гомотипова агрегація Сильна індукція клітинної загибелі без перехресного зшивання Сутність винаходу В одному аспекті винахід відноситься до фармацевтичного складу, що містить: від 1 до 150 мг/мл анти-CD20 антитіла; від 1 до 100 мМ буфера; можливо від 0,001 до 1 % поверхнево-активної речовини; а також можливо від 1 до 800 мМ тонічного агенту; при рН у діапазоні від 4,5 до 7,0. Переважно зазначене анти-CD20 антитіло є антитілом II типу. Більш переважно зазначене анти-CD20 антитіло є гуманізованим B-Ly1 антитілом. Докладний опис винаходу Термін "антитіло" містить у собі різні форми антитіл, у тому числі, без обмеження, цілі антитіла, людські антитіла, гуманізовані антитіла й антитіла, отримані шляхом генної інженерії, 1 UA 101487 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 такі як моноклональні антитіла, химерні антитіла або рекомбінантні антитіла, а також фрагменти таких антитіл доти, поки зберігаються їхні характерні властивості відповідно до винаходу. "Фрагменти антитіла" включають частину антитіла повної довжини, як правило, щонайменше єднальну частину антигену або його варіабельну область. Приклади фрагментів антитіл включають подвійні антитіла, одноланцюгові молекули антитіл, імунотоксини й поліспецифічні антитіла, сформовані з фрагментів антитіл. Крім того, фрагменти антитіла включають одноланцюгові поліпептиди, що мають характеристики ланцюга VH, а саме можливість поєднуватися з ланцюгом VL, або характеристики ланцюга VL, що зв'язує антиген CD20, а саме можливість поєднуватися з ланцюгом VH для формування функціональної антиген-єднальної кишені. "Фрагменти антитіл" також включають такі фрагменти, які самі по собі не здатні забезпечувати ефекторні функції (ADCC/CDC), але забезпечують ці функції відповідно до винаходу після комбінування з константним доменом(ами) відповідного антитіла. Використовувані у даному документі терміни "моноклональне антитіло" або "композиція з моноклональним антитілом" відносяться до виготовлення молекул антитіла єдиного амінокислотного складу. Таким чином, термін "людське моноклональне антитіло" відноситься до антитіл, що демонструють однакову специфічність зв'язування, які мають варіабельні й константні області, отримані з людських зародкових послідовностей імуноглобуліну. В одному втіленні людські моноклональні антитіла роблять за допомогою гібридоми, що включає Bклітини, отримані з трансгенної відмінної від людини тварини, наприклад із трансгенної миші, з геномом, що містить трансген людського важкого ланцюга й трансген людського легкого ланцюга, злитим із іморталізованою клітиною. Термін "химерне антитіло" відноситься до моноклонального антитіла, що містить варіабельну область, тобто єднальну область, з одного джерела або виду й щонайменше частину константної області, отриманої з різних джерел і видів, як правило отриманих за допомогою методик рекомбінантної ДНК. Особливо кращими є химерні антитіла, що містять мишачу варіабельну ділянку й людську константну ділянку. Такі мишачі/людські химерні антитіла є продуктом експресованих генів імуноглобулінів, що містять сегменти ДНК, які кодують варіабельні ділянки мишачого імуноглобуліну, і сегменти ДНК, які кодують константні ділянки людського імуноглобуліну. Іншими формами "химерних антитіл", охоплюваними даним винаходом, є ті, в яких клас або підклас був модифікований або змінений у порівнянні з вихідним антитілом. Такі "химерні" антитіла також називають "антитілами з перемиканням класу". Способи одержання химерних антитіл включають звичайні методики рекомбінантної ДНК і генної трансфекції, у цей час гарно відомі у даній області. Див., наприклад, Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; патенти США 5202238 і 5204244. Термін "гуманізоване антитіло" відноситься до антитіл, у яких були змінені каркасні ділянки або "ділянки, що визначають комплементарність" (CDR) так, щоб вони містили CDR імуноглобуліну іншої специфічності, відмінної від батьківського імуноглобуліну. У кращому втіленні мишачий CDR прищеплюють каркасній ділянці людського антитіла для одержання "гуманізованого антитіла". Див., наприклад, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; і Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. Особливо кращі CDR відповідають тим із представлених послідовностей, які розпізнають відзначені вище антигени для химерних і біфункціональних антитіл. Термін "людське антитіло", що використовується у даному документі, включає антитіла з варіабельними й константними ділянками, отриманими з людських зародкових послідовностей імуноглобуліну. Людські антитіла добре відомі у даній області (van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374). На основі такої технології можна одержати людські антитіла проти найрізноманітніших мішеней. Прикладами людських антитіл є, наприклад, описані у Kellermann, S. A., et al., Curr Opin Biotechnol. 13 (2002) 593-597. Термін "рекомбінантне людське антитіло", що використовується у даному документі, охоплює всі людські антитіла, які одержують, експресують, створюють або виділяють за допомогою рекомбінантних засобів, таких як антитіла, виділені з приймаючої клітини (клітинихазяїна), такої як клітина NS0 або СНО, або тварини (наприклад, миші), які є трансгенними для людських генів імуноглобулінів або антитіл, що експресуються за допомогою рекомбінантного вектора експресії, трансфікованого у приймаючу клітину (клітину-хазяїна). Такі рекомбінантні людські антитіла мають варіабельну й константну ділянки, отримані з зародкових послідовностей людського імуноглобуліну, у перегрупованій формі. Рекомбінантні людські антитіла відповідно до винаходу піддавали соматичному гіпермутуванню in vivo. Таким чином, амінокислотні послідовності ділянок VH і VL рекомбінантних антитіл є послідовностями, які, 2 UA 101487 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 будучи отриманими з і пов'язаними з людськими зародковими послідовностями VH і VL, не можуть природно існувати у наборі людських зародкових антитіл in vivo. Використовувані у даному документі терміни "специфічно зв'язується" або "зв'язується специфічно з" відносяться до антитіла, що специфічно зв'язується з антигеном CD20. 9 10 Переважно аффінність зв'язування має значення KD 10- моль/л або нижче (наприклад, 1010 12 моль/л), краще значення KD 10- моль/л або нижче (наприклад, 10- моль/л). Аффінність зв'язування визначають за допомогою стандартного аналізу зв'язування, такого як методика ® поверхневого плазмонного резонансу (Biacore ). Термін "нуклеїновокислотна молекула", що використовується у даному документі, включає молекули ДНК і РНК. Нуклеїновокислотна молекула може бути одноланцюговою або дволанцюговою, але кращою є дволанцюгова ДНК. "Константні домени" не беруть участь безпосередньо у зв'язуванні антитіла з антигеном, але беруть участь в ефекторних функціях (ADCC, реакція зв'язування комплементу й CDC). Термін "варіабельна ділянка" (варіабельна ділянка легкого ланцюга (VL), варіабельна ділянка важкого ланцюга (VH)), що використовується у даному документі, означає пару з легкого й важкого ланцюгів, що безпосередньо бере участь у зв'язуванні антитіла з антигеном. Домени варіабельного людського легкого й важкого ланцюгів мають однакові загальні структури, і кожний домен містить чотири каркасних ділянки (framework region, FR), послідовності яких у значній мірі консервативні, з'єднані трьома "гіперваріабельними ділянками" (або ділянками, що визначають комплементарність, CDR). Каркасні ділянки приймають конформацію b-листа, і CDR можуть утворювати петлі, що зв'язують структуру b-листа. CDR у кожному ланцюзі містяться в їхній тривимірній структурі за допомогою каркасних ділянок і утворюють разом з CDR з іншого ланцюга антиген-єднальну ділянку. CDR3-ділянки важкого й легкого ланцюга антитіла грають особливо важливу роль у специфічності зв'язування/аффінності антитіл відповідно до винаходу й, отже, забезпечують подальший предмет винаходу. Терміни "гіперваріабельна ділянка" або "антигензв'язуюча частина антитіла", що використовуються у даному документі, відносяться до амінокислотних залишків антитіла, які відповідають за зв'язування антигену. Гіперваріабельна ділянка містить амінокислотні залишки з "ділянок, що визначають комплементарність", або "CDR". "Каркасними ділянками", або "FR", є ті ділянки варіабельного домена, які відрізняються від залишків гіперваріабельних ділянок, визначених тут. Таким чином, легкі й важкі ланцюги антитіла містять від N-кінця до C-кінця домени FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 і FR4. Зокрема, CDR3 важкого ланцюга є ділянкою, що вносить найбільший вклад у зв'язування антигену. Області CDR і FR визначені у відповідності зі стандартною системою визначення Кабата, Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) і/або цими залишками з "гіперваріабельної петлі". Терміни "CD20" і "CD20-антиген" використовуються у даному документі як взаємозамінні й містять у собі будь-які варіанти, ізоформи й види гомологів людського CD20, які природно експресуються клітинами або експресуються на клітинах, трансфікованих геном CD20. Зв'язування антитіла винаходу з антигеном CD20 опосередковує знищення клітин, що експресують CD20 (наприклад пухлинної клітини) шляхом інактивації CD20. Знищення клітин, що експресують CD20, може здійснюватися за одним або більше з наступних механізмів: Синоніми CD20, прийняті у даній області, включають B-лімфоцитарний антиген CD20, Bлімфоцитарний поверхневий антиген B1, Leu-16, Bp35, BM5 і LF5. Термін "анти-CD20 антитіло" відповідно до винаходу означає антитіло, яке специфічно зв'язує CD20-антиген. Залежно від єднальних властивостей і біологічної активності анти-CD20 антитіл з CD20-антигеном можна розрізняти два типи анти-CD20 антитіл (тип I і тип II анти-CD20 антитіл) відповідно до Cragg, M.S., et al, Blood 103 (2004) 2738-2743; і Cragg, M.S., et al Blood 101 (2003) 1045-1051, див. таблицю 2. 3 UA 101487 C2 Таблиця 2 Властивості анти-CD20 антитіл I і II типу анти-CD20 антитіла I типу епітоп CD20 I типу Локалізація CD20 на ліпідних рафтах Збільшена CDC (при ізотипі IgG1) Антитілозалежна клітинна цитотоксичність (при ізотипі IgG1) Повна єднальна здатність Гомотипова агрегація Апоптоз при перехресному зшиванні 5 10 15 20 25 30 анти-CD20 антитіла II типу епітоп CD20 II типу Немає локалізації CD20 на ліпідних рафтах Зменшена CDC (при ізотипі IgG1) Антитілозалежна клітинна цитотоксичність (при ізотипі IgG1) Зменшена єднальна здатність Більше сильна гомотипова агрегація Сильна індукція клітинної загибелі без перехресного зшивання Одним з найважливіших властивостей анти-CD20 антитіл I і II типу є їхній спосіб зв'язування. Таким чином, анти-CD20 антитіла I і II типу можна класифікувати по єднальній здатності зазначеного анти-CD20 антитіла з CD20 на клітинах Raji (ATCC-№ CCL-86) у порівнянні з ритуксимабом. Використовуваний у даному документі термін "анти-CD20 антитіло" може використовуватися для антитіла I або II типу. Переважно це антитіло II типу. Анти-CD20 антитіла I типу мають відношення єднальної здатності зазначеного анти-CD20 антитіла з CD20 на клітинах Raji (ATCC-№ CCL-86) до єднальної здатності з ритуксимабом від 0,8 до 1,2, переважно від 0,9 до 1,1. Приклади таких анти-CD20 антитіл I типу включають ритуксимаб (WO94/11026), 1F5 IgG2a (ECACC, гібридома; Press et al., Blood 69/2:584-591 (1987)), HI47 IgG3 (ECACC, гібридома), 2C6 IgG1 (розкрито у WO2005/103081), 2F2 IgG1 (розкрито у WO 2004/035607 і WO2005/103081) і 2H7 IgG1 (розкрито у WO 2004/056312). Переважно зазначене анти-CD20 антитіло I типу являє собою моноклональне антитіло, що зв'язується з таким же епітопом, як ритуксимаб. Анти-CD20 антитіла II типу мають відношення єднальної здатності зазначеного анти-CD20 антитіла з CD20 на клітинах Raji (ATCC-№ CCL-86) до єднальної здатності з ритуксимабом від 0,3 до 0,6, переважно від 0,35 до 0,55, більш переважно від 0,4 до 0,5. Приклади таких анти-CD20 антитіл II типу включають тозитумомаб (B1 IgG2a), гуманізоване B-Ly1 антитіло IgG1 (химерне гуманізоване антитіло IgG1, розкрите у WO2005/044859), 11B8 IgG1 (розкрито у WO 2004/035607) і AT80 IgG1. Переважно зазначене анти-CD20 антитіло II типу являє собою моноклональне антитіло, що зв'язується з таким же епітопом, як гуманізоване B-Ly1 антитіло (розкрите у WO2005/044859). "Відношення єднальної здатності анти-CD20 антитіл з CD20 на клітинах Raji (ATCC-№ CCL86) до єднальної здатності з ритуксимабом" визначають шляхом прямого імунофлуоресцентного аналізу (вимірюють середню інтенсивність флуоресценції (MFI, mean fluorescence intensity)) з використанням зазначеного анти-CD20 антитіла, кон'югованого з Cy5, і ритуксимаба, кон'югованого з Cy5, у FACS-аналізі (Becton Dickinson) із клітинами Raji (ATCC-№ CCL-86), як описано у прикладі № 2, і розраховують у такий спосіб: Відношення єднальної здатності з CD20 на клітинах Raji (ATCC-№ CCL-86) = MFl(Cy5 - анти - CD20 антитіло ступінь Cy5 - мічення(Cy 5 - ритуксимабу)  MFl(Cy5 - ритуксимаб) ступінь Cy5 - мічення(Cy 5 - анти - CD20 - антитіла 35 40 MFI являє собою середню інтенсивність флуоресценції. Використовуваний тут термін "ступінь Cy5-мічення" означає число молекул Cy5-мітки на молекулу антитіла. Звичайно зазначене анти-CD20 антитіло I типу має відношення єднальної здатності зазначеного анти-CD20 антитіла I типу з CD20 на клітинах Raji (ATCC-№ CCL-86) до єднальної здатності з ритуксимабом від 0,8 до 1,2, переважно від 0,9 до 1,1. Звичайно зазначене анти-CD20 антитіло II типу має відношення єднальної здатності зазначеного анти-CD20 антитіла I типу з CD20 на клітинах Raji (ATCC-№ CCL-86) до єднальної здатності з ритуксимабом від 0,3 до 0,6, переважно від 0,35 до 0,55, більш переважно від 0,4 до 0,5. У кращому втіленні зазначене анти-CD20 антитіло II типу, переважно гуманізоване B-Ly1 антитіло, має підвищену антитілозалежну клітинну цитотоксичність (ADCC). 4 UA 101487 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Під використовуваним у даному документі терміном "антитіло, що має підвищену антитілозалежну клітинну цитотоксичність (ADCC)" розуміється антитіло з підвищеною ADCC, що визначається будь-яким придатним способом, відомим фахівцям у даній області. Одним із прийнятих аналізів ADCC in vitro є наступний: 1) аналіз використовує клітини-мішені, в які відомо, що вони експресують цільовий антиген, що розпізнається антиген-єднальною ділянкою антитіла; 2) в якості ефекторних клітин аналіз використовує мононуклеарні клітини периферичної крові людини (МНПК, PBMC), виділені з крові випадково вибраних здорових донорів; 3) аналіз вводиться у відповідності з наступним протоколом: I) МНПК виділяють з використанням стандартних процедур центрифугування за щільністю й 6 суспендують у кількості 5 × 10 клітин/мл у культуральному клітинному середовищі RPMI; II) клітини-мішені вирощують з використанням стандартних способів культивування тканин, збирають в експонентній фазі росту з життєздатністю більше 90 %, вмивають у культуральному клітинному середовищі RPMI, мітять 100 мкКюрі ''CI-, двічі вмивають у культуральному клітинному середовищі й ресуспендують у клітинному культуральному середовищі з щільністю 10" клітин/мл; III) 100 мкл кінцевої клітинної суспензії переносять у кожну лунку 96-ямкової мікропланшети; IV) антитіла серійно розводять від 4000 нг/мл до 0,04 нг/мл у клітинному культуральному середовищі, і 50 мкл отриманих розчинів антитіла додають до клітин-мішеней у 96-ямковій мікропланшеті, тестуючи у трьох екземплярах різні концентрації антитіла, що охоплюють весь спектр концентрацій; V) для контролю максимального вивільнення (maximum release, MR) у три додаткові лунки у планшеті з міченими клітинами-мішенями вносять по 50 мкл 2 % (VN) водяного розчину неіоногенної поверхнево-активної речовини (Nonidet, Sigma, St. Louis) замість розчину антитіла (п. IV вище); VI) для контролю спонтанного вивільнення (spontaneous release, SR) у три додаткові лунки у планшеті з міченими клітинами-мішенями вносять по 50 мкл клітинного культурального середовища RPMI замість розчину антитіла (п. IV вище); VII) потім 96-ямкову планшету центрифугують при 50 g протягом 1 хвилини й інкубують протягом 1 години при 4 °C; VIII) 50 мкл суспензії PBMC (п. V вище) додають у кожну лунку для одержання відношення ефекторні клітини: клітини-мішені, рівного 25:1, і поміщають планшети в інкубатор в атмосферу з 5 % CO2 при 37 °C на 4 години; IX) з кожної лунки збирають безклітковий супернатант і за допомогою гамма-лічильника оцінюють експериментальний викид радіоактивних речовин (experimentally released radioactivity, ER); X) відсоток специфічного лізису розраховують для кожної концентрації антитіла відповідно до формули (ER-MR)/(MR-SR) х 100, де ER являє собою середню радіоактивність, підраховану (див. п. IX вище) для даної концентрації антитіла, MR являє собою середню радіоактивність, підраховану (див. п. IX вище) для контролю MR (див. п. V вище), а SR являє собою середню радіоактивність, підраховану (см. п. IX вище) для контролю SR (див. п. VI вище); 4) "підвищена ADCC" визначається або як збільшення максимального відсотка специфічного лізису, що спостерігається у межах концентрації антитіла, описаної вище, і/або як зниження концентрації антитіла, необхідної для досягнення половини максимального відсотка специфічного лізису, що спостерігається у межах концентрації антитіла, описаної вище. Підвищення ADCC співвідноситься з ADCC, вимірюваної в описаному вище аналізі за посередництвом того ж антитіла, що було отримано за допомогою того ж типу приймаючих клітин (клітин-хазяїв) з використанням тих же стандартних способів одержання, очищення, складання й зберігання, які добре відомі фахівцям у даній області, але яке не було отримано за допомогою приймаючих клітин, створених для надекспресії GnTIII. Зазначена "підвищена ADCC" може бути отримана із застосуванням глікотехнології до зазначених антитіл, це означає підвищення зазначених природних клітинно-опосередкованих ефекторних функцій моноклональних антитіл шляхом розробки їх олігосахаридного компонента, як описано в Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999) і патенті США № 6602684. Термін "комплемент-залежна цитотоксичність (CDC)" відноситься до лізису людських пухлинних клітин-мішеней за допомогою антитіла відповідно до винаходу у присутності комплементу. CDC вимірюють переважно шляхом обробки препарату клітин, що експресують CD20, антитілом анти-CD20 відповідно до винаходу у присутності комплементу. CDC вважається знайденою, якщо антитіло у концентрації 100 нМ протягом 4 годин індукує лізис (клітинну загибель) 20 % або більше пухлинних клітин. Аналіз вводять переважно з пухлинними 5 UA 101487 C2 51 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 51 клітинами, міченими Cr або Eu, і вимірюють вивільнення Cr або Eu. Для контролю вводять інкубацію пухлинних цільових клітин з комплементом, але без антитіла. Звичайно анти-CD20 антитіла I і II типу ізотипу IgG1 демонструють характерні властивості CDC. Анти-CD20 антитіла I типу мають підвищену CDC (ізотип IgG1), а анти-CD20 антитіла II типу мають знижену CDC (ізотип IgG1) у порівнянні один з одним. Переважно анти-CD20 антитіла й I, і II типу є антитілами ізотипу IgG1. Антитіло "ритуксимаб" є генно-інженерним химерним моноклональним антитілом, що містить людський гамма 1 і мишачий константний домен, спрямованим проти людського антигену CD20. Це химерне антитіло містить людські гамма-1 константні домени й називається "C2B8" в WO94/11026 (Anderson et al.). Ритуксимаб схвалений для лікування пацієнтів з рецидивуючою або рефрактерною, низького ступеня злоякісності або фолікулярною, CD20позитивною В-клітинною неходжкінською лімфомою. Дослідження механізму дії in vitro показали, що ритуксимаб демонструє людську комплемент-залежну цитотоксичність (CDC) (Reff et. al, Blood 83(2): 435-445 (1994)). Крім того, він виявляє значну активність в аналізах, які вимірюють антитіло-залежну клітинну цитотоксичність (ADCC). Термін "гуманізоване B-Ly1 антитіло" відноситься до гуманізованого B-Ly1 антитіла, розкритого у WO2005/044859, що було отримане з мишачого моноклонального анти-CD20 антитіла B-Ly1 (варіабельна ділянка мишачого важкого ланцюга (VH): SEQ ID № 1; варіабельна ділянка мишачого легкого ланцюга (VL): SEQ ID № 2 - див. Poppema, S. and Visser, L., Biotest Bulletin 3: 131-139 (1987)) шляхом химеризації з людським константним доменом з IgG1 і наступної гуманізації (див. WO2005/044859). Ці "гуманізовані B-Ly1 антитіла" розкриті докладно у WO2005 / 044859. Переважно "гуманізоване B-Ly1 антитіло" має варіабельну ділянку важкого ланцюга (VH), вибрану з групи з SEQ ID № 3 по SEQ ID № 20 (з B-HH2 по B-HH9 і з B-HL8 по B-HL17 з WO2005/044859). Особливо кращими є SEQ ID №№ 3, 4, 7, 9, 11, 13 і 15 (B-HH2, BHH-3, B-HH6, B-HH8, B-HL8, B-HL11 і B-HL13 з WO2005/044859). Найбільш кращим із зазначених VH є BHH6. Переважно "гуманізоване B-Ly1 антитіло" має варіабельну ділянку легкого ланцюга (VL) з SEQ ID № 20 (B-KV1) з WO2005/044859. Крім того, гуманізоване B-Ly1 антитіло є переважно IgG1антитілом. Переважно такі гуманізовані B-Ly1 антитіла отримані шляхом модифікації вуглеводу, асоційованого з молекулою білка (glycoengineered, GE) у Fc-області відповідно до процедур, що описані у WO2005/044859, WO 2004/065540, Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999) і WO 99/154342. Більшість підданих глікомодифікації гуманізованих B-Ly1 антитіл мають змінену структуру глікозилування у Fc-області, переважно маючи знижений рівень фукозних залишків. Переважно щонайменше 40 % або більше (в одному втіленні між 40 % і 60 %, в іншому втіленні щонайменше 50 %, а в ще одному втіленні щонайменше 70 % або більше) олігосахаридів Fc-області є нефукозилованими. Крім того, олігосахариди Fc-області переважно мають симетричне розгалуження. Найбільше переважно "гуманізоване B-Ly1 антитіло" містить VH B-HH6 і VL B-KV1 з WO2005/044859. У даному документі зазначене антитіло також називають "HuMab". В іншому найбільше кращому втіленні зазначене антитіло має знижений рівень фукозних залишків, як це визначено вище, і/або олігосахариди Fc-області найбільше переважно мають симетричне розгалуження. У ще одному найбільше кращому втіленні зазначене антитіло демонструє збільшену ADCC, як вона визначена у даному документі. Олігосахаридний компонент може істотно впливати на властивості, що мають відношення до ефективності терапевтичного глікопротеїну, включаючи фізичну стабільність, стійкість до руйнування протеазою, взаємодії з імунною системою, фармакокінетику й специфічну біологічну активність. Такі властивості можуть залежати не тільки від наявності або відсутності олігосахаридів, але також від їхніх специфічних структур. Можна зробити деякі узагальнення між олігосахаридною структурою й функцією глікопротеїну. Наприклад, деякі олігосахаридні структури опосередковують швидке виведення глікопротеїну з кровотоку через взаємодію зі специфічними вуглеводозв'язуючими білками, тоді як інші можуть зв'язуватися з антитілами й викликати небажані імунні реакції (Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)). Клітини ссавців є кращими хазяїнами для продукції терапевтичних глікопротеїнів через їхню здатність глікозилувати білки у більше придатній для застосування у людини формі (Cumming et al., Glycobiology 1:115-30 (1991); Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)). Бактерії дуже рідко глікозилують білки, і як інші типи загальноприйнятих хазяїв, таких як дріжджі, міцеліальні гриби, клітини комах і рослин, виробляють структури глікозилування, пов'язані зі швидким виведенням із кровотоку, небажаними імунними взаємодіями, а також у деяких конкретних випадках скороченням біологічної активності. Серед клітин ссавців протягом останніх двох десятиліть найбільше часто використовуються клітини яєчника китайського хом'ячка (Chinese 6 UA 101487 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 hamster ovary, СНО). На додаток до даної придатної структури глікозилування ці клітини дозволяють одержати постійне потомство генетично стабільних високопродуктивних клональних клітинних ліній. Вони можуть культивуватися з високою щільністю у простих біореакторах з використанням безсироваткових середовищ, і дозволяють розробити безпечні й відтворені біологічні процеси. Інші часто використовувані клітини тварин включають клітини нирок дитинчати хом'яка (baby hamster kidney, ВНК), мишачі мієломні клітини NSO і SP2/0. Зовсім недавно також була випробувана продукція за допомогою трансгенних тварин (Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14: 975-981 (1996)). Всі антитіла містять вуглеводні структури у консервативних позиціях у константних ділянках важких ланцюгів, з кожним ізотипом, що має різну мережу N-зв'язаних вуглеводних структур, які з різною силою впливають на білкову конструкцію, секрецію або функціональну активність (Wright, A., and Morrison, S. L., Trends Biotech. 15: 26-32 (1997)). Структура приєднаних Nзв'язаних вуглеводів значно варіює залежно від ступеня процесингу, а також може включати високоманнозні складні олігосахариди, широко розгалужені й із двома гілками (Wright, A., and Morrison, S. L., Trends Biotech. 15: 26-32 (1997)). Як правило, існує гетерогенний процесинг основних олігосахаридних структур, приєднаних до конкретного сайту глікозилування, так що навіть моноклональні антитіла існують у декількох глікоформах. Крім того, було показано, що між клітинними лініями відбуваються значні розходження у глікозилуванні антитіл, і навіть при культивуванні даної лінії клітин у різних умовах спостерігаються незначні розходження (Lifely,M. R. et al., Glycobiology 5(8):813-22 (1995)). Один зі способів досягнення значного збільшення активності, зберігаючи при цьому простий процес продукції й, можливо, уникаючи значних небажаних побічних ефектів, полягає у посиленні природних клітинно-опосередкованих ефекторних функцій моноклональних антитіл шляхом проектування їх олігосахаридного компонента, як описано в Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999) і патенті США № 6602684. Антитіла типу IgG1, які найбільше часто використовують в імунотерапії раку, є глікопротеїнами, які мають консервативний N-зв'язаний сайт глікозилування Asn297 у кожному СН2-домені. Два складних олігосахарида із двома гілками, приєднані до Asn297, сховані між СН2-доменами, утворюючи великі контакти з поліпептидним кістяком, і їхня присутність має важливе значення для опосередковування ефекторних функцій антитіла, таких як антитіло-залежна клітинна цитотоксичність (ADCC) (Lifely, M. R., et al., Glycobiology 5: 813-822 (1995); Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163: 59-76 (1998); Wright, A. and Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 15: 26-32 (1997)). Раніше було показано, що надекспресія у клітинах яєчника китайського хом'ячка (СНО) ß(1,4)-N-ацетилглюкозамінілтрансферази I11 ("GnTII17y), глікозилтрансферази, що каталізує утворення олігосахаридів із двома гілками, значно збільшує in vitro ADCC-активність антинейробластомного химерного моноклонального антитіла (chCE7), отриманого шляхом проектування клітин СНО (див. Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999); і WO 99/154342, вміст якого повністю включено даним посиланням). Антитіло chCE7 відноситься до широкого класу некон'югованих моноклональних антитіл, які мають високу пухлинну афінність і специфічність, але занадто низьку активність, щоб бути клінічно корисними, коли виробляються у стандартних промислових клітинних лініях, в яких відсутній фермент GnTIII (див. Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999)). Це дослідження вперше показало, що значне збільшення ADCC-активності може бути досягнуте шляхом створення клітин, продукуючих антитіла, щоб вони експресували GnTIII, що також веде до збільшення частки константної ділянки (Fc)-асоційованих олігосахаридів із двома гілками, включаючи нефукозиловані олігосахариди із двома гілками, вище рівнів, виявлених у природних антитілах. Термін "експресія CD20-антигену" покликаний підкреслити значний рівень експресії антигену CD20 у клітині, переважно на клітинній поверхні Т- і B-клітини, більше переважно B-клітини, від пухлини або раку відповідно, переважно несолідної пухлини. Пацієнтів з "CD20-експресуючим раком" можна виявити за допомогою стандартних аналізів, відомих у даній області. "Експресія CD20-антигену" також переважно використовується для вказівки значного рівня експресії антигену CD20 у клітині, переважно на клітинній поверхні Т- і B-клітини, більше переважно Bклітини, при аутоімунних захворюваннях. Наприклад, експресію антигену CD20 вимірюють за допомогою імуногістохімічного дослідження (IHC, immunohistochemical detection), FACS-аналізу (проточного цитометричного аналізу) або шляхом заснованого на ПЛР виявлення відповідної мРНК. Термін "CD20-експресуючий рак", що використовується у даному документі, відноситься переважно до лімфомам (переважно B-клітинним неходжкінським лімфомам (НХЛ)) і лімфоцитарним лейкеміям. Такі лімфоми й лімфоцитарні лейкемії включають, наприклад, a) фолікулярні лімфоми, b) лімфоми із дрібних клітин з нерозщепленими ядрами/лімфому Беркітта 7 UA 101487 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (включаючи ендемічну лімфому Беркітта, спорадичну лімфому Беркітта й неходжкінську лімфому Беркітта) c) лімфоми маргінальної зони (включаючи екстранодальну В-клітинну лімфому маргінальної зони (лімфоми, пов'язані з лімфатичною тканиною слизовою оболонкою, MALT), вузлову В-клітинну лімфому маргінальної зони й лімфому маргінальної зони селезінки), d) лімфому з клітин зони мантії (MCL), e) великоклітинну лімфому (включаючи дифузійну Ввеликоклітинну лімфому (DLCL), дифузійну лімфому змішаного клітинного типу, імунобластну лімфому, первинну B-клітинну лімфому середостіння, ангіоцентричну лімфому-легеневу Bклітинну лімфому), f) волосатоклітинну лейкемію, g) лімфоцитарну лімфому, макроглобулінемію Вальденстрема, h) гострий лімфолейкоз (ALL), хронічний лімфолейкоз (CLL)/лімфому з малих лімфоцитів (SLL), B-клітинний пролімфоцитарний лейкоз, i) новоутворення з плазматичних клітин, мієлому з плазматичних клітин, множинну мієлому, плазмоцитому, j) хвороба Ходжкіна. Переважно CD20-експресуючий рак є B-клітинною неходжкінською лімфомою (NHL). Особливо CD20-експресуючим раком є лімфома клітин мантії (MCL), гострий лімфолейкоз (ALL), хронічний лімфолейкоз (CLL), В-клітинна дифузійна великоклітинна лімфома (DLCL), лімфома Беркітта, волосатоклітинна лейкемія, фолікулярна лімфома, множинна мієлома, лімфома маргінальної зони, посттрансплантаційний лімфопроліферативний розлад (PTLD), ВІЧасоційована лімфома, макроглобулінемія Вальденстрема або первинна лімфома ЦНС. Використовуваний у даному документі термін "аутоімунне захворювання" відноситься до хвороби або розладу, пов'язаному з і спрямованому проти власних тканин організму. Приклади аутоімунних захворювань або розладів включають артрит (ревматоїдний артрит, ювенільний ревматоїдний артрит, остеоартроз, псоріатичний артрит), псоріаз, дерматит, поліміозит/дерматоміозит, токсичний епідермальний некроліз, системну склеродермію й склероз, відповіді, пов'язані з 1 5 запальними захворюваннями кишечника, хвороба Крона, виразковий коліт, респіраторний дистрес-синдром, респіраторний дистрес-синдром дорослих (ARDS), менінгіт, енцефаліт, увеїт, коліт, гломерулонефрит, алергійні стани, екзему, астму, стани, що супроводжуються інфільтрацією Т-клітин і хронічними запальними реакціями, атеросклероз, аутоімунний міокардит, дефіцит лейкоцитарної адгезії, системну червону волчанку (СЧВ), ювенільний діабет, розсіяний склероз, алергійний енцефаломієліт, імунні реакції, пов'язані з гіперчутливістю негайного й уповільненого типу, опосередковані цитокінами й Т-лімфоцитами, туберкульоз, саркоїдоз, гранулематоз, включаючи гранулематоз Вегенера, агранулоцитоз, васкуліт (включаючи ANCA-асоційований), апластичну анемію, анемію Даймонда-Блекфана, імунну гемолітичну анемію, включаючи аутоімунну гемолітичну анемію (AIHA), злоякісну анемію, парціальну червоноклітинну аплазію (PRCA), дефіцит фактора VIII, гемофілію А, аутоімунну нейтропенію, панцитопенію, лейкопенію, захворювання, що супроводжуються лейкоцитарним діапедезом, запальні захворювання центральної нервової системи (ЦНС), синдром множинних органних уражень, міастенію гравіс, захворювання, опосередковані комплексом антигенантитіло, хвороба аутоантитіл до базальних мембран, антифосфоліпідний синдром, алергійний неврит, хвороба Бехчета, синдром Кастлемена, синдром Гудпасчера, міастенічний синдром Ламберта-Ітона, синдром Рейно, синдром Шегрена, синдром Стівенса-Джонсона, булезний пемфігоїд, пухирчатку, аутоімунні поліендокрінопатії, нефропатію, IgM-полінейропатії або IgMопосередковану нейропатію, ідіопатичну тромбоцитопенічну пурпуру (ITP), тромботичну тромбоцитопенічну пурпуру (TTP), аутоімунну тромбоцитопенію, аутоімунні захворювання сім'яників і яєчників, включаючи аутоімунний орхіт і оофорит, первинний гіпотиреоз; аутоімунні ендокринні захворювання, включаючи аутоімунний тиреоїдит, хронічний тиреоїдит (тиреоїдит Хашимото), підгострий тиреоїдит, ідіопатичний гіпотиреоз, хвороба Аддисона, Базедову хворобу, аутоімунні полігландулярні синдроми (або полігландулярні синдроми I типу), діабет I типу, також називаний інсулінозалежним цукровим діабетом I типу (IDDM) і синдром Шихана; аутоімунний гепатит, лімфоїдну інтерстиціальну пневмонію (ВІЧ-асоційовану), облітеруючий бронхіоліт (без пересадження) при NSIP (non-specific interstitial pneumonia, неспецифічна інтерстиціальна пневмонія), синдром Гійєна-Барре, васкуліт великих судин (включаючи ревматичну поліміалгію й гігантоклітинний артеріїт (Такаясу)), васкуліт середніх судин (включаючи хворобу Кавасакі й вузловий поліартрит), анкілозуючий спондиліт, хвороба Берже (IgA-нефропатію), швидко прогресуючий гломерулонефрит, первинний біліарний цироз печінки, трофічні афти (глютенову ентеропатію), кріоглобулінемію, бічний аміотрофічний склероз (ALS), ішемічну хворобу серця, але не обмежуються ними. Терапевтичні склади антитіл, що використовуються відповідно до даного винаходу, готовлять для зберігання шляхом змішування антитіла, що має бажаний ступінь чистоти, з можливими фармацевтично прийнятними носіями, ексципієнтами й стабілізаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), у формі ліофілізованих 8 UA 101487 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 складів або водяних розчинів. Прийнятні носії, ексципієнти або стабілізатори нетоксичні для реципієнтів у робочих дозах і концентраціях. Термін "поверхнево-активна речовина", що використовується у даному документі, означає фармацевтично прийнятний поверхнево-активний агент. У складі винаходу кількість поверхнево-активної речовини описується відсотком, вираженим як вага/об'єм. Найбільше часто використовуваними одиницями ваги/об'єму є мг/мл. Придатні фармацевтично прийнятні поверхнево-активні речовини включають неіоногенні поверхнево-активні речовини, такі як TM TM TWEEN , PLURONICSабо поліетиленгліколь (ПЕГ, PEG), але не обмежуються ними. Крім того, вони включають складні ефіри жирних кислот і поліетиленсорбіту, поліетиленполіпропіленгліколі, поліоксіетиленстеарати й додецилсульфати натрію, але не обмежуються ними. Кращими поліетиленсорбітами є складні ефіри поліетилен(20)-сорбіту (синонім полісорбату 20, продається під торговельною маркою Tween 20™) і поліоксіетилен(20)сорбітмоноолеат (синонім полісорбату 80, продається під торговельною маркою Tween 80™). ® Кращими поліетилен-поліпропіленгліколями є ті, які продаються під іменами Pluronic F68 або Poloxamer 188™. Найбільше кращим є Poloxamer 188™. Кращими поліоксіетиленстеаратами є ті, які продаються під торговельною маркою Myrj™. Кращими монолауриловими ефірами поліоксіетилену є ті, які продаються під торговельною маркою Brij™. При застосуванні складного ефіру поліетиленсорбіт-поліетилен(20)-сорбіту (Tween 20™) і поліоксіетилен(20)сорбітмоноолеату (Tween 80™) вони використовуються головним чином у кількості від приблизно 0,001 до приблизно 1 %, переважно від приблизно 0,005 до приблизно 0,1 %, ще більш переважно від приблизно 0,01 % до приблизно 0,04 % (маса/об'єм). Термін "буфер", що використовується у даному документі, означає фармацевтично прийнятний буфер. Придатний фармацевтично прийнятний буфер включає гістидинові буфери, цитратні буфери, сукцинатні буфери, ацетатні буфери й фосфатні буфери, але не обмежується ними. Кращі буфери містять L-гістидин або суміші L-гістидину з гідрохлоридом L-гістидину з ізотонічними агентами й можливо піддаються коректуванню рН за допомогою кислоти або основи, відомих у даній області. Найбільше кращим є L-гістидин. Зазначені вище гістидинові буфери, як правило, використовуються у концентрації від приблизно 1 мМ до приблизно 100 мМ, переважно від приблизно 5 мМ до приблизно 50 мМ, і ще більш переважно приблизно 20 мМ. Незалежно від використовуваного буфера рН буде скоректована до значення, що становить від приблизно 4,5 до приблизно 7,0, переважно від приблизно 5,5 до приблизно 6,5, ще більш переважно приблизно 6,0, або за допомогою кислоти або основи, відомих у даній області, або за допомогою адекватних сумішей буферних компонентів, або обома способами. Термін "ізотонічні агенти", що використовується у даному документі, означає фармацевтично прийнятні ізотонічні агенти. Ізотонічні агенти використовуються для одержання ізотонічного складу. Ізотонічний склад являє собою рідину або рідину, відновлену з твердої форми, наприклад ліофілізованої, і означає розчин, що має таку ж тонічність, як і деякі інші розчини, з якими його порівнюють, наприклад фізіологічний сольовий розчин і сироватка крові. Придатні ізотонічні агенти включають (але не обмежуються ними) солі, у тому числі хлорид натрію (NaCl) або хлорид калію, але не обмежуючись ними, цукри, у тому числі глюкозу, сахарозу, трегалозу, але не обмежуючись ними, гліцерин і будь-який компонент із групи амінокислот, цукру, солі і їхньої комбінації. Ізотонічні агенти, як правило, використовуються у кінцевій концентрації від приблизно 5 мМ до приблизно 350 мМ. Термін "рідина", що використовується у даному документі у зв'язку зі складом відповідно до винаходу, означає склад, що є рідким при температурі щонайменше від приблизно 2 до приблизно 8 °C. Термін "ліофілізований", що використовується у даному документі у зв'язку зі складом відповідно до винаходу, означає склад, що висушують шляхом заморожування складу, а потім піддають сублімації льоду із замороженого вмісту за допомогою кожного зі способів висушування заморожуванням, відомих у даній області, наприклад за допомогою комерційно доступних пристроїв висушування заморожуванням. Термін "солі", що використовується у даному документі, означає сіль у кількості від приблизно 1 мМ до приблизно 500 мМ. Необмежуючими прикладами солей є солі будь-яких комбінацій катіонів натрію, калію, кальцію або магнію з хлоридними, фосфатними, цитратними, сукцинатними, сульфатними аніонами або їхніми сумішами. Термін "амінокислота", що використовується у даному документі, означає амінокислоту у кількості від приблизно 1 до приблизно 100 мг/мл, включаючи аргінін, гліцин, орнітин, глутамін, аспарагін, лізин, гістидин, глутамінову кислоту, аспарагінову кислоту, ізолейцин, лейцин, аланін, фенілаланін, тирозин, триптофан, метіонін, серин, пролін, але не обмежуючись ними. 9 UA 101487 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Термін "цукор", що використовується у даному документі, означає фармацевтично прийнятний цукор, що використовується у кількості від приблизно 25 мМ до приблизно 500 мМ. Кращим є кількість від 100 до300 мМ. Більше кращим є кількість від 220 до 260 мМ. Найбільше кращим є кількість 240 мМ. Придатні цукри включають моносахариди й дисахариди, але не обмежуються ними. Необмежуючими прикладами цукру відповідно до винаходу є трегалоза, сахароза, манітол, сорбітол, лактоза, глюкоза, маноза, мальтоза, галактоза, фруктоза, сорбоза, рафіноза, глюкозамін, N-метилглюкозамін (так званий "меглумін"), галактозамін і нейрамінова кислота і їхні комбінації. Найбільше кращою є трегалоза. Термін "стабілізатор" відноситься до фармацевтично прийнятних стабілізаторів, таких як, наприклад, амінокислоти й цукри, описані у попередніх розділах, а також наявні у продажу декстрани будь-якого типу й молекулярної ваги, відомі у даній області, але не обмежується ними. Термін "антиоксидант" означає фармацевтично прийнятний антиоксидант. Він може включати ексципієнти, такі як метіонін, бензиловий спирт або будь-який інший ексципієнт, що використовується для відомості окислювання до мінімуму. Термін "спосіб лікування" або його еквівалент, застосовуваний, наприклад, до раку, відноситься до процедури або курсу дій, які призначені для зменшення або усунення кількості ракових клітин у пацієнта або полегшення симптомів раку. "Спосіб лікування" раку або іншого проліферативного розладу не обов'язково означає, що ракові клітини або інший розлад у дійсності можуть бути усунуті, що число клітин або розлад у дійсності можуть бути скорочені або що симптоми раку або іншого розладу у дійсності можуть бути ослаблені. Часто спосіб лікування раку буде виконуватися навіть при низькій ймовірності успіху, але проте вважається, з урахуванням історії хвороби й передбачуваної тривалості виживання пацієнта, що це буде мати поліпшуючу дію. В одному аспекті винахід відноситься до складу з антитілом анти-CD20, що містить: - від приблизно 1 до приблизно 150 мг/мл антитіла анти-CD20, - від приблизно 0,001 до приблизно 1 % щонайменше одного ПАР, а також - від приблизно 1 до приблизно 100 мМ буфера при рН від приблизно 4,5 до приблизно 7,0. У більше кращому втіленні склад відповідно до винаходу містить: - від приблизно 1 до приблизно 150 мг/мл антитіла анти-CD20, - від приблизно 0,005 до приблизно 0,05 % щонайменше одного ПАР, а також - від приблизно 1 до приблизно 100 мМ буфера при рН від приблизно 4,5 до приблизно 7,0. У кращому втіленні склад відповідно до винаходу містить: - від приблизно 10 до приблизно 30 мг/мл анти-CD20 антитіла II типу, - 20 мМ L-гістидину, - 240 мМ трегалози, а також - 0,02 % (маса/об'єм) полісорбату 20 при рН приблизно 6. У ще одному кращому втіленні склад відповідно до винаходу містить: - від приблизно 10 до приблизно 30 мг/мл анти-CD20 антитіла II типу, TM - 0,02 % (маса/об'єм) полоксамеру 188 , - 20 мМ L-гістидину, а також - 240 мМ трегалози при рН приблизно 6. Переважно анти-CD20 антитіло є антитілом I типу. Більш переважно анти-CD20 антитіло є антитілом II типу. Ще більш переважно анти-CD20 антитіло є "гуманізованим B-Ly1 антитілом", як докладно описано у WO2005/044859. Найбільше краще антитіло є HuMab. Склад містить зазначене антитіло у кількості від 1 до приблизно 150 мг/мл, більш переважно від приблизно 5 до приблизно 100 мг/мл зазначеного антитіла, ще більш переважно від приблизно 10 до приблизно 30 мг/мл зазначеного антитіла, або його кількість вибрана серед приблизно 5, 10, 15, 20, 25 або 30 мг/мл зазначеного антитіла, і найбільше переважно 25 мг/мл зазначеного антитіла. Склад відповідно до винаходу може бути у рідкій формі, у ліофілізованій формі або у рідкій формі, відновленій з ліофілізованої форми. В одному втіленні склад відповідно до винаходу являє собою ліофілізований склад. Ліофілізований склад відповідно до винаходу має перевагу, що полягає у підвищенні стабільності у зв'язку з утворенням часток і агрегатів з більше високою молекулярною вагою, 10 UA 101487 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 що, як правило, є важко досяжним з рідкими складами з тією же концентрацією описаного антиCD20 антитіла. Склад відповідно до винаходу можна вводити внутрішньовенно (в/в), підшкірно (п/ш) або будь-яким іншим парентеральним шляхом, відомим у фармацевтичній області. Крім того, склад відповідно до винаходу може містити консерванти (наприклад, хлорид октадецилдиметилбензил-амонію; хлорид гексаметонія, хлорид бензалконія, хлорид бензетонія; фенол, бутиловий або бензиловий спирт; алкілпарабени такі як метиловий або пропіловий парабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол і м-крезол); низькомолекулярні (менше 10 залишків) поліпептиди; білки, такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; хелатуючі агенти, такі як ЕДТА; солеутворюючі протиіони, такі як натрій; металокомплекси (наприклад Zn-білкові комплекси). Також активні інгредієнти можуть бути введені у виготовлених мікрокапсулах, наприклад шляхом методик коацервації або шляхом полімеризації на границі розділу фаз, наприклад у гідроксиметилцелюлозних або желатинових мікрокапсулах і поліметилметацилатних мікрокапсулах відповідно, у колоїдних системах доставки лікарських засобів (наприклад ліпосомах, альбумінових мікросферах, мікроемульсіях, наночастках і нанокапсулах) або у макроемульсіях. Такі методики розкриті у Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980). Можуть бути виготовлені препарати вповільненого вивільнення. Придатними прикладами препаратів уповільненого вивільнення є напівпроникні матриці з твердих гідрофобних полімерів, що містять антитіло, які формують у вигляді округлих часток, наприклад плівок або мікрокапсул. Приклади матриць для вповільненого вивільнення включають поліефіри, гідрогелі (наприклад полі(2-гідроксіетил-метакрилат) або полівініловий спирт), полілактиди (патент США 3773919), співполімери L-глутамінової кислоти й гаммаетил-L-глутамату, етиленвінілацетат, що не TM розкладається, співполімери молочної кислоти й гліколевої кислоти, такі як LUPRON DEPOT (ін'єкційні мікросфери, що складаються з співполімера молочної кислоти й гліколевої кислоти й ацетату лейпроліду), що розкладаються, а також полі-D-(-)-3-гідроксимасляну кислоту. Склади, які будуть застосовуватися для введення in vivo, повинні бути стерильними. Це легко здійснюється шляхом фільтрації через мембрани для фільтрації, що стерилізує. Переважно склад винаходу містить один або більше ізотонічний агент у кількості від приблизно 5 мМ до приблизно 350 мМ, як було визначено у даному документі вище. Переважно склад винаходу містить цукор у кількості від приблизно 25 мМ до приблизно 500 мМ, як було визначено вище. Також переважно склад винаходу також містить один або більше з наступних інгредієнтів: антиоксиданти, аскорбінову кислоту, глутатіон, консерванти, наприклад м-крезол, фенол, бензиловий спирт, метилпарабен, пропілпарабен, хлорбутанол, тіомерсал, бензалконіумхлорид, поліетиленгліколь, наприклад ПЕГ 3000, 3350, 4000, 6000, альбумін, людський сироватковий альбумін (HSA), бичачий сироватковий альбумін (BSA), багатоатомний спирт, гліцерин, етанол, манітол, солі, ацетати солей (наприклад ацетат натрію), хлорид магнію, хлорид кальцію, трометамін, ЕДТА (наприклад Na-ЕДТА). Також переважно склад винаходу також містить один або більше стабілізатор, визначений вище, і інгредієнти, також відомі у даній області як "ліопротектант" (lyoprotectant), такі як цукри, цукрові спирти, амінокислоти й декстрани, відомі у даній області. У певному втіленні склад винаходу містить наступні склади у рідкій формі, ліофілізованій формі або у рідкій формі, відновленій з ліофілізованих форм: 15 мг/мл анти-CD20 антитіла II типу, переважно гуманізованого B-Ly1 антитіла, найбільше переважно HuMab, 0,01 % (маса/об'єм) полісорбату 20, 20 мМ L-гістидину, а також 140 мМ хлориду натрію при рН 6,0; або 10 мг/мл анти-CD20 антитіла II типу, переважно гуманізованого B-Ly1 антитіла, найбільше переважно HuMab, 0,01 % (маса/об'єм) полісорбату 20, 20 мМ L-гістидину, а також 140 мМ хлориду натрію при рН 6,0; або 11 UA 101487 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 15 мг/мл анти-CD20 антитіла II типу, переважно гуманізованого B-Ly1 переважно HuMab, можливо від 0,001 до 1 % (маса/об'єм) поверхнево-активної речовини, 20 мМ L-гістидину при рН 6,0; або 10 мг/мл анти-CD20 антитіла II типу, переважно гуманізованого B-Ly1 переважно HuMab, 0,02 % полісорбату 20 (маса/об'єм), 20 мМ L-гістидину, а також 240 мМ трегалози при рН 6,0; або 25 мг/мл анти-CD20 антитіла II типу, переважно гуманізованого B-Ly1 переважно HuMab, 0,02 % полісорбату 20 (маса/об'єм), 20 мМ L-гістидину, і 240 мМ трегалози при рН 6,0; або 25 мг/мл анти-CD20 антитіла II типу, переважно гуманізованого B-Ly1 переважно HuMab, TM 0,02 % (маса/об'єм) полоксамеру 188 , 20 мМ L-гістидину, а також 240 мМ трегалози при рН 6,0; або 25 мг/мл анти-CD20 антитіла II типу, переважно гуманізованого B-Ly1 переважно HuMab, TM 0,01 % (маса/об'єм) полоксамеру 188 , 20 мМ L-гістидину, а також 240 мМ трегалози при рН 6,0; або 25 мг/мл анти-CD20 антитіла II типу, переважно гуманізованого B-Ly1 переважно HuMab, TM 0,01 % (маса/об'єм) полоксамеру 188 , 20 мМ L-гістидину, а також 240 мМ трегалози при рН 6,0; або 25 мг/мл анти-CD20 антитіла II типу, переважно гуманізованого B-Ly1 переважно HuMab, TM 0,1 % (маса/об'єм) полоксамеру 188 , 20 мМ L-гістидину, а також 240 мМ трегалози при рН 6,0; або 25 мг/мл анти-CD20 антитіла II типу, переважно гуманізованого B-Ly1 переважно HuMab, 0,02 % (маса/об'єм) полісорбату 80, 20 мМ L-гістидину, а також 240 мМ трегалози при рН 6,0; або 25 мг/мл анти-CD20 антитіла II типу, переважно гуманізованого B-Ly1 переважно HuMab, 0,1 % (маса/об'єм) полісорбату 80, 20 мМ ацетату, а також 240 мМ трегалози 12 антитіла, найбільше антитіла, найбільше антитіла, найбільше антитіла, найбільше антитіла, найбільше антитіла, найбільше антитіла, найбільше антитіла, найбільше антитіла, найбільше UA 101487 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 при рН 5,5; або 25 мг/мл анти-CD20 антитіла II типу, переважно гуманізованого B-Ly1 антитіла, найбільше переважно HuMab, 0,1 % (маса/об'єм) полісорбату 80, 20 мМ ацетату, а також 140 мМ хлориду натрію при рН 5,5; або 30 мг/мл анти-CD20 антитіла II типу, переважно гуманізованого B-Ly1 антитіла, найбільше переважно HuMab, TM 0,01 % (маса/об'єм) полоксамеру 188 , 20 мМ L-гістидину, а також 200 мМ трегалози при рН 6,5. У кращому втіленні складу відповідно до винаходу склад перебуває у ліофілізованій формі й містить після відновлення з відповідною кількістю води для ін'єкцій: 10 мг/мл анти-CD20 антитіла II типу, переважно гуманізованого B-Ly1 антитіла, найбільше переважно HuMab, 0,02 % (маса/об'єм) полісорбату 20, 20 мМ L-гістидину, а також 240 мМ трегалози при рН 6,0. Цей склад демонструє гарну стабільність при зберіганні його при температурі 2-8 °C і 25 °C з достатньою стійкістю у відношенні фізичних кінцевих пунктів, таких як агрегація, і хімічних кінцевих пунктів, таких як фрагментація. У кращому втіленні складу відповідно до винаходу склад є рідкою формою: 25 мг/мл анти-CD20 антитіла II типу, переважно гуманізованого B-Ly1 антитіла, найбільше переважно HuMab, TM 0,02 % (маса/об'єм) полоксамеру 188 , 20 мМ L-гістидину, а також 240 мМ трегалози при рН 6,0. У кращому втіленні склад застосовують для запобігання або зменшення метастазів або подальшої дисемінації у такого пацієнта, що страждає від CD20-експресуючого раку. Склад застосовують для збільшення тривалості життя такого пацієнта, збільшення виживаності такого пацієнта без прогресії, збільшення тривалості відповіді, що приводить до статистично значимого й клінічно помітного поліпшення стану лікованих пацієнтів, обумовленій за тривалістю життя, виживаності без прогресії, частки відповівших на лікування або тривалості відповіді. У кращому втіленні склад застосовують для збільшення частки відповідей на лікування у групі пацієнтів. У контексті цього винаходу у сполученні зі складом з анти-CD20 антитілом відповідно до винаходу можуть бути використані додаткові інші цитотоксичні, хіміотерапевтичні або протиракові агенти або сполуки, які підсилюють ефект таких агентів. Такі агенти включають, наприклад: алкілуючі агенти або агенти з алкілуючою дією, ® наприклад циклофосфамід (CTX, наприклад цитоксан ), хлорамбуцил (CHL, наприклад ® ® ® лейкеран ), цисплатин (CisP, наприклад platinol ), бусульфан (наприклад мілеран ), мелфалан, кармустин (BCNU), стрептозотоцин, триетиленмеламін (ТЕА), мітоміцин C тощо; ® антиметаболіти, такі як метотрексат (MTX), етопозид (VP16, наприклад вепезид ), 6меркаптопурин (6MP), 6-тіогуанін (6TG), цитарабін (Ara-C), 5-фторурацил (5-FU), капецитабін ® (наприклад кселода ), дакарбазин (DTIC) тощо; антибіотики, такі як актиноміцин D, ® доксорубіцин (DXR, наприклад адріаміцин ), даунорубіцин (дауноміцин), блеоміцин, мітраміцин тощо; алкалоїди, такі як алкалоїди Вінка, наприклад вінкристін (VCR), вінбластин тощо; і інші ® протипухлинні препарати, такі як паклітаксел (наприклад таксол ) і похідні паклітакселу, ® цитостатичні агенти, глюкокортикоїди, такі як дексаметазон (DEX, наприклад декадрон ) і кортикостероїди, такі як преднізон, нуклеозидні інгібітори ферментів, такі як гідроксисечовину, ферменти, амінокислоти, що руйнують, такі як аспарагіназу, лейковорин і інші похідні фолієвої кислоти, і подібні різні протипухлинні агенти. Як додатковий засіб також можуть бути ® використані наступні агенти: аміфостин (наприклад етіол ), дактиноміцин, мехлоретамін (азотистий аналог іприту), стрептозоцин, циклофосфамід, ломустин (CCNU), ліпосомальний 13 UA 101487 C2 ® 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ® доксорубіцин (наприклад доксил ), гемцитабін (наприклад гемзар ), ліпосомальний ® даунорубіцин (наприклад дауноксом ), прокарбазин, мітоміцин, доцетаксел (наприклад ® таксотер ), алдеслейкін, карбоплатин, оксаліплатин, кладрибін, камптотецин, CPT 11 (іринотекан), 10-гідроксіетил-7-камптотецин (SN38), флоксуридин, флударабін, іфосфамід, ідарубіцин, месна, бета-інтерферон, альфа-інтерферон, мітоксантрон, топотекан, лейпролід, мегестрол, мелфалан, меркаптопурин, плікаміцин, мітотан, пегаспаргаза, пентостатин, піпоброман, плікаміцин, тамоксифен, теніпозид, тестолактон, тіогуанін, тіотепа, гірчичний урацил, вінорельбін, хлорамбуцил. Переважно використовується комбінація для лікування з анти-CD20 антитілом без таких додаткових агентів. Застосування цитотоксичних і протипухлинних агентів, описаних вище, також як і антипроліферативних специфічних до мішеней протипухлинних препаратів, таких як інгібітори протеїнкінази у хіміотерапевтичних схемах, як правило, добре охарактеризовано в області терапії раку, і їхнє застосування тут засноване на тих же міркуваннях моніторингу толерантності й ефективності й для контролю шляхів введення й доз із деякими змінами. Наприклад, фактичні дози цитотоксичних агентів можуть варіювати залежно від відповіді культури клітин пацієнта, визначеного за допомогою способів культивування тканин. Як правило, доза буде знижена у порівнянні з кількістю, що використовується під час відсутності додаткових інших агентів. Типові дози ефективного цитотоксичного агента можуть перебувати у діапазоні, рекомендованому виготовлювачем, і, будучи позначеними як відповіді in vitro або відповіді на тваринних моделях, вони можуть бути скорочені до приблизно одного порядку величини концентрації або кількості. Таким чином, фактична доза буде залежати від рішення лікаря, стану пацієнта, а також ефективності терапевтичного способу, заснованого на реакції in vitro первинно культивованих злоякісних клітин або культивованого зразка тканини, або на реакції, що спостерігається на відповідних тваринних моделях. У контексті даного винаходу можна вводити іонізуюче опромінення в ефективній кількості, і/або на додаток до складу з анти-CD20 антитілом відповідно до винаходу можна використовувати радіоактивний препарат. Джерело випромінювання може бути зовнішнім або внутрішнім для пацієнта, що одержує лікування. Якщо джерело є зовнішнім стосовно пацієнта, то терапія називається зовнішньою променевою терапією (EBRT, external beam radiation therapy). Якщо джерело є внутрішнім стосовно пацієнта, то терапія називається брахітерапією (BT, brachytherapy). Радіоактивні атоми для застосування у контексті даного винаходу можуть бути вибрані з групи, що включає радій, цезій-137, іридій-192, америцій-241, золото-198, кобальт-57, мідь-67, технецій-99, йод-123, йод-131 і індій-111, але не обмежуваної ними. Також можна позначити антитіла такими радіоактивними ізотопами. Переважно склад з анти-CD20 антитілом відповідно до винаходу застосовується без такого іонізуючого опромінення. Радіаційна терапія є стандартним способом контролю нерезектабельної або неоперабельної пухлини й/або метастазів пухлини. Поліпшені результати були помічені при об'єднанні променевої терапії з хіміотерапією. Променева терапія заснована на тому принципі, що високі дози випромінювання, які поступають у цільову область, приводять до загибелі репродуктивних клітин як пухлинних, так і нормальних тканин. Режим дози опромінення, як правило, задається у формі поглиненої дози випромінювання (Гр), часу й фракціонування, і повинен бути ретельно визначений онкологом. Кількість радіації, що одержує пацієнт, буде залежати від різних факторів, але двома найбільше важливими є локалізація пухлини стосовно інших критичних структур або органів тіла й ступінь поширення пухлини. Типовий курс лікування для пацієнта, що проходить променеву терапію, тече за графіком від 1 до 6 тижнів із сумарною дозою від 10 до 80 Гр, що вводиться пацієнтові 5 днів на тиждень частинами приблизно від 1,8 до 2,0 Гр у день. У кращому втіленні даного винаходу введення людям з пухлиною складу відповідно до винаходу й радіація діють синергічно. Інакше кажучи, гальмування пухлинного росту за допомогою агентів, що містять комбінацію винаходу, підсилюється у сполученні з випромінюванням, можливо з додатковими хіміотерапевтичними або протипухлинними агентами. Параметри ад'ювантної радіаційної терапії містяться, наприклад, у WO 99/60023. Склад з антитілом вводять пацієнтові відповідно до відомих способів шляхом внутрішньовенного введення у вигляді болюса або безперервної інфузії протягом періоду часу, внутрішньом'язовим, внутрішньочеревинним, внутрішньоспиномозковим, підшкірним, внутрішньосуглобним, інтрасиновіальним або інтратекальним шляхом. Внутрішньовенне або підшкірне введення антитіл є кращим. Винахід також містить набір, що характеризується вмістом контейнера, композиції всередині контейнера, що містить зазначений склад антитіла анти-CD20, а також вкладиш із інструкцією користування складу для введення зазначеного складу з анти-CD20 антитілом пацієнтові, що страждає від CD20-експресуючого раку. 14 UA 101487 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Термін "вкладиш" відноситься до інструкцій, що включається звичайно у комерційні впакування терапевтичних продуктів, які можуть містити інформацію про показання, застосування, дозування, введення, протипоказання і/або застереження, що стосуються використання таких терапевтичних продуктів. У кращому втіленні продукт виробництва контейнер може також включати фармацевтично прийнятний носій. Продукт виробництва може також включати стерильний розчинник, що переважно зберігається в окремому додатковому контейнері. Використовуваний у даному документі термін "фармацевтично прийнятний носій" включає будь-які або всі матеріали, сумісні з введенням лікарських препаратів, включаючи розчинники, дисперсні середовища, покриття, антибактеріальні й протигрибкові засоби, ізотонічні й затримуючі абсорбцію агенти, а також інші матеріали й сполуки, сумісні з введенням лікарських препаратів. За винятком випадків, коли будь-яке звичайне середовище або агент несумісні з активною сполукою, її застосування у композиції винаходу може розглядатися. Додаткові активні сполуки також можуть бути включені у композиції. У ще одному втіленні винаходу склад відповідно до винаходу містить анти-CD20 антитіло I типу, що вводять разом з анти-CD20 антитілом II типу відповідно до винаходу. Склади відповідно до винаходу можуть бути двома окремими складами для кожного з анти-CD20 антитіл. Альтернативно склад у цьому випадку може також містити обоє антитіла в одному складі. У ще одному втіленні винаходу склад відповідно до винаходу містить анти-CD20 антитіло, і зазначене анти-CD20 антитіло вводять разом з анти-Bcl-2 активним агентом. Термін "Bcl-2", що використовується у даному документі, відноситься до білка Bcl-2 (ID у Swiss Prot (Швейцарській базі даних по амінокислотних послідовностях) № P10415), члену сімейства білків Bcl-2. Термін "активний агент анти-Bcl-2" містить у собі "анти-Bcl-2 антизначеннєві нуклеотиди" і "Bcl-2 інгібітори". "Анти-Bcl-2 антизначеннєві нуклеотиди" зменшують рівні мРНК Bcl-2 і знижують експресію білка Bcl-2. Приклади таких анти-Bcl-2 антизначеннєвих нуклеотидів включають облімерсен і SPC-2996. Термін "ABT-737", що використовується у даному документі, означає N[4-[4-(4'-хлорбіфеніл-2-ілметил) піперазин-1-іл]бензоїл]-3-[3-(диметиламіно)-1(R)(фенілсульфанілметил)пропіламіно]-4-нітробензенсульфонамід; 4-[4-(4'-хлорбіфеніл-2ілметил)піперазин-1-іл]-N-[3-[3-(диметиламіно)-1(R)-(фенілсульфанілметил)пропіламіно]-4нітрофенілсульфоніл]бензамід, Bcl-2 інгібітор, що описаний у WO 2006/099667 або Corey, S., et al., Cancer Cell (2005) 5-6. Термін "BT-263", що використовується у даному документі, означає Bcl-2 інгібітор, описаний у патенті США 2007027135. Переважно активний агент анти-Bcl-2 вибирають серед облімерсену, SPC-2996, TA-402, госиполу, AT-101, препарату Obatoclax mesylate (обатоклакс мезилат), A-371191, A-385358, A-438744, ABT-737, AT-101, BL-11, BL-193, GX-15-003, 2-метоксіантиміцину A3, HA-14-1, KF-67544, пурпурогаліну, TP-TW-37, YC-137 і Z-24. Переважно активним агентом анти-Bcl-2 є Bcl-2-білокєднальний інгібітор з IC50 анти-Bcl-2 інгібіторної активності 5 мкМ або менше. Такий Bcl-2-білокєднальний інгібітор переважно вибирають серед госиполу, AT-101, препарату Obatoclax mesylate, ABT-263 і ABT-737, більш переважно з ABT-263 або ABT-737. У ще одному втіленні винаходу склад відповідно до винаходу містить анти-CD20 антитіло, і зазначене анти-CD20 антитіло вводять разом з інгібітором протеасоми. Термін "інгібітор протеасоми", що використовується у даному документі, відноситься до агентів, які інгібують активність протеасоми 26S. Такі інгібітори протеасом включають, зокрема, похідні пептидів, такі як альдегіди пептидів (наприклад MG132, MG115, CEP-1615, PSI або специфічний інгібітор імунопротеасоми IPSI-001 (Cbz-LnL-СНО = N-карбобензилокси-лейцил-норлейцинал, див. патент США 20060241056), боронати пептидів (наприклад бортезоміб (PS-341) або DFLB), епоксикетони пептидів (наприклад епоксоміцин, дигідроепонеміцин або похідне епонеміцину карфілзоміб (PR-171)) або вінілсульфони пептидів (наприклад NLVS), і непептидні похідні, такі як саліноспорамід А (NPI-0052), похідні саліноспораміду А, лактацистин або похідні лактацистину (наприклад кластолактацистин-L-лактон (омуралід) або PS-519). Описано різні типи й структури зазначених інгібіторів протеасом, наприклад, у Kisselev, A.L., et al., Chem Biol (2001) 739-758, WO 2004/004749 і Joazeiro, C., et al., Res 66(16) (2006) 7840-7842), Kanagasabaphy, et al., Curr Opin Investig Drugs 8 (2007) 447-51, Adams, J., Nat Rev Cancer 4 (2004) 349-360 і у патенті США 20060241056. Переважно такий інгібітор протеасом вибирають серед пептидних альдегідів (переважно Nкарбобензилоксилейцилнорлейцинал (IPSI-001)), пептидних боронатів (переважно бортезоміб (PS-341)), пептидних епоксикетонів (переважно похідне епоксиміцину карфілзоміб (PR-171)) або саліноспорамід А (NPI-0052). Більш переважно такий інгібітор протеасом вибирають серед 15 UA 101487 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50бортезомібу (PS-341), карфілзомібу (PR-171), саліноспораміду А (NPI-0052) або Nкарбобензилокси-лейцилнорлейциналу (IPSI-001). У кращому втіленні інгібітор протеасом є пептидним похідним, вибраним серед пептидних альдегідів (переважно N-карбобензилоксилейцилнорлейцинал (IPSI-001)), пептидних боронатів (переважно бортезоміб (PS-341)) або пептидних епоксикетонів. В іншому кращому втіленні інгібітор протеасом є пептидним боронатом (переважно бортезомібом (PS-341), див. наприклад, Adams, Cur. Opin. Chem Biol. 6 (2002) 493-500 і патент США 5780454)). Переважно інгібітор протеасом має антипротеасомну інгібіторну активність з IC50 5 мкМ або менше, більш переважно 1 мкМ або менше. Клітинний аналіз для виявлення таких інгібіторів протеасом і для визначення IC50 антипротеасомної інгібіторної активності (через послідовні розведення й розрахунки з використанням відповідної нелінійної кривої (XLfit програмного забезпечення (ID Business Solution Ltd, Гілфорд, графство Суррей, Великобританія)) описаний у Moravec, et al., Cell Notes 15 (2006) 4-7 і використовує реагент для клітинного аналізу Proteasome-Glo™ з Promega з клітинами U266 (людська плазматична мієлома). Цей аналіз "вимір з додаванням мікса" вимірює хімотрипсин-подібну протеазну активність, пов'язану з протеасомою у культивованих клітинах. Крім IPSI-001 (Cbz-LnL-СНО = N-карбобензилоксилейцилнорлейцинал) кращими інгібіторами протеасом також є наступні похідні пептидів патенту США 20060241056: N-карбобензилокси-гомофенілаланіл-фенілаланілал, N-карбобензилокси-лейцилфенілаланілал, N-карбобензилокси-аланіл-фенілаланілал, N-карбобензилокси-гліцил-пролілаланіл-фенілаланілал, N-карбобензилокси-гліцил-проліл-фенілаланіл-фенілаланілал, Nкарбобензилокси-гліцил-фенілаланіл-фенілаланілал, N-карбобензилокси-лейцилнорлейцинборонова кислота, N-карбобензилокси-фенілаланіл-фенілаланінборонова кислота, N-карбобензилокси-гомофенілаланіл-фенілаланінборонова кислота, N-карбобензилоксилейцил-фенілаланінборонова кислота, N-карбобензилокси-гліцил-проліл-аланілфенілаланінборонова кислота, N-карбобензилокси-гліцил-проліл-фенілаланілфенілаланінборонова кислота, N-карбобензилокси-лейцил-лейцил-фенілаланінборонова кислота, N-карбобензилокси-гліцил-фенілаланіл-фенілаланінборонова кислота, Nкарбобензилокси-лейцил-норлейцин-метилвінілсульфон, N-карбобензилокси-фенілаланілфенілаланін-метилвінілсульфон, N-карбобензилокси-гомофенілаланін-фенілаланінметилвінілсульфон, N-карбобензилокси-лейцил-фенілаланін-метилвінілсульфон, Nкарбобензилокси-аланіл-фенілаланін-метилвінілсульфон, N-карбобензилокси-гліцил-пролілаланіл-фенілаланін-метилвінілсульфон, N-карбобензилокси-гліцил-проліл-фенілаланілфенілаланін-метилвінілсульфон, N-карбобензилокси-лейцил-лейцил-фенілаланінметилвінілсульфон, N-карбобензилокси-гліцил-фенілаланіл-фенілаланін-метилвінілсульфон, Nкарбобензилокси-лейцил-норлейцин-епоксикетон, N-карбобензилокси-фенілаланілфенілаланін-епоксикетон, N-карбобензилокси-гомофенілаланіл-фенілаланін-епоксикетон, Nкарбобензилокси-лейцил-фенілаланін-епоксикетон, N-карбобензилокси-аланіл-фенілаланінепоксикетон, N-карбобензилокси-гліцил-проліл-аланіл-фенілаланін-епоксикетон, Nкарбобензилокси-гліцил-проліл-фенілаланіл-фенілаланін-епоксикетон, N-карбобензилоксилейцил-лейцил-фенілаланін-епоксикетон і N-карбобензилокси-гліцил-фенілаланіл-фенілаланінепоксикетон. Наступні приклади й графічні матеріали приводяться з метою полегшити розуміння даного винаходу, дійсні межі якого викладені у прикладеній формулі винаходу. Необхідно розуміти, що у викладених процедурах можуть бути зроблені зміни без відступу від сутності винаходу. ПРИКЛАДИ Приклад 1 Були виготовлені наступні склади у рідкій, ліофілізованій формі або у рідкій формі, відновленій з ліофілізованої: 15 мг/мл HuMab, 0,01 % (маса/об'єм) полісорбату 20, 20 мМ L-гістидину, а також 140 мМ хлориду натрію, при рН 6,0; 55 60 10 мг/мл HuMab, 0,01 % (маса/об'єм) полісорбату 20, 20 мМ L-гістидину, а також 140 мМ хлориду натрію, при рН 6,0; 16 UA 101487 C2 15 мг/мл HuMab, 20 мМ L-гістидину, при рН 6,0; 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10 мг/мл HuMab, 0,02 % (маса/об'єм) полісорбату 20, 20 мМ L-гістидину, а також 240 мМ трегалози, при рН 6,0; 25 мг/мл HuMab, 0,02 % (маса/об'єм) полісорбату 20, 20 мМ L-гістидину, а також 240 мМ трегалози, при рН 6,0. Також виготовляють ліофілізовану форму, яка містить після відновлення з відповідною кількістю води для ін'єкцій: 10 мг/мл HuMab, 0,02 % (маса/об'єм) полісорбату 20, 20 мМ L-гістидину, 240 мМ трегалози, при рН 6,0. Цей склад демонструє гарну стабільність при зберіганні його при температурі 2-8 °C і 25 °C з достатньою стійкістю у відношенні фізичних кінцевих пунктів, таких як агрегація, і хімічних кінцевих пунктів, таких як фрагментація. Рідкі й ліофілізовані склади лікарських продуктів для парентерального введення відповідно до винаходу були розроблені у такий спосіб: Виготовлення рідких складів. Склади HuMab були виготовлені шляхом гомогенізації розчинів HuMab у буфері для продукції (наприклад, 20 мМ гістидиновому буфері при рН приблизно 6,0 або 20 мМ гістидиновому буфері при рН приблизно 6,0, що містить 140 мМ хлориду натрію й 0,01 % (маса/об'єм) полісорбату 20). Склади HuMab також можна одержати шляхом припасування концентрації білка до потрібної концентрації за допомогою розведення буфером. При необхідності додавали ексципієнти для стабілізації білка й для припасування тонічності, їх можна додавати у розчиненій формі або альтернативно у твердому виді. При необхідності у склади додавали поверхнево-активну речовину у вигляді стокового розчину. Всі склади стерилізували шляхом фільтрації за допомогою фільтрів з розміром пор 0,22 мкм, асептично аліквотували у стерильні скляні флакони й закривали гумовими пробками й кришками Alucrimp. Ці склади зберігали при різних температурах протягом різних інтервалів часу й використовували для аналізу у час, зазначений в окремих пунктах. Склади аналізували 1) за допомогою УФспектрофотометрії, 2) за допомогою ексклюзійної хроматографії (size exclusion chromatography, SEC), 3) на наявність видимих і невидимих часток, 4) за допомогою іонообмінної хроматографії (ion exchange chromatography, IEC) і 5) на мутність розчину. Виготовлення ліофілізованих складів. Розчин HuMab або готовили відповідно до опису вище для рідких складів, або виготовляли як гомогенізований розчин HuMab з HuMab у 20мМ гістидиновому буфері при рН приблизно 6,0, що містить цукор і поверхнево-активну речовину. Всі склади стерилізували шляхом фільтрації за допомогою фільтрів з розміром пор 0,22 мкм і асептично аліквотували у стерильні скляні флакони. Флакони частково закривали гумовими пробками, що підходять для використання у процесах ліофілізації, і переносили у сушильну камеру ліофілізатора. У рамках даного винаходу використовується будь-який спосіб ліофілізації, відомий у даній області. Наприклад, процес ліофілізації, що використовується для даного дослідження, включає охолодження складу з кімнатної температури до приблизно 5 °C (попереднє охолодження), а потім заморожування при -40 °C (заморозку I) зі зміною температури від приблизно 1 °C/хв до 5 °C/хв. На першому етапі сушіння може відбуватися збільшення температури від -40 °C до -30 °C зі швидкістю від 0,3 до 0,5 °C/хв, а потім вводиться сушіння при температурі -30 °C протягом щонайменше 50 годин при тиску у камері від приблизно 75 до 80 мТорр. На другому етапі сушіння може відбуватися збільшення 17 UA 101487 C2 5 10 15 20 25 30 температури від -30 °C до 25 °C зі швидкістю від 0,1 до 0,3 °C/хв, а потім вводиться сушіння при температурі 25 °C протягом щонайменше 50 годин при тиску у камері приблизно від 50 до 80 мТорр (застосовуваний графік сушіння наведений у таблиці 1). Визнано, що склади HuMab, які були висушені з використанням описаних процесів ліофілізації, зручні для швидкого відновлення протягом приблизно 2-3 хвилин. Всі ліофілізовані маси у даному дослідженні мали залишковий вміст води приблизно від 0,1 до 1,0 % за даними дослідження способом Карла Фішера. Флакони з ліофілізатом зберігали при різних температурах протягом різних інтервалів часу. Ліофілізовані склади відновлювали відповідним об'ємом води для ін'єкцій (WFI, water for injection), а потім 1) аналізували за допомогою УФ-спектрофотометрії, 2) визначали час відновлення, 3) аналізували за допомогою ексклюзійної хроматографії (size exclusion chromatography, SEC), 4) за допомогою іонообмінної хроматографії (ion exchange chromatography, IEC), 5) визначали наявність видимих і невидимих часток, 6) визначали мутність розчину. Ексклюзійну хроматографію (SEC) проводили для виявлення розчинних високомолекулярних груп (агрегатів) і низькомолекулярних продуктів гідролізу у складах. Цей спосіб застосовували з придатним інструментом для ВЕРХ, оснащеним УФ-детектором (довжина хвилі виявлення 280 нм) і колонкою Zorbax GF-250 (9,4 × 250 мМ, Agilent); як рухливу фазу використовували 200 мМ розчину фосфату натрію з рН 7,0. Іонообмінну хроматографію (IEC) проводили для виявлення продуктів хімічної деградації, що змінюють сумарний заряд HuMab у складах. Цей спосіб застосовували з придатним інструментом для ВЕРХ, оснащеним УФ-детектором (довжина хвилі виявлення 220 і 280 нм) і колонкою Dionex Propac WCX-10 (4 мм х 250 мм); як рухливу фазу А і В використовували відповідно 10 мМ натрій-фосфатний буфер у воді з рН 6,0 і 10 мМ натрій-фосфатний буфер із рН 6,0+0,75 NaCl, зі швидкістю потоку 1,0 мл/хв. Для визначення концентрації білка вводили УФ-спектроскопію на спектрофотометрі Varian Cary Bio при довжині хвилі 280 нм. Для визначення мутності вимірювали опалесценцію у FTU (одиниці мутності) за допомогою турбідиметра HACH 2100AN при кімнатній температурі. Зразки аналізували на наявність невидимих часток за допомогою HIAC Royco PharmaSpec (HRLD-150), а також видимих часток за допомогою інструмента для візуального контролю Seidenader V90-T. Таблиця Цикл ліофільного сушіння Етап Попереднє охолодження Заморозка 1 Первинне сушіння Вторинне сушіння 35 Температура (°C) 5 °C -40 °C -30 °C +25 °C Швидкість наростання (°C/хв) 0,0 1,0 0,5 0,2 Час витримування (хв) 60 120 3720 300 Контрольна точка вакууму (мТорр) 80 80 Дані про стабільність рідких складів лікарського продукту HuMab відповідно до даного винаходу Склад 15 мг/мл HuMab, 20 мМ L-гістидину, pH 6,0, Час SEC SEC Умови Білок IEC значні зберігання Мономери HMW Мутність зберігання (мг/мл) розходження (місяці) (%) (%) Вихідні 14,5 98,4 1,6 5,9 Немає 1 14,7 98,1 1,8 5,9 Немає 2-8 °C 3 15,5 97,9 2,0 6,1 Немає 6 14,2 97,7 2,1 5,7 Немає 1 14,8 98,0 1,7 5,7 Немає 25 °C 3 15,0 97,8 1,8 5,8 Немає 6 14,6 97,3 1,9 6,1 Є 18 Видимі частки Невидимі частки Задов. Задов. Задов. Задов. Задов. Задов. Незад. Задов. Задов. Задов. Задов. Задов. Задов. Задов. UA 101487 C2 Час SEC SEC Умови Білок IEC значні зберігання Мономери HMW Мутність зберігання (мг/мл) розходження (місяці) (%) (%) 1 14,8 97,6 1,6 5,8 Немає 40 °C 3 15,1 96,1 1,9 6,2 Є 1 14,8 98,4 1,6 6,3 н/в -20 °C 3 15,1 98,1 1,8 6,2 Немає 6 14,3 97,7 2,3 6,1 Немає 3 15,0 98,2 1,6 5,8 Немає -80° 6 14,9 98,4 1,6 5,7 Немає Видимі частки Невидимі частки Задов. Задов. Незад. Незад. Незад. Незад. Незад. Задов. Задов. Задов. Задов. Задов. Задов. Задов. н/в: не визначено. 5 Задов.: від вільного до істотно вільного від видимих часток, не більше 6000 часток в ≥ 10 мкмоль/контейнер, не більше 600 часток в ≥ 25 мкмоль/контейнер. Склад 10 мг/мл HuMab, 20 мМ L-гістидину, 240 мМ трегалози, 0,02 % (маса/об'єм) полісорбату 20, pH 6,0, Час SEC Умови Білок SEC IEC значні Видимі Невидимі зберігання Мономери Мутність зберігання (мг/мл) HMW (%) розходження частки частки (місяці) (%) Вихідні 11,0 98,4 1,6 3,9 Немає Задов. Задов. 1 11,1 98,3 1,6 4,0 Немає Незад. Задов. 2-8 °C 3 11,3 98,2 1,7 6,6 Немає Незад. Задов. 6 10,8 98,1 1,7 8,3 Немає Незад. Задов. 1 11,0 98,3 1,4 6,4 Немає Незад. Задов. 25 °C 3 11,3 98,2 1,5 6,7 Немає Незад. Задов. 6 11,2 98,8 1,4 6,7 Є Незад. Задов. 1 11,1 98,0 1,3 7,5 Немає Незад. Задов. 40 °C 3 11,2 96,7 1,5 4,9 Є Незад. Задов. 1 11,0 98,5 1,5 3,4 Немає Задов. Задов. -20 °C 3 11,2 98,3 1,6 4,0 Немає Задов. Задов. 6 н/в н/в н/в н/в н/в н/в н/в 3 11,2 98,3 1,6 3,7 Немає Задов. Задов. -80 °C 6 11,0 98,5 1,5 3,8 Немає Задов. Задов. н/в: не визначено. 10 Задов.: від вільного до істотно вільного від видимих часток, не більше 6000 часток в ≥ 10 мкмоль/контейнер, не більше 600 часток в ≥ 25 мкмоль/контейнер. Дані про стабільність ліофілізованих складів лікарського продукту HuMab відповідно до даного винаходу Склад 10 мг/мл HuMab, 20 мМ L-гістидину, 240 мМ трегалози, 0,02 % (маса/об'єм) полісорбату 20, pH 6,0, 15 Час SEC Умови Білок SEC IEC значні Видимі Невидимі зберігання Мономери Мутність зберігання (мг/мл) HMW (%) розходження частки частки (місяці) (%) Вихідні 10,4 98,9 1,1 2,9 54,8 Задов. Задов. 1 10,5 98,9 1,1 2,9 н/в Задов. Задов. 3 10,4 98,9 1,1 2,9 н/в Задов. Задов. 2-8 °C 6 10,4 98,9 1,1 3,4 53,1 Задов. Задов. 12 10,4 98,9 1,1 3,1 56,6 Задов. Задов. 24 10,3 98,9 1,1 3,1 55,6 Задов. Задов. 1 10,2 98,9 1,1 2,9 н/в Задов. Задов. 3 105 98,9 1,1 2,9 н/в Задов. Задов. 25 °C 6 10,4 98,9 1,1 3,3 52,9 Задов. Задов. 12 10,4 98,8 1,2 3,1 56,9 Задов. Задов. 19 UA 101487 C2 Час SEC Умови Білок SEC IEC значні Видимі Невидимі зберігання Мономери Мутність зберігання (мг/мл) HMW (%) розходження частки частки (місяці) (%) 1 10,5 98,9 1,1 3,0 н/в Задов. Задов. 40 °C 3 10,4 98,9 1,1 3,0 н/в Задов. Задов. 6 10,5 98,9 1,1 34 50,9 Задов. Задов. н/в: не визначено. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Задов.: від вільного до істотно вільного від видимих часток, не більше 6000 часток в ≥ 10 мкмоль/контейнер, не більше 600 часток в ≥ 25 мкмоль/контейнер. Приклад 2 Були виготовлені наступні склади або у рідкій, або у ліофілізованій формі, або у рідкій формі, відновленій з ліофілізованої: 25 мг/мл HuMab, TM 0,02 % (маса/об'єм) полоксамеру 188 , 20 мМ L-гістидину, а також 240 мМ трегалози при pH 6,0; або 25 мг/мл HuMab, TM 0,01 % (маса/об'єм) полоксамеру 188 , 20 мМ L-гістидину, а також 240 мМ трегалози при pH 6,0; або 25 мг/мл HuMab, TM 0,1 % (маса/об'єм) полоксамеру 188 , 20 мМ L-гістидину, а також 240 мМ трегалози при pH 6,0; або 25 мг/мл HuMab, 0,02 % (маса/об'єм) полісорбату 80, 20 мМ L-гістидину, а також 240 мМ трегалози при pH 6,0; або 25 мг/мл HuMab, 0,1 % (маса/об'єм) полісорбату 80, 20 мМ ацетату, а також 240 мМ трегалози при pH 5,5; або 25 мг/мл HuMab, 0,1 % (маса/об'єм) полісорбату 80, 20 мМ ацетату, а також 140 мМ хлориду натрію при pH 5,5; або 30 мг/мл HuMab, TM 0,01 % (маса/об'єм) полоксамеру 188 , 20 мМ L-гістидину, а також 200 мМ трегалози при pH 6,5. Рідкі й ліофілізовані склади лікарського препарату для парентерального введення готовили у такий спосіб: Виготовлення рідких складів. 20 UA 101487 C2 5 10 1520 25 30 35 40 45 50 55 Склади HuMab виготовляли шляхом гомогенізації розчинів HuMab у буфері для продукції (наприклад, 20 мМ гістидиновому буфері при рН приблизно 6,0, що містить TM 240 мМ трегалози й 0,02 % (маса/об'єм) полоксамеру 188 ). Склади HuMab також можна одержати шляхом діафільтрації 10-40 мг/мл розчинів HuMab у буфері для продукції (наприклад, 20 мМ гістидиновому буфері при рН приблизно 6,0) шляхом тангенційнопотокової фільтрації (TFF, tangential flow filtration) для підвищення концентрації білка вище цільової концентрації білка й для заміни буфера. Склади HuMab також можна одержати шляхом припасування концентрації білка до потрібної концентрації за допомогою розведення буфером. Для стабілізації білка й для припасування тонічності додавали ексципієнти у розчиненій формі або альтернативно у твердому виді. При необхідності у склади додавали поверхнево-активну речовину у вигляді стокового розчину. Всі склади стерилізували шляхом фільтрації за допомогою фільтрів з розміром пор 0,22 мкм, асептично аліквотували у стерильні скляні флакони й закривали гумовими пробками й кришками Alucrimp. Ці склади зберігали при різних температурах протягом різних інтервалів часу й використовували для аналізу у час, зазначений в окремих пунктах. Склади аналізували 1) за допомогою УФ-спектрофотометрії, 2) за допомогою ексклюзійної хроматографії (size exclusion chromatography, SEC), 3) на наявність видимих і невидимих часток, 4) за допомогою іонообмінної хроматографії (ion exchange chromatography, IEC) і 5) на мутність розчину. Виготовлення ліофілізованих складів. Розчини HuMab готовили відповідно до опису вище для рідких складів. Всі склади стерилізували шляхом фільтрації за допомогою фільтрів з розміром пор 0,22 мкм і асептично аліквотували у стерильні скляні флакони. Флакони частково закривали гумовими пробками, що підходять для використання у процесах ліофілізації, і переносили у сушильну камеру ліофілізатора. У рамках даного винаходу використовується будь-який спосіб ліофілізації, відомий у даній області. Наприклад, процес ліофілізації, що використовується для даного дослідження, включає охолодження складу з кімнатної температури до приблизно 5 °C (попереднє охолодження), а потім заморожування при -40 °C (заморозку I) зі зміною температури від приблизно 1 °C/хв до 5 °C/хв. На першому етапі сушіння може відбуватися збільшення температури від -40 °C до -30 °C зі швидкістю від 0,3 до 0,5 °C/хв, а потім вводиться сушіння при температурі -30 °C протягом щонайменше 50 годин при тиску у камері приблизно від 75 до 80 мТорр. На другому етапі сушіння може відбуватися збільшення температури від 30 °C до 25 °C зі швидкістю від 0,1 до 0,3 °C/хв, а потім вводиться сушіння при температурі 25 °C протягом щонайменше 50 годин при тиску у камері приблизно від 50 до 80 мТорр (застосовуваний графік сушіння наведений у таблиці 1). У складах HuMab, які були висушені з використанням описаних процесів ліофілізації, був виявлений залишковий вміст води приблизно від 0,1 до 1,0 % за даними дослідження способом Карла Фішера. Флакони з ліофілізатом зберігали при різних температурах протягом різних інтервалів часу. Ліофілізовані склади відновлювали відповідним об'ємом води для ін'єкцій (WFI, water for injection), а потім 1) аналізували за допомогою УФ-спектрофотометрії, 2) аналізували за допомогою ексклюзійної хроматографії (size exclusion chromatography, SEC), 3) за допомогою іонообмінної хроматографії (ion exchange chromatography, IEC), 4) визначали наявність видимих і невидимих часток, 5) визначали мутність розчину. Ексклюзійну хроматографію (SEC) проводили для виявлення розчинних високомолекулярних груп (агрегатів) і низькомолекулярних продуктів гідролізу у складах. Цей спосіб застосовували з придатним інструментом для ВЕРХ, оснащеним УФ-детектором (довжина хвилі виявлення 280 нм) і колонкою Zorbax GF-250 (9,4 × 250 мМ, Agilent) або TSKgel G3000 SWXL (7,8 × 300 мМ); як рухливу фазу використовували 200 мМ розчину фосфату натрію з рН 7,0 або 250 мМ розчину хлориду калію у 200 мМ розчині фосфату калію з рН 7,0. Іонообмінну хроматографію (IEC) проводили для виявлення продуктів хімічних деградацій, що змінюють сумарний заряд HuMab у складах. Цей спосіб застосовували з придатним інструментом для ВЕРХ, оснащеним УФ-детектором (довжина хвилі виявлення 220 і 280 нм) і колонкою Dionex Propac WCX-10 (4 × 250 мМ). Як рухливу фазу А і В використовували відповідно 10 мМ натрій-фосфатний буфер у воді з рН 6,0 і 10 мМ натрій-фосфатний буфер із рН 6,0+0,75 NaCl, зі швидкістю потоку 1,0 мл/хв. Для визначення концентрації білка вводили УФ-спектроскопію на спектрофотометрі Varian Cary Bio або Perkin Elmer при довжині хвилі 280 нм. Для визначення мутності вимірювали опалесценцію у FTU (одиниці мутності)за допомогою турбідиметра HACH 2100AN при кімнатній температурі. 21 UA 101487 C2 Зразки аналізували на наявність невидимих часток за допомогою HIAC Royco PharmaSpec (HRLD-150), а також видимих часток за допомогою інструмента для візуального контролю Seidenader V90-T. Таблиця Цикл ліофільного сушіння Етап Попереднє охолодження Заморозка 1 Первинне сушіння Вторинне сушіння Температура (°C) 5 °C -40 °C -30 °C +25 °C Швидкість наростання (°C/хв) 0,0 1,0 0,5 0,2 Час витримування (хв) 60 120 3720 300 Контрольна точка вакууму (мТорр) 80 80 5 Дані стабільності рідких складів лікарського продукту HuMab Склад 25 мг/мл HuMab, 20 мМ L-гістидину, 240 мМ трегалози, 0,02 % (маса/об'єм) TM полоксамеру 188 , pH 6,0, Час SEC Умови Білок SEC IEC значні Видимі Невидимі зберігання Мономери Мутність зберігання (мг/мл) HMW (%) розходження частки частки (місяці) (%) Вихідні 25,7 98,7 1,3 6,4 61,6 Задов. Задов. 2-8 °C 1 25,6 98,7 1,3 6,0 62,0 Задов. Задов. 3 26,1 98,6 1,3 5,9 61,0 Задов. Задов. 25 °C 1 25,7 98,5 1,4 6,5 62,0 Задов. Задов. 3 26,0 97,9 1,5 5,9 58,5 Задов. Задов. 40 °C 1 25,7 97,9 1,6 6,6 52,6 Задов. Задов. 3 25,7 91,0 2,4 6,7 33,6 Задов. Задов. -80 °C 3 25,6 98,7 1,3 6,2 60,9 Задов. Задов. -20 °C 3 25,5 98,7 1,3 6,3 60,8 Задов. Задов. 10 Задов.: від вільного до істотно вільного від видимих часток, не більше 6000 часток в ≥ 10 мкмоль/контейнер, не більше 600 часток в ≥ 25 мкмоль/контейнер Склад 25 мг/мл HuMab, 20 мМ L-гістидину, 240 мМ трегалози, 0,01 % (маса/об'єм) TM полоксамеру 188 , pH 6,0, 15 Час SEC Умови Білок SEC IEC значні Видимі Невидимі зберігання Мономери Мутність зберігання (мг/мл) HMW (%) розходження частки частки (місяці) (%) Вихідні 26,4 99,6 0,4 5,5 72,2 Задов. Задов. 1 26,4 99,7 0,3 5,7 н/в Задов. Задов. 2 26,3 99,5 0,5 5,7 72,0 Задов. Задов. 2-8 °C 3 26,3 99,5 0,5 6,3 72,6 Задов. Задов. 9 26,2 99,4 0,6 6,0 70,8 Задов. Задов. 12 26,4 99,5 0,5 6,5 70,1 Задов. Задов. 1 н/в 99,6 0,4 5,2 н/в Задов. Задов. 2 н/в 99,4 0,6 5,7 70,6 Задов. Задов. 25 °C 3 н/в 99,4 0,6 6,1 66,5 Задов. Задов. 9 26,4 95,7 0,8 5,9 58,2 Задов. Задов. 12 26,5 95,5 0,7 6,1 54,9 Задов. Задов. 1 н/в 98,2 0,3 5,4 58,6 Задов. Задов. 40 °C 2 н/в 97,4 0,8 5,7 50,4 Задов. Задов. 3 н/в 96,7 1,0 6,3 н/в Задов. Задов. -80 °C 9 25,7 99,5 0,5 5,9 72,3 Задов. Задов. н/в: не визначено. 22 UA 101487 C2 Задов.: від вільного до істотно вільного від видимих часток, не більше 6000 часток в ≥ 10 мкмоль/контейнер, не більше 600 часток в ≥ 25 мкмоль/контейнер. Склад 25 мг/мл HuMab, 20 мМ L-гістидину, 240 мМ трегалози, 0,1 % (маса/об'єм) TM полоксамеру 188 , pH 6,0, 5 Час SEC Умови Білок SEC IEC значні Видимі Невидимі зберігання Мономери Мутність зберігання (мг/мл) HMW (%) розходження частки частки (місяці) (%) Вихідні 26,4 99,6 0,4 5,5 71,5 Задов. Задов. 1 26,7 99,7 0,3 6,2 н/в Задов. Задов. 2 26,5 99,5 0,5 5,4 73,0 Задов. Задов. 2-8 °C 3 26,4 99,5 0,5 6,3 70,9 Задов. Задов. 9 26,5 99,4 0,6 6,4 71,8 Задов. Задов. 12 26,6 99,5 0,5 5,8 70,0 Задов. Задов. 1 н/в 99,6 0,4 5,2 н/в Задов. Задов. 2 н/в 99,4 0,6 5,7 70,7 Задов. Задов. 25 °C 3 н/в 99,4 0,6 6,2 67,4 Задов. Задов. 9 26,6 95,7 0,8 6,2 58,6 Задов. Задов. 12 26,6 95,4 0,7 6,0 54,9 Задов. Задов. 1 н/в 98,0 0,5 5,3 59,3 Задов. Задов. 40 °C 2 н/в 97,4 0,8 5,8 51,8 Задов. Задов. 3 н/в 96,6 1,1 7,0 н/в Задов. Задов. -80 °C 9 26,1 99,5 0,5 5,9 71,0 Задов. Задов. н/в: не визначено. 10 Задов.: від вільного до істотно вільного від видимих часток, не більше 6000 часток в ≥ 10 мкмоль/контейнер, не більше 600 часток в ≥ 25 мкмоль/контейнер. Склад 25 мг/мл HuMab, 20 мМ ацетату, 240 мМ трегалози, 0,1 % (маса/об'єм) полісорбату 80, pH 5,5, Час SEC Умови Білок SEC IEC значні Видимі Невидимі зберігання Мономери Мутність зберігання (мг/мл) HMW (%) розходження частки частки (місяці) (%) Вихідні 24,6 99,6 0,4 8,2 71,9 Задов. Задов. 2-8 °C 1 24,8 99,7 0,3 4,9 н/в Задов. Задов. 2 24,5 99,4 0,6 5,2 72,6 Задов. Задов. 3 24,3 99,4 0,6 7,0 66,2 Задов. Задов. 25 °C 1 н/в 99,6 0,4 6,7 н/в Задов. Задов. 2 н/в 99,3 0,7 7,0 71,9 Задов. Задов. 3 н/в 99,2 0,8 7,3 65,1 Задов. Задов. 40 °C 1 н/в 97,5 1,0 26,8 52,9 Задов. Задов. 2 н/в 96,0 2,1 27,8 42,1 Задов. Задов. 3 н/в 94,4 3,2 26,8 н/в Задов. Задов. н/в: не визначено. 15 Задов.: від вільного до істотно вільного від видимих часток, не більше 6000 часток в ≥ 10 мкмоль/контейнер, не більше 600 часток в ≥ 25 мкмоль/контейнер. Склад 25 мг/мл HuMab, 20 мМ ацетату, 140 мМ хлориду натрію, 0,1 % (маса/об'єм) полісорбату 80, pH 5,5 23 UA 101487 C2 Час SEC Умови Білок SEC IEC значні Видимі Невидимі зберігання Мономери Мутність зберігання (мг/мл) HMW (%) розходження частки частки (місяці) (%) Вихідні 23,7 99,5 0,5 11,4 70,9 Задов. Задов. 2-8 °C 1 24,4 99,6 0,4 11,4 н/в Задов. Задов. 2 24,2 99,4 0,6 10,5 71,5 Задов. Задов. 3 24,2 99,3 0,7 12,5 71,3 Задов. Задов. 25 °C 1 н/в 99,5 0,5 12,0 н/в Задов. Задов. 2 н/в 99,1 0,9 013,0 68,2 Задов. Задов. 3 н/в 99,1 0,9 13,2 64,6 Задов. Задов. 40 °C 1 н/в 96,9 1,2 26,8 54,0 Задов. Задов. 2 н/в 95,0 2,9 26,5 46,1 Задов. Задов. 3 н/в 93,1 4,2 26,1 н/в Задов. Задов. н/в: не визначено. 5 Задов.: від вільного до істотно вільного від видимих часток, не більше 6000 часток в ≥ 10 мкмоль/контейнер, не більше 600 часток в ≥ 25 мкмоль/контейнер. Склад 30 мг/мл HuMab, 20 мМ L-гістидину, 200 мМ трегалози, 0,01 % (маса/об'єм) TM полоксамеру 188 , pH 6,5 Час SEC Умови Білок SEC IEC значні Видимі Невидимі зберігання Мономери Мутність зберігання (мг/мл) HMW (%) розходження частки частки (місяці) (%) Вихідні 32,0 98,4 1,6 6,4 61,0 Задов. Задов. 2-8 °C 1 32,2 98,3 1,6 6,6 62,3 Задов. Задов. 3 32,9 98,1 1,7 5,7 60,5 Задов. Задов. 25 °C 1 32,2 98,1 1,8 6,2 60,9 Задов. Задов. 3 32,1 97,6 2,0 6,2 56,5 Задов. Задов. 40 °C 1 32,0 97,3 2,1 6,3 50,9 Задов. Задов. 3 32,3 89,9 3,0 7,2 31,1 Задов. Задов. -80 °C 3 31,8 98,3 1,6 6,2 61,0 Задов. Задов. -20 °C 3 32,1 98,3 1,6 6,6 60,7 Задов. Задов. 10 Задов.: від вільного до істотно вільного від видимих часток, не більше 6000 часток в ≥ 10 мкмоль/контейнер, не більше 600 часток в ≥ 25 мкмоль/контейнер. Дані стабільності ліофілізованих складів лікарського продукту HuMab Склад 25 мг/мл HuMab, 20 мМ L-гістидину, 240 мМ трегалози, 0,02 % (маса/об'єм) TM полоксамеру 188 Умови зберігання Вихідні 2-8 °C 25 °C 40 °C -80 °C -20 °C Час SEC SEC Білок IEC значні Видимі зберігання Мономери HMW Мутність (мг/мл) розходження частки (місяці) (%) (%) 25,5 98,9 1,0 6,2 61,2 Задов. 1 25,2 99,0 1,0 5,8 63,1 Задов. 3 25,3 99,0 1,0 6,1 60,4 Задов. 1 25,4 98,9 1,0 6,0 62,9 Задов. 3 25,6 98,5 1,1 6,1 60,2 Задов. 1 25,3 98,9 1,1 6,3 60,6 Задов. 3 25,9 98,5 1,3 5,9 56,9 Задов. 3 25,3 98,9 1,0 6,3 61,2 Задов. 3 25,4 98,9 1,0 6,7 60,6 Задов. Невидимі частки Задов. Задов. Задов. Задов. Задов. Задов. Задов. Задов. Задов. 15 Задов.: від вільного до істотно вільного від видимих часток, не більше 6000 часток в ≥ 10 мкмоль/контейнер, не більше 600 часток в ≥ 25 мкмоль/контейнер. Склад 25 мг/мл HuMab, 20 мМ L-гістидину, 240 мМ трегалози, 0,02 % (маса/об'єм) полісорбату 80, pH 6,0, 20 24 UA 101487 C2 Час SEC Умови Білок SEC IEC значні Видимі Невидимі зберігання Мономери Мутність зберігання (мг/мл) HMW (%) розходження частки частки (місяці) (%) Вихідні 27,2 99,6 0,4 6,0 72,3 Задов. Задов. 1 27,1 99,7 0,3 6,1 н/в Задов. Задов. 2-8 °C 2 27,0 99,5 0,5 5,8 74,0 Задов. Задов. 3 27,0 99,5 0,5 6,2 69,8 Задов. Задов. 1 н/в 99,7 0,4 6,2 н/в Задов. Задов. 25 °C 2 н/в 99,5 0,5 5,4 66,2 Задов. Задов. 3 н/в 99,5 0,5 5,9 68,6 Задов. Задов. 1 н/в 99,6 0,4 5,4 70,6 Задов. Задов. 40 °C 2 н/в 99,4 0,6 5,4 70,1 Задов. Задов. 3 н/в 99,3 0,7 6,3 н/в Задов. Задов. н/в: не визначено. Задов.: від вільного до істотно вільного від видимих часток, не більше 6000 часток в ≥ 10 мкмоль/контейнер, не більше 600 часток в ≥ 25 мкмоль/контейнер. 5 10 15 20 25 30 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Склад, що містить: 10 мг/мл гуманізованого B-Ly1 антитіла, 0,02 % (маса/об'єм) полісорбату 20, 20 мМ L-гістидину, а також 240 мМ трегалози при рН 6,0. 2. Склад, що містить: 25 мг/мл гуманізованого B-Ly1 антитіла, 0,02 % (маса/об'єм) полоксамеру 188, 20 мМ Lгістидину, а також 240 мМ трегалози при рН 6,0 або 25 мг/мл гуманізованого B-Ly1 антитіла, 0,01 % (маса/об'єм) полоксамеру 188, 20 мМ Lгістидину, а також 240 мМ трегалози при рН 6,0; або 25 мг/мл гуманізованого B-Ly1 антитіла, 0,1 % (маса/об'єм) полоксамеру 188, 20 мМ L-гістидину, а також 240 мМ трегалози при рН 6,0; або 25 мг/мл гуманізованого B-Ly1 антитіла, 0,02 % (маса/об'єм) полісорбату 80, 20 мМ L-гістидину, а також 240 мМ трегалози при рН 6,0; або 30 мг/мл гуманізованого B-Ly1 антитіла, 0,01 % (маса/об'єм) полоксамеру 188, 20 мМ Lгістидину, а також 200 мМ трегалози при рН 6,5. 3. Склад за п. 2, де він перебуває у рідкій формі та містить: 25 мг/мл гуманізованого B-Ly1 антитіла, 0,02 % (маса/об'єм) полоксамеру 188, 20 мМ Lгістидину, а також 240 мМ трегалози при рН 6,0. 4. Застосування складу за будь-яким з пп. 1-3 для виготовлення медикаменту, що використовується для лікування СD20-асоційованих захворювань. 5. Застосування за п. 4, де хвороба вибрана з групи, що складається з В-клітинної неходжкінської лімфоми (NHL), лімфоми клітин мантії (MCL), гострого лімфолейкозу (ALL), хронічного лімфолейкозу (CLL), В-клітинної дифузійної великоклітинної лімфоми (DLCL), лімфоми Беркітта, волосатоклітинної лейкемії, фолікулярної лімфоми, множинної мієломи, лімфоми маргінальної зони, посттрансплантаційного лімфопроліферативного розладу (PTLD), ВІЧ-асоційованої лімфоми, макроглобулінемії Вальденстрема або первинної лімфоми ЦНС. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 25