Нові похідні інсуліну з надзвичайно уповільненим профілем час/дія

Реферат: Винахід належить до нових аналогів інсуліну з базальним профілем час/дія, які відрізняються тим, що а) кінець В-ланцюга (В32) містить амідований лізин або амідований аргінін, b) Nтермінальний амінокислотний залишок інсуліну А-ланцюга є лізиновим або аргініновим залишком, с) позиція амінокислоти А8 зайнята гістидиновим залишком, d) позиція амінокислоти А21 зайнята гліциновим залишком, і e) одне або декілька заміщень і/або приєднань негативно заряджених амінокислотних залишків проводять в позиціях А5, А15, А18, В-1, В0, В1, В2, В3 і В4. UA 103015 C2 (12) UA 103015 C2 UA 103015 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ОПИС Винахід стосується нових аналогів інсуліну з базальним профілем час/дія, їх одержання і застосування. У останні роки число захворювань діабетом зросло майже до масштабу епідемії. Через цю хворобу може статися істотне скорочення очікуваної тривалості життя. Люди з діабетом повинні часто вводити інсулін в тіло ззовні. Доцільно оптимізувати лікування інсуліном. Тим часом, існують різні інсуліни з особливими фармакологічними властивостями для лікування. На практиці різні інсуліни в залежності від тривалості їх дії розрізнюються на інсуліни короткої дії, швидкодіючі інсуліни, інсуліни повільної дії і змішані інсуліни. Синонімами для позначення інсулінів повільної дії є інсулін уповільненого вивільнення, депо-інсулін, а також базальний інсулін. Активними речовинами багатьох цих інсулінових препаратів є так звані аналоги інсуліну, які були виведені з людського інсуліну шляхом заміщення, видалення і/або приєднання однієї або декількох амінокислот. Поняття "аналоги інсуліну" і "інсуліни" використовуються тут як синоніми. Концепція інтенсифікованої інсулінової терапії намагається зменшити ризик для здоров'я, прагнучи до стабільного контролю рівня цукру в крові шляхом раннього введення базальних інсулінів. Прикладом загальновживаного базального інсуліну є ліки Lantusо (активна речовина: інсулін кларгін = Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) - людський інсулін). Звичайно при розробці нових поліпшених базальних інсулінів необхідно мінімізувати число гіпоглікемічних подій. При цьому ідеальний базальний інсулін з надійністю діє у кожного пацієнта щонайменше 24 години. У ідеалі дія інсуліну відбувається уповільнено і по можливості з плоским профілем час/дія, так що небезпека короткочасної нестачі цукру в крові помітно мінімізується і введення можна провести навіть без попередньої їди. Хороше постачання базальним інсуліном є тоді, коли активність інсуліну зберігається постійної як можна довше, тобто тіло забезпечується постійною кількістю інсуліну. Тим самим до мінімуму знижується небезпека гіпоглікемічних подій і зумовлена пацієнтом і часом діб варіабельність. Таким чином, фармакокінетичний профіль ідеального базального інсуліну повинен відрізнятися уповільненим настанням дії і пролонгованою, тобто рівномірною дією, що довго зберігається. Однак, незважаючи на вже досягнуті терапевтичні переваги, жоден з описаних до цього часу інсулінів уповільненої дії не має фармакокінетичних властивостей ідеального базального інсуліну. Бажані інсуліни, які мають такий плоский профіль, що довго триває час/дія, що небезпека гіпоглікемічних подій і залежна від часу мінливість у пацієнтів ще більше знижується, а тривалість дії ще більше продовжується, так що при відомих умовах інсулін більше не треба буде приймати щодня. Це сприяло б спрощенню лікування діабетиків, зокрема, немолодих і потребуючих догляду діабетиків, які більше не можуть самі колоти собі інсулін, і тим самим мало б великий народногосподарський ефект. Крім того, такі базальні інсуліни були б корисні на ранній фазі діабету типу 2. Лікарі-клініцисти повідомляють, що фобія, що є у багатьох людей перед уколами відлякує їх від своєчасного початку лікування інсуліном. Як наслідок виходить погане регулювання рівня цукру в крові, що тягне за собою пізні ускладнення діабету. Базальний інсулін, який знижує число доз інсуліну, що вводяться ін'єкціями, міг би сприяти тому, що пацієнти будуть легше сприймати інсулінову терапію. Kohn і інш. (Peptides 28 (2007) 935-948) описує, що оптимізації фармакодинаміки інсуліну можна досягнути, одержавши аналоги інсуліну, у яких ізоеластична точка (pl) зсунута приєднанням лізину або аргініну до В-кінця ланцюга або N-кінця ланцюгів А і В в напрямі лужної області, порівнянної з ізоеластичною точкою людського інсуліну (pl=5,6), так що розчинність в фізіологічних умовах знижується, і виходить пролонгований профіль час/дія. При цьому сполука 18 з роботи Kohn і інш. (Arg (A0), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) - людський інсулін (експериментально визначена pl=7,3; розрахункова pl=7,58) представлена як найкраща сполука в випадку цієї концепції. Основну мету при розробці нових аналогів інсуліну Kohn і інш. убачають тому в приєднанні позитивно заряджених амінокислот до послідовності амінокислот людського інсуліну з метою підвищення ізоеластичної точки pl=5,6 в нейтральну область. Цій меті при створенні нових аналогів інсуліну перешкоджає заміщення нейтральних амінокислот в людському інсуліні кислими амінокислотами і/або приєднання кислих амінокислот, оскільки таке заміщення і/або приєднання щонайменше частково відміняє ефект введення позитивно заряджених амінокислот. Однак тепер несподівано було виявлено, що до описаного бажаного базального профілю час/дію ведуть такі аналоги інсуліну, які відрізняються тими ознаками, що: - кінець В-ланцюга складається з амідованого основного амінокислотного залишку, такого, як лізин- або аргінінамід, тобто у амідованого основного амінокислотного залишку на кінці Вланцюга карбоксильна група кінцевої амінокислоти знаходиться в її амідованій формі, і 1 UA 103015 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 - N-термінальний амінокислотний залишок ланцюга А інсуліну є лізиновим або аргініновим залишком, і - позиція амінокислоти A8 зайнята гістидиновим залишком, і - позиція амінокислоти A21 зайнята гліциновим залишком, і - два заміщення нейтральних амінокислот кислими амінокислотами, два приєднання негативно заряджених амінокислотних залишків або по одному такому заміщенню і такому приєднанню відбувається в позиціях A5, A15, A18, В-1, B0, B1, B2, B3 і B4. Тоді як перші три вказаних ознаки внаслідок введення позитивних зарядів або усунення негативних зарядів мають тенденцію сприяти підвищенню значень pl відповідного аналога інсуліну, згадані останніми заміщення і/або приєднання негативно заряджених амінокислотних залишків мають зворотний ефект і сприяють зниженню значень pl. Несподівано виявилося, що саме описані вище аналоги інсуліну мають бажані вигідні профілі час/дія. Значення pl у цих з'єднань нижче, ніж у сполуки 18 з роботи Kohn і інш. (Arg (A0), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) людський інсулін), але при цьому вони мають, проте, уповільнений початок дії і більш пролонговану дію, тобто гранично плоский і тривалий рівномірний хід впливу. Тим самим помітно знижується небезпека гіпоглікемічних подій. Сповільнення настільки помітне, що цей ефект, до здивування, можна виявити навіть в модельних дослідах на пацюках, хоч, на відміну від цього, уповільнену дію інсуліну кларгіну на щурів не можна спостерігати однозначно. На фігурі 1 представлений гіпоглікемічний ефект сполуки YKL205 (згідно з винаходом) в порівнянні з інсуліном кларгіном. Схожі результати одержані на собаках (див. фігуру 2). Таким чином, були розроблені нові базальні інсуліни, які треба вводити помітно рідше. Крім цих описаних фармакокінетичних переваг, аналоги згідно з винаходом мають помітно кращі властивості в порівнянні з інсуліном кларгіном з точки зору фармакології, як, наприклад, специфічність рецепторів і мітогенність in vitro. Крім того, інсуліни, що патентуються мають переваги також з фізико-хімічної точки зору. Таким чином, об'єктом винаходу є аналог інсуліну формули I: причому є наступна відповідність: A0 Lys або Arg; A5 Asp, Gln або Glu; A15 Asp, Glu або Gln; A18 Asp, Glu або Asn; В-1 Asp, Glu або аміногрупа; B0 Asp, Glu або хімічний зв'язок; B1 Asp, Glu або Phe; B2 Asp, Glu або Val; B3 Asp, Glu або Asn; B4 Asp, Glu або Gln; B29 Lys або хімічний зв'язок; B30 Thr або хімічний зв'язок; B31 Arg, Lys або хімічний зв'язок; B32 Arg-амід, Lys-амід або аміногрупа, причому два амінокислотних залишки групи, що містить A5, A15, A18, В-1, B0, B1, B2, B3 і B4, одночасно і незалежно один від одного означають Asp або Glu. 2 UA 103015 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Зокрема, об'єктами винаходу є аналоги інсуліну, які вказані вище, у яких незалежно один від одного A0 відповідає Arg, або в яких A5 відповідає Glu, або в яких A15 відповідає Glu, або в яких A18 відповідає Asp, або в яких В-1 відповідає аміногрупі, або в яких B0 відповідає Glu, або в яких B1 відповідає Asp, або в яких B2 відповідає Val, або в яких B3 відповідає Asp, або в яких B4 відповідає Glu, або в яких B29 відповідає Lys, або в яких B30 відповідає Thr, або в яких B31 відповідає Arg або Lys. Особливо переважним об'єктом винаходу є аналог інсуліну, вибраний з групи, що містить: Arg (A0), His (A8), Glu (A5),Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A5),Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A15),Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A15),Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Glu (A15), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Glu (A15), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21),Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21),Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21),Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21),Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8),Asp (A18), Gly (A21),Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8),Asp (A18), Gly (A21),Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Gly (A21),Asp (B3), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Gly (A21),Asp (B3), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8),Asp (A18), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8),Asp (A18), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8),Asp (A18), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8),Asp (A18), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21),Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21),Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21),Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21),Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8),Asp (A18), Gly (A21),Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8),Asp (A18), Gly (A21),Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0),Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0),Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8),Asp (A18), Gly (A21),Asp (B3), Arg (B30), Arg (B31) -NH2 людський інсулін, Arg (A0), His (A8),Asp (A18), Gly (A21),Asp (B3), Arg (B30), Lys (B31) -NH2 людський інсулін. При наявності виразу "людський інсулін" в позначеннях названих аналогів інсуліну є внаслідок послідовність амінокислот в ланцюгу А і В людського інсуліну, а всі відхилення від нього (приєднання, заміщення, видалення) вказуються в наведеному позначенні аналога інсуліну. Наступним об'єктом винаходу є спосіб одержання аналога інсуліну, який вказаний вище, в якому, зокрема, рекомбінантно одержують попередник аналога інсуліну, попередник ферментативно обробляють з одержанням дволанцюжкового інсуліну, і поєднання з аргінінамідом проводять в присутності ферменту з трипсиновою активністю, і аналог інсуліну виділяють. Наступним об'єктом винаходу є застосування аналога інсуліну, який описаний вище, для одержання лікарського засобу для лікування діабету, зокрема, діабету типу I або типу II. Об'єктом винаходу є також застосування аналога інсуліну, який описаний вище, для одержання лікарського засобу для підтримки регенерації бета-клітин. Наступним об'єктом винаходу є лікарський засіб, що містить аналог інсуліну, який описаний вище, і/або його фізіологічно прийнятні солі. Наступним об'єктом винаходу є композиція з аналогом інсуліну, який описаний вище, причому композиція знаходиться у водній формі, що містить розчинений аналог інсуліну. 3 UA 103015 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Наступним об'єктом винаходу є композиція з аналогом інсуліну, який описаний вище, причому композиція знаходиться у вигляді порошку. Наступним об'єктом винаходу є композиція, яка описана вище, причому аналог інсуліну, який описаний вище, знаходиться в кристалічній і/або аморфній формі. Наступним об'єктом винаходу є композиція з аналогом інсуліну, який описаний вище, причому композиція знаходиться в формі суспензії. Наступним об'єктом винаходу є композиція з аналогом інсуліну, який описаний вище, причому композиція додатково містить хімічний шаперон. Наступним об'єктом винаходу є ДНК, що кодує попередник аналога інсуліну, який описаний вище, або А-ланцюг або В-ланцюг аналога інсуліну, який описаний вище. Наступним об'єктом винаходу є вектор, що містить ДНК, яка описана вище. Наступним об'єктом винаходу є організм-хазяїн, що містить ДНК, яка описана вище, або вектор, який описаний вище. Наступним об'єктом винаходу є аналог препроінсуліну, який відрізняється тим, що С-пептид на своєму N-кінці містить амінокислотний залишок аргінін, а на своєму С-кінці два аргінінових залишки або один аргініновий залишок і один лізиновий залишок, причому в останньому випадку лізиновий залишок утворює власне С-кінець. Наступним об'єктом винаходу є композиція, яка описана вище, в якій додатково містяться глюкагоноподібні пептиди-1 (GLP1) або їх аналог або похідне, або ексендин-3 або -4 або його аналог або похідне, переважне ексендин-4. Наступним об'єктом винаходу є композиція, яка описана вище, в якій аналог ексендину-4 вибраний з групи, що містить: 36 H-desPro -Exendin-4-Lys6-NH2, 36,37 H-des(Pro ) Exendin-4-Lys4-NH2 і 36,37 H-des(Pro ) Exendin-4-Lys5-NH2, або його фармакологічно прийнятну сіль. Наступним об'єктом винаходу є композиція, яка описана вище, в якій аналог ексендину-4 вибраний з групи, що містить: 36 28 desPro [Asp ]Exendin-4(1-39), 36 28 desPro [IsoAsp ]Exendin-4(1-39), 36 14 28] desPro [Met(О) ,Asp Exendin-4(1-39), 36 14 28] desPro [Met(О) , IsoAsp Exendin-4(1-39), 36 25 28] desPro [Trp(O2) ,Asp Exendin-2(1-39), 36 25 28] desPro [Trp(O2) , IsoAsp Exendin-2(1-39), 36 14 25 28 desPro [Met(О) Trp(O2) ,Asp ]Exendin-4(1-39) і 36 14 25 28 desPro [Met(О) Trp(O2) , IsoAsp ]Exendin-4(1-39), або його фармакологічно прийнятну сіль. Наступним об'єктом винаходу є композиція, яка описана в попередньому абзаці, в якій до Скінців аналогів ексендину-4 приєднаний пептид -Lys6-NH2. Наступним об'єктом винаходу є композиція, яка описана вище, в якій аналог ексендину-4 вибраний з групи, що містить: 36 28 Н-(Lys)6-desPro [Asp ]Exendin-4(1-39)-Lys6-NH2, 28 36 37 38 desAsp Pro ,Pro ,Pro Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 28 Н-(Lys)6-desPro ,Pro ,Pro [Asp ]Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 28 H-Asn-(Glu)5-desPro ,Pro ,Pro [Asp ]Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 28 desPro ,Pro ,Pro [Asp ]Exendin-4(1-39)-(Lys)6-NH2, 36 37 38 28 Н-(Lys)6-desPro ,Pro ,Pro [Asp ]Exendin-4(1-39)-(Lys)6-NH2, 36 37 38 28 H-Asn-(Glu)5-desPro ,Pro ,Pro [Asp ]Exendin-4(1-39)-(Lys)6-NH2, 36 25 28] Н-(Lys)6-desPro [Trp(O2) ,Asp Exendin-4(1-39)-Lys6-NH2, 28 36 37 38 25 H-desAsp Pro ,Pro ,Pro [Trp(O2) ]Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 25 28] Н-(Lys)6-desPro ,Pro ,Pro [Trp(O2) ,Asp Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 25 28] H-Asn-(Glu)5-desPro ,Pro ,Pro [Trp(O2) ,Asp Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 25 28] desPro ,Pro ,Pro [Trp(O2) ,Asp Exendin-4(1-39)-(Lys)6-NH2, 36 37 38 25 28] Н-(Lys)6-desPro ,Pro ,Pro [Trp(O2) ,Asp Exendin-4(1-39)-(Lys)6-NH2, 36 37 38 25 28] H-Asn-(Glu)5-desPro ,Pro ,Pro [Trp(O2) ,Asp Exendin-4(1-39)-(Lys)6-NH2, 36 14 28] Н-(Lys)6-desPro [Met(О) ,Asp Exendin-4(1-39)-Lys6-NH2, 14 28 36,Pro37 38 desMet(О) Asp Pro ,Pro Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 14 28] Н-(Lys)6-desPro ,Pro ,Pro [Met(О) ,Asp Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 14 28] H-Asn-(Glu)5-desPro ,Pro ,Pro [Met(О) ,Asp Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 14 28] desPro ,Pro ,Pro [Met(О) ,Asp Exendin-4(1-39)-(Lys)6-NH2, 4 UA 103015 C2 36 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 37 38 14 28] Н-(Lys)6-desPro ,Pro ,Pro [Met(О) ,Asp Exendin-4(1-39)-Lys6-NH2, 36 37 38 14 28] H-Asn-(Glu)5-desPro ,Pro ,Pro [Met(О) ,Asp Exendin-4(1-39)-(Lys)6-NH2, 36 14 25 28 Н-(Lys)6-desPro [Met(О) ,Trp(O2) ,Asp ]Exendin-4(1-39)-Lys6-NH2, 28 36 37 38 14 25 desAsp Pro ,Pro ,Pro [Met(О) ,Trp(O2) ]Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 14 25 28 Н-(Lys)6-desPro ,Pro ,Pro [Met(О) ,Trp(O2) ,Asp ]Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 14 28] H-Asn-(Glu)5-desPro ,Pro ,Pro [Met(О) ,Asp Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 14 25 28 desPro ,Pro ,Pro [Met(О) ,Trp(O2) ,Asp ]Exendin-4(1-39)-(Lys)6-NH2, 36 37 38 14 25 28 Н-(Lys)6-desPro ,Pro ,Pro [Met(О) ,Trp(O2) ,Asp ]Exendin-4(1-39)-(Lys)6-NH2, 36 37 38 14 25 28 H-Asn-(Glu)5-desPro ,Pro ,Pro [Met(О) ,Trp(O2) ,Asp ]Exendin-4(1-39)-(Lys)6-NH2, або його фармакологічно прийнятну сіль. Наступним об'єктом винаходу є композиція, яка описана вище, в якій додатково міститься 34 26 ε α Arg , Lys (N (γ-глутаміл(N -гексадеканоїл)))GLP-1(7-37) [ліраглютид] або його фармакологічно прийнятна сіль. При цьому фахівцеві ясно, що інсуліни згідно з винаходом можуть бути предметом фармацевтичної композиції, яка після прийому діє сприятливим чином. При цьому виходять з водних розчинів. Відповідно, інші компоненти повинні бути такими, що змішуються. Небезпека забруднення тваринними вірусами мінімізується тим, що препарат не повинен містити ніяких компонентів, які походять з тваринних джерел. Крім того, переважно запобігати мікробному забрудненню доданням консервантів. Доданням ізотонуючих агентів можна компенсувати можливий негативний вплив композиції на фізіологію клітин тканини в місці введення. Стабілізуюча дія може надавати додання протаміну, так що можна одержати по суті не утримуючого солі препарату інсуліну, якщо в композицію додати протамін. Додання фенольного компонента може привести до стабілізації структури аналога інсуліну, що застосовується і, таким чином, додатково викликати, крім іншого, додатковий ефект сповільнення при настанні дії. У композицію можуть також додаватися речовини, які стабілізують просторову структуру інсулінів уповільненої дії згідно з винаходом і ведуть до кращої термічної стабільності. Такі хімічні шаперони можуть, наприклад, містити коротку синтетичну пептиди, які можуть також включати аналоги амінокислот або, наприклад, пептидні послідовності, виведені з С-пептиду інсуліну. Для розробки депо-форм можна інсуліни згідно з винаходом зв'язувати на наночастинках. Допустимі також так звані "slow-release" композиції, в яких інсулін уповільненої дії згідно з винаходом знаходиться обернено пов'язаним на полімерному носії. Інсуліни згідно з винаходом можуть прийматися паралельно з швидкодіючим інсуліном, як , , , Apidraо NovoRapidо Humalogо або з тими, що перебувають в стадії розробки дериватами інсуліну або композиціями з відповідним профілем час/дія, або з інсуліном, що вводиться шляхом інгаляції, або з інсулінами, що вводяться через ніс або рот, які знаходяться в розробці. При цьому фахівцеві ясно, що крім цього можуть застосовуватися також відповідні суміші швидкодіючого інсуліну і інсуліну уповільненої дії згідно з винаходом. Крім того, аналоги інсуліну згідно з винаходом можна використати в фармацевтичних препаратах, які містять пептиди, що характеризуються активністю, порівнянною з активністю GLP-1 (глюкагоноподібні пептиди-1), або ексендину-4, або ексендину-3. Прикладами таких пептидів є GLP-1 (7-37), ексенатид (Byettaо) або пептиди, одержання яких описане в патентних заявках WO 2006/058620, WO 2001/04156, WO 2004/005342 і WO 98/08871. При цьому особливо вигідні композиції, які містять депо-рецептуру цих пептидів. Вигідні, особливо в початковій фазі захворювання діабетом типу II, форми лікування, які паралельно з прийомом лікарських засобів згідно з винаходом передбачають прийом ліків, які посилюють дію інсуліну, як, наприклад, метформин. Можлива також комбінована терапія з інгібіторами дипептиділпептидази-4, які підвищують рівень внутрішньої секреції, наприклад, комбінації з сульфонілсечовинами, які підвищують розподіл інсуліну в підшлунковій залозі. Особливо переважно можна призначати інсуліни уповільненої дії згідно з винаходом тоді, коли внаслідок застосування диференціюючих чинників, регенерація бета-клітин підшлункової залоза починається з відповідних стовбурових клітин. Всі ці додатки вказані як приклад для лікування діабету і також є об'єктом винаходу. Наступним об'єктом винаходу є, тим самим, застосування інсулінів згідно з винаходом в комбінації з іншими активними речовинами для лікування діабету, зокрема, діабету типу I або типу II. Наступним об'єктом винаходу є лікарський засіб, що містить аналог інсуліну згідно з винаходом, який являє собою, зокрема, водну композицію або порошок. Лікарський засіб є фармацевтичним препаратом, який переважно являє собою розчин або суспензію для ін'єкцій; воно відрізняється наявністю щонайменше одного аналога інсуліну згідно з винаходом і/або щонайменше однієї його фізіологічно прийнятної солі в розчиненій, аморфній і/або кристалічній формі, переважно в розчиненій. 5 UA 103015 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Готова форма переважно має pH приблизно від 2,5 до 8,5, зокрема, приблизно від 4,0 до 8,5, переважно містить відповідний ізотонуючий агент, відповідний консервант і при необхідності відповідний буфер, а також, переважно, визначену концентрацію іонів цинку, в стерильному водному розчині. Сукупність компонентів препарату, крім активної речовини, утворює носій форми. Відповідними ізотонуючими агентами є, наприклад, гліцерин, глюкоза, маніт, NaCl, з'єднання кальцію або магнію, як CaCl2, і т.д. Вибором ізотонуючого агента і/або консерванта впливають на розчинність інсулінів згідно з винаходом або з фізіологічно прийнятних солей при слабокислотних значеннях pH. Відповідними консервантами є, наприклад, фенол, м-крезол, бензиловий спирт і/або складний ефір п-гідроксибензойної кислоти. Як буферні речовини, зокрема, для встановлення значення pH приблизно від 4,0 до 8,5, можна використати, наприклад, ацетат натрію, цитрат натрію, фосфат натрію і т.д. Проте, для регулювання pH придатні також фізіологічно безпечні розбавлені кислоти (типово HCl) або луги (типово NaOH). Якщо препарат містить цинк, то переважно вміст цинку від 1 до 2 мг/мл, зокрема, від 1 мкг/мл до 200 мкг/мл. Несподівано виявилося, що добавкою Zn можна добре впливати на профіль активності аналогів інсуліну згідно з винаходом. Це дозволяє одержати препарати, які розрізнюються по повній тривалості дії, швидкості настання дії і кривої профілю дії і, таким чином, дозволяють індивідуальне підлаштування під конкретного пацієнта. Інша можливість виходить внаслідок використання "двокамерного інсулінового пристрою", який дозволяє вводити композицію з швидким початком дії і/або з повільним плавним початком дії в залежності від життєвої ситуації. З метою зміни профілю активної речовини в препараті згідно з винаходом можна також додавати в нього немодифікований інсулін, переважно бичачий, свинячий або людський інсулін, зокрема, людський інсулін, або аналоги інсуліну і його деривати. Можна також додавати один або декілька похідних ексендину-4 або пептиди, які відрізняються активністю, порівнянною з активністю GLP-1 (глюкагоноподібний пептид-1), або прямо відповідає GLP-1. Такі лікарські засоби (препарати) також є об'єктом винаходу. Переважними концентраціями активної речовини є концентрації, відповідні приблизно 11500, більш переважно, приблизно 5-1000 і, зокрема, приблизно 40-400 міжнародних одиниць/мл. Аналоги інсуліну згідно з винаходом спочатку одержують біотехнологічними методами як попередники, які ще не містять аміду. Фахівцеві відомо, що є множина можливостей для одержання інсулінів. При цьому як клітинна системи-хазяїна використовуються бактерії, дріжджі і рослини або рослинні клітини, культивовані ферментативно. Якщо аналіз витрат це дозволяє, можливі також експресуючі системи, які як система-хазяїн використовують тваринні клітини. Однак необхідною умовою для цього є надійна відсутність тваринних вірусів. Таким чином, ясно, що описані як приклади експресуючі системи являють собою лише малу частину системхазяїнів/векторного систем, розроблених для рекомбінантного одержання білків. У заявці не описуються, наприклад, біотехнологічні способи, які мають в основі дріжджеві або рослинні системи, як мохи, водорості або вищі рослини, такі, як тютюн, горох, бодяк, ячмінь, кукурудза або рапс. Проте, системи хазяїн/вектор, а також кодуючі ДНК-послідовності, які дозволяють одержання бажаних пептидів у відповідних біотехнологічних експресуючих системах, також є складовою частиною винаходу. Організми-хазяїни можуть також бути вибрані, зокрема, з рослинного миру з організмів першого типу Schizophyta, що містить шизоміцети, бактерії або синьо-зелені водорості, організмів 2-го типу Phycophyta V-го класу Chlorophyceae, організмів 2го типу Phycophyta VII-го класу Rhodophyceae, організмів 3-го типу Mycophyta, організмів 5-го типу Bryophyta і організмів 2-го типу Spermatophyta. У європейській патентній заявці EP-A 1222207 описана плазміда plNT358d, яка кодує препроінсулін, що містить змінений С-пептид. За допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЦР) тепер можна цілеспрямовано змінювати кодуючу проінсулін послідовність таким чином, щоб можна було експресувати препроінсуліни, які можуть служити попередниками для інсулінів згідно з винаходом. Відповідні злиті білки не обов'язково повинні виходити внутрішньоклітинно. Фахівцеві ясно, що такі білки можна також одержати бактерійною експресією з подальшою секрецією в периплазмі і/або в надлишку культури. Це описане, наприклад, в європейській патентній заявці EP-A 1364029. Попередники проінсуліну, які ведуть до аналогів згідно з винаходом, також є об'єктом винаходу. Одержані таким шляхом проінсуліни можна в принципі перетворити в попередники аналогів інсуліну, які в позиції A0 містять лізин або аргінін, а на С-термінальному кінці ланцюга В несуть лізин або аргінін. 6 UA 103015 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Якщо проінсуліни згідно з винаходом після внутрішньоклітинної експресії в бактеріях присутні як тілецьвмісні або розчинені, то ці попередники треба шляхом згортання in vitro скрутити в правильну конформацію, перш ніж можна буде провести обробку і біохімічну модифікацію. При цьому описаний злитий білок дозволяє пряме згортання після денатурації сечовиною або гідрохлоридом гуанідину, при цьому проміжні продукти згортання також є об'єктом винаходу. Для збагачення окремих проміжних сполук застосовуються біохімічні методи, зокрема, процеси розділення, причому лежачі в їх основі принципи опубліковані і навіть є предметом підручників. Фахівцеві ясно, що такі принципи можуть комбінуватися по проходженню і що, таким чином, можна здійснити способи, які по своїй послідовності раніше не публікувалися. Тим самим, спосіб, який веде до очищення аналогів згідно з винаходом, також є об'єктом винаходу. Наступним об'єктом винаходу є спосіб одержання аналогів інсуліну по винаходу, причому попередник аналога інсуліну одержують рекомбінантно і ферментативно перетворюють в дволанцюжковий попередник інсуліну, який на N-кінці амінокислоти 1 А-ланцюги несе аргінін або лізин, а на С-кінці кінця В-ланцюга містить лізиновий або аргініновий залишок, який аргінінамідом або лізинамідом в присутності ферменту з трипсиновою активністю переводиться в амід і, таким чином, в інсулін уповільненої дії згідно з винаходом, який після процесу біохімічного очищення буде високочистим. Білки, які відрізняються від відповідного, в іншому ідентичного білка натурального походження заміщенням щонайменше одного натурального амінокислотного залишку іншими амінокислотними залишками, і/або приєднанням, і/або видаленням щонайменше одного амінокислотного залишку, будуть називатися "аналогами" білків. При цьому під доданими і/або заміщеними амінокислотними залишками мова може йти про такі залишки, які в природі не зустрічаються. Білки, які одержані хімічною модифікацією визначених амінокислотних залишків вихідних білків, означаються як "похідні" білків. Хімічна модифікація може перебувати наприклад, в приєднанні однієї або декількох вихідних хімічних груп до однієї або декількох амінокислот. Підписи до фігур: Фіг. 1: Знижуюча рівень цукру в крові дія на щурів нових аналогів інсуліну; Фіг. 2: Знижуюча рівень цукру в крові дія на собак нових аналогів інсуліну; Фіг. 3: Знижуюча рівень цукру в крові дія на собак YKL205; Фіг. 4: Залежність від цинку гіпоглікемічної дії YKL205 на собак. Наступні приклади повинні проілюструвати ідеї винаходу, при цьому не обмежуючи його. Приклад 1: Одержання векторного похідного plNT3580, який кодує Gly (A21)-інсулін і модифікований С-пептид, несучий на межі ланцюга С/А Arg Arg. Європейська патентна заявка EP-A 1222207 описує плазміди plNT358d, plNT91d і послідовність праймера Tir. ДНК цих продуктів застосовується для конструювання плазміди plNT3580. При цьому плазміда plNT358d характеризується генною послідовністю, яка кодує модифіковану С-пептид з особливими властивостями. Синтезовані три послідовності праймерів: pint3580_glya21rev ' ' 5 -CAAAGGTCGACTATTAGCCGCAGTAGTTCTCCAGCTGG-3 (SEQ ID NO: 3) Цей праймер служить для того, щоб після обробки ввести в позицію 21 А-ланцюги кодованої plNT358d послідовності проінсуліну гліцин (жирний шрифт, підкреслено) замість аспарагіну. arg_cjuncf ' ' 5 -GTCCCTGCAGCGTCGCGGCATCGTGGAGCAG-3 (SEQ ID NO: 4) Цей праймер служить, подібно праймеру arg_cjunc_rev, для введення аргініну замість лізину на межі ланцюга А/В інсуліну. arg_cjunc_rev ' ' 5 -CCACGAT GCCGCGACGCTGC AGGGACCCCT CCAGCG-3 (SEQ ID NO: 5) Кодон для аргініну, що вводиться в обох праймерах виділений жирним. ПЦР проводиться відповідно до європейської патентної заявки EP-A 1222207 з ДНК плазміди plNT358d як матриці і з парою праймерів Tir/arg_cjunc_rev і arg_cjuncf/pint3580_glya21rev. Аліквоти продуктів двох реакцій з'єднують і разом з парою праймерів Tir/pint3580_glya21rev вводять в третю ПЦР. Продукт цієї реакції очищають після гель-електрофоретичного розділення реакційної суміші і разом з рестриктивним ферментом Sal1/Nco1, згідно з вказівками виробника, використовують в одній і тій же реакції, реакційну суміш розділяють гель-електрофорезом і виділяють фрагмент ДНК, що кодує проінсулінову послідовність. Потім фрагмент через реакцію ДНК-лігази впроваджують у відкритий за допомогою Nco1/Sal1 plNT91d вектор ДНК. 7 UA 103015 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Зшиваючою сумішшю трансформують відповідні клітини бактерій Е. coli. Перетворену суміш розподіляють на висіюючому диску, який містить 25 мг/л ампіциліну. Плазміду ДНК виділяють з колоній і характеризують аналізом послідовності ДНК. Правильні плазміди одержують позначення plNT3580. Приклад 2: Конструювання плазміди plNT3581, що кодує His (A8), Gly (A21) - препроінсулін Конструювання проводиться, як описано в прикладі 1, шляхом 3 полімеразних ланцюгових реакцій. Продукт третьої реакції після відщеплення Nco1/Sal1 впроваджується у відкритий за допомогою Nco1/Sal1 plNT91d вектор ДНК. Використовуються праймери Tir і pint3580_glya21rev. Синтезовані два наступних праймери: pint3580_Ha8f 5'-AGCAGTGCTGCCACAGCATCTGCTCCCTCTAC-3' (SEQ ID NO: 6) pint3580_Ha8rev 5'-GAG CAGATGCT GTG GCAGCACTG CTCCACGATG-3' (SEQ ID NO: 7) Кодон, який кодує гістидин в позиції 8 ланцюга А, кожний раз виділений жирним. Конструювання проводиться, як описано в прикладі 1. Матріцей для ПЦР 1 і 2 є ДНК плазміди plNT3580. ПЦР 1 проводиться з парою праймерів Tir/pint3580_Ha8rev, а ПЦР 2 з парою праймерів pint3580_Ha8f/pint3580_glya21rev. У ПЦР 3 використовується пара праймерів Tir/pint3580_glya21rev. При цьому матрицею є суміш продуктів реакції ПЦР 1 і ПЦР 2. Правильні плазміди одержують позначення plNT3581. Приклад 3: Конструювання плазміди plNT3582, що кодує His (A8), Glu (A5), Gly (A21) препроінсулін Конструювання проводиться, як описано в прикладах 1 і 2, шляхом 3 полімеразних ланцюгових реакцій. Продукт третьої реакції після відщеплення Nco1/Sal1 впроваджується у відкритий за допомогою Nco1/Sal1 plNT91d вектор ДНК. Використовуються праймери Tir і pint3580_glya21rev. Синтезовані два наступних праймери: pint3581_Ea5f ' ' 5 -GCATCGTGGAGGAGTGCTGCCACAGCATCTG-3 (SEQ ID NO: 8) pint3581_Ea5rev 5'-CTGT GGCAGCACTC CTCCACGATG CCGCGACG-3' (SEQ ID NO: 9) Кодон, який кодує глутамінову кислоту в позиції 5 ланцюга А, кожний раз виділений жирним. Конструювання проводиться, як описано в прикладі 1. Матрицею є ДНК плазміди plNT3581. Правильні плазміди одержують позначення plNT3582. Приклад 4: Конструювання плазміди plNT3583, що кодує His (A8),Asp (A18), Gly (A21) препроінсулін Конструювання проводиться, на відміну від прикладу 1, тільки з однією полімеразною ланцюговою реакцією. Продукт цієї реакції після відщеплення Nco1/Sal1 впроваджується у відкритий за допомогою Nco1/Sal1 plNT91d вектор ДНК. Використовується праймер Tir. Синтезований наступний праймер: pint3580_Da18rev ' ' 5 -CAAAGGTCGACTATTAGCCGCAGTAGTCCTCCAGCTGGTAGAGGGAG-3 (SEQ ID NO: 10) Кодон, який кодує аспарагінову кислоту в позиції 18 ланцюга А, виділений жирним. Матрицею є ДНК плазміди plNT3581. Правильні плазміди одержують позначення plNT3583. Приклад 5: Конструювання плазміди plNT3584, що кодує His (A8), Glu (A5),Asp (A18), Gly (A21) - препроінсулін Конструювання проводиться, на відміну від прикладу 1, усього з однією полімеразною ланцюговою реакцією. Продукт третьої реакції після відщеплення Nco1/Sal1 впроваджується у відкритий за допомогою Nco1/Sal1 plNT91d вектор ДНК. Використовується праймер Tir pint3580_Da18rev (пр.4). Матрицею є ДНК плазміди plNT3582. Правильні плазміди одержують позначення plNT3584. Кодований плазмідою препроінсулін є попередником сполуки YKL205-1, яка утворюється після амідування аргінінамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), Glu (A5), His (A8),Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 - людський інсулін Відповідне амідування лізинамідом приводить до сполуки YKL205-1b: Arg (A0), Glu (A5), His (A8),Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 - людський інсулін Приклад 6: Конструювання плазміди plNT3585, що кодує His (A8), Glu (A15), Gly (A21) препроінсулін Конструювання проводиться, на відміну від прикладу 1, усього з однією полімеразною ланцюговою реакцією. Продукт цієї реакції після відщеплення Nco1/Sal1 впроваджується у відкритий plNT91d вектор ДНК. Використовується праймер Tir. Синтезований наступний праймер: pint3580_Ea15rev 8 UA 103015 C2 ' 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ' 5 -CAAAGGTCGA CTATTAGCCG CAGTAGTTCTCCAGCTCGTA GAGGGAGCAGATGCTG-3 (SEQ ID NO: 11) Кодон, який кодує глутамінову кислоту в позиції 15 ланцюга А, виділений жирним. Матрицею є ДНК плазміди plNT3581. Правильні плазміди одержують позначення plNT3585. Приклад 7: Конструювання плазміди plNT3586, що кодує His (A8), Glu (A15),Asp (A18), Gly (A21) - препроінсулін Конструювання проводиться, на відміну від прикладу 1, усього з однією полімеразною ланцюговою реакцією. Продукт цієї реакції після відщеплення Nco1/Sal1 впроваджується у відкритий за допомогою Nco1/Sal1 plNT91d вектор ДНК. Використовується праймер Tir. Синтезований наступний праймер: pint3585_Ea15_Da18rev ' ' 5 -CAAAGGTCGACTATTAGCCGCAGTAGTCCTCCAGCTCGTAGAGGGAGCAGATGCTG-3 (SEQ ID NO: 12) Кодон, що кодує глутамінову кислоту в позиції 15 ланцюга А і аспарагінову кислоту в позиції A18 ланцюга А, кожний раз виділений жирним. Матрицею є ДНК плазміди plNT3581. Правильні плазміди одержують позначення plNT3586. Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205, яка утворюється після амідування аргінінамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8), Glu (A15),Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 - людський інсулін Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205b, яка утворюється після амідування лізинамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8), Glu (A15),Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 - людський інсулін Приклад 8: Конструювання плазміди plNT3587, що кодує Glu (A5), His (A8), Glu (A15), Gly (A21) - препроінсулін Конструювання проводиться, на відміну від прикладу 1, усього з однією полімеразною ланцюговою реакцією. Продукт цієї реакції після відщеплення Nco1/Sal1 впроваджується у відкритий за допомогою Nco1/Sal1 plNT91d вектор ДНК. Використовуються праймери Tir і pint3580_Ea15rev згідно з прикладом 6. Матріцей є ДНК плазміди plNT3582. Правильні плазміди одержують позначення plNT3587. Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-2, яка утворюється після амідування аргінінамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 - людський інсулін Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-2b, яка утворюється після амідування лізинамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 - людський інсулін Приклад 9: Конструювання плазміди plNT3588, що кодує His (A8), Gly (A21),Asp (B3) препроінсулін Конструювання проводиться, як описане в прикладах 1 і 2, з 3 полімеразними ланцюговими реакціями. Продукт третьої реакції після відщеплення Nco1/Sal1 впроваджується у відкритий за допомогою Nco1/Sal1 plNT91d вектор ДНК. Використовуються праймери Tir і pint3580_glya21rev. Синтезовані два наступних праймера: pint3581_Db3f ' ' 5 -GCACGATTTGTGGACCAGCACCTGTGCGGC-3 (SEQ ID NO: 13) pint3581_Db3rev ' ' 5 -CACAGG TGCTGGTCCA CAAATCGTGC СGAATTTC-3 (SEQ ID NO: 14) Кодон, який кодує аспарагінову кислоту в позиції 3 інсуліну ланцюга В, кожний раз виділений жирним. Конструювання проводиться, як описано в прикладі 1. Матріцей є ДНК плазміди plNT3581. Правильні плазміди одержують позначення plNT3588. Приклад 10: Конструювання плазміди plNT3589, що кодує Glu (A5), His (A8), Gly (A21),Asp (B3) - препроінсулін Якщо провести реакції, як описано в прикладі 9, але в ПЦР1 і ПЦР2 як матриця використати ДНК плазміди plNT3582, то одержають плазміду plNT3589. Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-3, яка утворюється після амідування аргінінамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21),Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 - людський інсулін Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-3b, яка утворюється після амідування лізинамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21),Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) -NH2-людський інсулін Приклад 11: конструювання плазміди plNT3590, що кодує His (A8), Glu (A15), Gly (A21),Asp (B3) - препроінсулін 9 UA 103015 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Якщо провести реакції, як описано в прикладі 9, але в ПЦР1 і ПЦР2 як матриця використати ДНК плазміди plNT3585, то утвориться плазміда plNT3590. Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-4, яка утворюється після амідування аргінінамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21),Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 - людський інсулін Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-4b, яка утворюється після амідування лізинамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21),Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 - людський інсулін Приклад 12: Конструювання плазміди plNT3591, що кодує His (A8),Asp (A18), Gly (A21),Asp (B3) - препроінсулін Якщо провести реакції, як описано в прикладі 9, але в ПЦР1 і ПЦР2 як матриця використати ДНК плазміди plNT3586, то вийде плазміда plNT3591. Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-5, який утворюється після амідування аргінінамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8),Asp (A18), Gly (A21),Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 - людський інсулін Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-5b, яка утворюється після амідування лізинамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8),Asp (A18), Gly (A21),Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 - людський інсулін Приклад 13: Конструювання плазміди plNT3592, що кодує His (A8), Gly (A21),Asp (B3), Glu (B4) - препроінсулін Конструювання проводиться, як описане в прикладах 1 і 2, шляхом 3 полімеразних ланцюгових реакцій. Продукт третьої реакції після відщеплення Nco1/Sal1 впроваджується у відкритий за допомогою Nco1/Sal1 plNT91d вектор ДНК. Використовуються праймери Tir і pint3580_glya21rev. Синтезовані два наступних праймера: pint3581_Db3_Eb4f ' 5-GCACGATTTGTGGACGAGCACCTGTGCGGCTC-3 (SEQ ID NO: 15) pint3581_Db3_Eb4rev ' 5'-CGCACAGG TGCTCGTCCA CAAATCGTGC CGAATTTC-3 (SEQ ID NO: 16) Кодон, який кодує аспарагінову кислоту в позиції 3 і глутамінову кислоту в позиції 4 Вланцюга інсуліну, кожний раз виділений жирним. Конструювання проводиться, як описано в прикладі 1. Матрицею є ДНК плазміди plNT3581. Правильні плазміди одержують позначення plNT3592. Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-6, яка утворюється після амідування аргінінамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8), Gly (A21),Asp (B3), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 - людський інсулін Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-6b, яка утворюється після амідування лізинамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8), Gly (A21),Asp (B3), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 - людський інсулін Приклад 14: Конструювання плазміди plNT3593, що кодує His (A8), Gly (A21), Glu (B4) препроінсулін Конструювання проводиться, як описане в прикладах 1 і 2, шляхом 3 полімеразних ланцюгових реакцій. Продукт третьої реакції після відщеплення Nco1/Sal1 впроваджується у відкритий за допомогою Nco1/Sal1 plNT91d вектор ДНК. Використовуються праймери Tir і pint3580_glya21rev. Синтезовані два наступних праймери: pint3581_Eb4f ' 5'-ACGATTTGTGAACGAGCACCTGTGCGGCTC-3 (SEQ ID NO: 17) pint3581_Eb4rev ' ' 5 -CGCACAGG TGCTCGTTCA CAAATCGTGC CGAATTTC-3 (SEQ ID NO: 18) Кодон, що кодує глутамінову кислоту в позиції 4 В-ланцюга інсуліну, виділений жирним. Конструювання проводиться, як описано в прикладі 1. Матріцей є ДНК плазміди plNT3581. Правильні плазміди одержують позначення plNT3593. Приклад 15: Конструювання плазміди plNT3594, що кодує Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Glu (B4) - препроінсулін. Якщо провести реакції, як описано в прикладі 9, але в ПЦР1 і ПЦР2 як матриця використати ДНК плазміди plNT3582, то вийде плазміда plNT3594. Проінсулін є попередником сполуки YKL205-7, яка утворюється після амідування аргінінамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 - людський інсулін. Проінсулін є попередником сполуки YKL205-7b, яка утворюється після амідування лізинамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 - людський інсулін 10 UA 103015 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклад 16: Конструювання плазміди plNT3595, що кодує His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B4)-препроінсулін. Якщо провести реакції, як описано в прикладі 9, але в ПЦР1 і ПЦР2 як матриця використати ДНК плазміди plNT3585, то утвориться плазміда plNT3595. Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-8, яка утворюється після амідування аргінінамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 - людський інсулін Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-8b, яка утворюється після амідування лізинамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 - людський інсулін Приклад 17: Конструювання плазміди plNT3596, що кодує His (A8),Asp (A18), Gly (A21), Glu (B4) - препроінсулін Якщо провести реакції, як описано в прикладі 9, але в ПЦР1 і ПЦР2 як матриця використати ДНК плазміди plNT3586, то вийдеплазміда plNT3596. Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-9, яка утворюється після амідування аргінінамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8),Asp (A18), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 - людський інсулін Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-9b, яка утворюється після амідування лізинамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8),Asp (A18), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 - людський інсулін Приклад 18: Конструювання плазміди plNT3597, що кодує His (A8), Gly (A21), Glu (B0) препроінсулін Конструювання проводиться двома полімеразними ланцюговими реакціями. Використовується праймер pint3580_glya21rev. Синтезовані два наступних праймера: pint3581_Eb0f1 5'-CAACAGGAA ATTCGGCACG AGAGTTTGTG AACCAGCACCGTG-3' (SEQ ID NO: 19) pint3581_Eb01f2 ' 5 -TATCGA CCAT GG CAACAACA TCAACAGGAA ATTCGGCACG AGAG-3' (SEQ ID NO: 20) При цьому обидва праймера частково перекриваються. Pint3581_Eb0f2 містить послідовність розпізнавання Ncol. Це показано підкресленням. Кодон, який кодує глутамінову кислоту в позиції 0 на початку ланцюга В, кожний раз виділений жирним. Матрицею для ПЦР1 є ДНК плазміди plNT3581. ПЦР1 проводиться з парою праймерів pint3581_Eb-1f2/pint3580_glya21rev. Матрицею для ПЦР2 є продукт реакції ПЦР1. ПЦР2 проводиться з парою праймерів pint3581_Eb1f2/pint3580_glya21rev. Продукт ПЦР2 покриває повну послідовність препроінсуліну. Продукт другої реакції після відщеплення Nco1/Sal1 впроваджується у відкритий за допомогою Nco1/Sal1 plNT91d вектор ДНК. Правильні плазміди одержують позначення plNT3597. Якщо замінити кодон для глутамінової кислоти в позиції B0 кодоном для аспарагінової кислоти і слідувати прикладу, то вийдуть плазміди, які в позиції B0 замість глутаміновой кислоти несуть аспарагінову кислоту. Приклад 19: Конструювання плазміди plNT3598, що кодує Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Glu (B0) - препроінсулін Якщо вести реакції, як описано в прикладі 18, але на стадії ПЦР1 як матриця використати ДНК плазміди plNT3582, то вийде плазміда plNT3598. Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-10, яка утворюється після амідування аргінінамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 - людський інсулін Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-10b, яка утворюється після амідування лізинамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 - людський інсулін Приклад 20: Конструювання плазміди plNT3599, що кодує His(A8), Glu(A15), Gly(A21), Glu(B0) - препроінсулін Якщо вести реакції, як описано в прикладі 18, але на стадії ПЦР1 як матриця використати ДНК плазміди plNT3585, то утворюється плазміда plNT3599. Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-11, яка утворюється після амідування аргінінамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 - людський інсулін Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-11b, яка утворюється після амідування лізинамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 - людський інсулін 11 UA 103015 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Приклад 21: Конструювання плазміди plNT3600, що кодує His (A8),Asp (A18), Gly (A21), Glu (B0) - препроінсулін Якщо вести реакції, як описано в прикладі 18, але на стадії ПЦР1 як матриця використати ДНК плазміди plNT3586, то вийде плазміда plNT3600. Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-12, яка утворюється після амідування аргінінамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8),Asp (A18), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 - людський інсулін Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-12b, яка утворюється після амідування лізинамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8),Asp (A18), Gly (A21), Glu (B0)1 Arg (B31), Lys (B32) -NH2 - людський інсулін Приклад 22: Конструювання плазміди plNT3601, що кодує His (A8), Gly (A21),Asp (B1) препроінсулін Конструювання проводиться через дві полімеразні ланцюгові реакції. Використовується праймер pint3580_glya21rev. Синтезовані два наступних праймера: pint3581_Db1f1 ' 5 -CAACAGGAA ATTCGGCACG AGACGTG AACCAGCACC TGTGCG-3' (SEQ ID NO: 21) pint3581_Db1f2 ' 5 -TATCGA CCAT GG CAACAACA TCAACAGGAA ATTCGGCACG AGAC-3' (SEQ ID NO: 22) При цьому обидва праймера частково перекриваються. Pint3581_Db-1f2 містить послідовність розпізнавання Ncol. Це показано підкресленням. Кодон, який кодує аспарагінову кислоту в позиції 1 ланцюга В, кожний раз виділений жирним. Матрицею для ПЦР1 є ДНК плазміди plNT3581. ПЦР1 проводиться з парою праймерів pint3581_Db1f1/pint3580_glya21rev. Матрицею для ПЦР2 є продукт реакції ПЦР1. ПЦР2 проводиться з парою праймерів pint3581_Db1f2/pint3580_glya21rev. Продукт ПЦР2 покриває повну послідовність препроінсуліну. Продукт другої реакції після відщеплення Nco1/Sal1 впроваджується у відкритий за допомогою Nco1/Sal1 plNT91d вектор ДНК. Правильні плазміди одержують позначення plNT3601. Приклад 23: Конструювання плазміди plNT3602, що кодує Glu (A5), His (A8), Gly (A21),Asp (B1) - препроінсулін Якщо вести реакції, як описано в прикладі 22, але на стадії ПЦР1 як матриця використати ДНК плазміди plNT3582, то утворюється плазміда plNT3602. Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-13, яка утворюється після амідування аргінінамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21),Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 - людський інсулін Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-13b, яка утворюється після амідування лізинамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21),Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 - людський інсулін Приклад 24: Конструювання плазміди plNT3603, що кодує His (A8), Glu (A15), Gly (A21),Asp (B1) - препроінсулін Якщо вести реакції, як описано в прикладі 22, але на стадії ПЦР1 як матриця використати ДНК плазміди plNT3585, то вийде плазміда plNT3603. Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-14, яка утворюється після амідування аргінінамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21),Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 - людський інсулін Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-14b, яка утворюється після амідування лізинамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21),Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 - людський інсулін Приклад 25: Конструювання плазміди plNT3604, що кодує His (A8),Asp (A18), Gly (A21),Asp (B1) - препроінсулін Якщо вести реакції, як описано в прикладі 22, але на стадії ПЦР1 як матриця використати ДНК плазміди plNT3586, то утворюється плазміда plNT3604. Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-15, яка утворюється після амідування аргінінамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8),Asp (A18), Gly (A21),Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 - людський інсулін Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-15b, яка утворюється після амідування лізинамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8),Asp (A18), Gly (A21),Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 - людський інсулін Приклад 26: Конструювання плазміди plNT3605, що кодує His (A8), Gly (A21), Glu (B0),Asp (B1) - препроінсулін 12 UA 103015 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Конструювання проводиться двома полімеразними ланцюговими реакціями. Використовується праймер pint3580_glya21rev і описаний в прикладі 18 праймер pint3581_EbO1f2. Синтезований праймер pint3597_Db1f: 5'- CAACAGGAA ATTCGGCACG AGAGGACGTG AACCAGCACC TGTGC-3' (SEQ ID NO: 23) Кодон, який кодує глутамінову кислоту в позиції 0 і аспарагінову кислоту відповідно на початку В-ланцюга, кожний раз виділений жирним. Матрицею для ПЦР1 є ДНК плазміди plNT3597. ПЦР1 проводиться з парою праймерів pint3597_Db1f/pint3580_glya21rev. Матрицею для ПЦР2 є продукт реакції ПЦР1. ПЦР2 проводиться з парою праймерів pint3581_Eb1f2/pint3580_glya21rev. Продукт ПЦР2 покриває повну послідовність препроінсуліну. Продукт другої реакції після відщеплення Nco1/Sal1 впроваджується у відкритий за допомогою Nco1/Sal1 plNT91d вектор ДНК. Правильні плазміди одержують позначення plNT3605. Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-16, яка утворюється після амідування аргінінамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0),Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 - людський інсулін Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-16b, яка утворюється після амідування лізинамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0),Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) -NH2 - людський інсулін Приклад 27: Конструювання плазміди plNT3606, що кодує His (A8), Glu (A15),Asp (A18), Gly (A21), desThr (B30) - препроінсулін Конструювання проводиться, як описане в прикладах 1 і 2, через 3 полімеразні ланцюгові реакції. Використовуються праймери Tir і pint3580_glya21rev. Синтезовані два наступних праймера: desB30f ' 5 -TTCTACACACCCAAGCGCGATGTTCCTCAGGTGG-3' (SEQ ID NO: 24) desB30rev 5'-AGG AACATCGCGC TTGGGTGTGT AGAAGAAGC-3' (SEQ ID NO: 25) Матрицею для ПЦР1 і ПЦР2 є ДНК плазміди plNT3586. ПЦР1 проводиться з парою праймерів desB30f/pint3580_glya21rev, а ПЦР2 з парою праймерів Tir/desB30rev. Як матриця для ПЦР3 використовується еквімолярна суміш продуктів ПЦР1 і ПЦР2. Реакція проводиться з парою праймерів Tir/pint3580_glya21rev. Продукт ПЦР3 покриває повну послідовність препроінсуліну. Продукт цієї реакції після відщеплення Nco1/Sal1 впроваджується у відкритий за допомогою Nco1/Sal1 plNT91d вектор ДНК. Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-17, яка утворюється після амідування аргінінамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8), Glu (A15),Asp (A18), Gly (A21), Arg (B30), Arg (B31) -NH2 - людський інсулін Препроінсулін, що кодується плазмідою, є попередником сполуки YKL205-17b, яка утворюється після амідування лізинамідом і описується наступною структурою: Arg (A0), His (A8), Glu (A15),Asp (A18), Gly (A21), Arg (B30), Lys (B31) -NH2 - людський інсулін Приклад 28: Експресія деривата проінсуліну Експресія здійснюється відповідно до прикладу 1 європейської патентної заявки EP-A 1222207. Приклад 29: Згортання дериватів проінсуліну Згортання проводиться в основному згідно з способом, описаним в EP-A 0668282. Приклад 30: Ферментативна обробка згорненого препроінсуліну в 2-ланцюжковий попередник Arg (A0) - інсуліну, у якого С-кінець на кінці В-ланцюга характеризується лізином або аргініном. Ферментативна обробка згорненого попередника препроінсуліну проводиться, наприклад, як описано в прикладі 4 документа WO91/03550. Особливо переважним при цьому виявилося застосування описаних в WO 2007/031187 A1 варіантів з трипсином. Приклад 31: Одержання Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) -NH2 - людського інсуліну Незалежно від позиціонування додаткових кислих амінокислот, стандартна реакція проводиться таким чином: 100 мг Arg (A0), Gly (A21), Arg (B31) - аналога інсуліну розчиняють в 0,95 мл розчини аргінінаміду (446 г/л), додають 0,13 мл натрійацетатного буфера 1M (pH 5,8) і 2 мл ДМФ. Реакційну суміш охолоджують до 12C, реакцію запускають доданням 0,094 мл трипсину (0,075 мг, Roche Diagnostics). Через 8 год реакцію зупиняють доданням TFA до pH 2,5 і аналізують методом ВЕРХ. Утворюється більше > 60% Arg (A0), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) -NH2- людського інсуліну. Після додання розчину, що інгібує трипсин, проводиться очищення амідованого аналога аналогічно з документом US 5656722. 13 UA 103015 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Одержання відповідної лізинамідної сполуки проводиться аналогічно. Зрозуміло, виходять з концентрованого водного розчину лізинаміду, який містить 366 г/л лізинаміду. Приклад 32: Композиція з амідованими дериватами інсуліну Щоб деривати інсуліну згідно з винаходом перевірити на їх біологічні, фармакологічні і фізико-хімічні властивості, із сполук одержували розчин таким чином: дериват інсуліну згідно з винаходом розчиняли в цільовій концентрації 240±5 мкМ в 1 мМ соляній кислоті з 80 мкг/мл цинку (у вигляді хлориду цинку). Як розчинювальне середовище використовували наступні склади: a) 1 мМ соляної кислоти; b) 1 мМ соляної кислоти, 5 мкг/мл цинку (додані як хлорид цинку і соляна кислота); c) 1 мМ соляної кислоти, 10 мкг/мл цинку (додані як хлорид цинку і соляна кислота); d) 1 мМ соляної кислоти, 15 мкг/мл цинку (додані як хлорид цинку і соляна кислота); e) 1 мМ соляної кислоти, 30 мкг/мл цинку (додані як хлорид цинку і соляна кислота); f) 1 мМ соляної кислоти, 80 мкг/мл цинку (додані як хлорид цинку і соляна кислота); g) 1 мМ соляної кислоти, 120 мкг/мл цинку (додані як хлорид цинку і соляна кислота). Для цього спочатку відважують приблизно на 30% більш високу кількість висушеного сублімацією матеріалу, ніж потрібно на основі молекулярної ваги і бажаної концентрація. Потім фактичну концентрацію визначають з допомогою аналітичної ВЕРХ і потім розчин доповнюють що вимагається для досягнення цільової концентрації об'ємом соляної кислоти 5 мМ з 80 мкг/мл цинку. При необхідності значення pH при цьому додатково коректують на 3,5±0,1. Після остаточного ВЕРХ-аналізу для забезпечення цільової концентрації 240±5 мкМ готовий розчин шприцом з фільтрувальною насадкою 0,2 мкм переводять в стерильний бутель, закритий перегородкою і фланцевою кришкою. Для короткострокового однократного тестування дериватів інсуліну згідно з винаходом не проводилося ніякій оптимізації складів, наприклад, відносно добавок ізотонуючих агентів, консервантів або буферних речовин. Приклад 33: Оцінка на щурах знижуючої рівень цукру в крові дії нових аналогів інсуліну Знижуюча рівень цукру в крові дія вибраних нових аналогів інсуліну перевірялося на здорових нормоглікемічних самцях щурів Wistar. Самцям щурів підшкірно вводили дозу 9 нмоль/кг аналога інсуліну. Безпосередньо перед ін'єкцією аналога інсуліну і через рівні проміжки часу аж до восьми годин після ін'єкції у тварин брали кров для аналізу і визначали вміст цукру в крові. Експеримент ясно показав (див. фіг. 1), що аналог інсуліну, що використовується по винаходу веде на явно уповільнений початок дії і до більш тривалої рівномірної тривалості дії. Приклад 34: Оцінка на собаках знижуючої рівень цукру в крові дії нових аналогів інсуліну Знижуюча рівень цукру в крові дія вибраних нових аналогів інсуліну перевірялося на здорових нормоглікемічних самцях собак породи бігль. Самцям тваринних підшкірно вводили дозу 6 нмоль/кг аналога інсуліну. Безпосередньо перед ін'єкцією аналога інсуліну і через рівні проміжки часу аж до сорока восьми годин після ін'єкції у тварин брали кров для аналізу і визначали вміст цукру в крові. Експеримент ясно показав (див. фіг. 2), що аналог інсуліну, що використовується по винаходу веде на явно уповільнений початок дії і до більш тривалої рівномірної тривалості дії. Приклад 35: Оцінка на собаках знижуючого рівень цукру в крові дії при двократно підвищеній дозі Знижуюча рівень цукру в крові дія вибраних нових аналогів інсуліну перевірялося на здорових нормоглікемічних самцях собак породи бігль. Самцям тваринних підшкірно вводили дозу 6 нмоль/кг і 12 нмоль/кг аналоги інсуліну. Безпосередньо перед ін'єкцією аналога інсуліну і через рівні проміжки часу аж до сорока восьми годин після ін'єкції у тварин брали кров для аналізу і визначали вміст цукру в крові. Експеримент ясно показав (див. фіг. 3), що аналог інсуліну, що використовується по винаходу діє в залежності від дози, але що, незважаючи на подвоєну дозу, дія протікає плавно, тобто не спостерігається вираженої нижчої точки (надиру). З цього можна укласти, що інсуліни по винаходу в порівнянні з відомими інсулінами уповільненої дії ведуть до значно більш низькому числу гіпоглікемічних подій. Приклад 36: Оцінка на собаках знижуючої рівень цукру в крові дії при різних концентраціях цинку в композиції Експерименти проводилися, як описано в прикладі 35. Результат показаний на фігурі 4. В відповідності з нею, на криві час/дія аналога інсуліну згідно з винаходом при рівній концентрації інсуліну можна впливати вмістом іонів цинку в композиції, так що при нульовому або низькому вмісті цинку спостерігається швидке настання дії, і дія зберігається більше 24 годин, тоді як при більш високому вмісті цинку спостерігається більш плавний початок дії, і дія інсуліну продовжується помітно більше 24 годин. 60 14 UA 103015 C2 15 UA 103015 C2 16 UA 103015 C2 17 UA 103015 C2 18 UA 103015 C2 19 UA 103015 C2 20 UA 103015 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 1. Аналог інсуліну формули I ланцюг А ланцюг В 10 15 20 25 30 , причому є наступні відповідності: A0 Lys або Arg; A5 Asp, Gln або Glu; A15 Asp, Glu або Gln; A18 Asp, Glu або Asn; В-1 Asp, Glu або аміногрупа; B0 Asp, Glu або хімічний зв'язок; B1 Asp, Glu або Phe; B2 Asp, Glu або Val; B3 Asp, Glu або Asn; B4 Asp, Glu або Gln; B29 Lys або хімічний зв'язок; B30 Thr або хімічний зв'язок; B31 Arg, Lys або хімічний зв'язок; B32 Arg-амід або Lys-амід, причому два амінокислотних залишки групи, що містить A5, A15, A18, В-1, B0, B1, B2, B3 і B4, одночасно і незалежно один від одного, відповідають Asp або Glu. 2. Аналог інсуліну за п. 1, причому A0 відповідає Arg. 3. Аналог інсуліну за одним або декількома попередніми пунктами, причому A5 відповідає Glu. 4. Аналог інсуліну за одним або декількома попередніми пунктами, причому A15 відповідає Glu. 5. Аналог інсуліну за одним або декількома попередніми пунктами, причому A18 відповідає Asp. 6. Аналог інсуліну за одним або декількома попередніми пунктами, причому В-1 відповідає аміногрупі. 7. Аналог інсуліну за одним або декількома попередніми пунктами, причому B0 відповідає Glu. 21 UA 103015 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8. Аналог інсуліну за одним або декількома попередніми пунктами, причому B1 відповідає Asp. 9. Аналог інсуліну за одним або декількома попередніми пунктами, причому B2 відповідає Val. 10. Аналог інсуліну за одним або декількома попередніми пунктами, причому B3 відповідає Asp. 11. Аналог інсуліну за одним або декількома попередніми пунктами, причому B4 відповідає Glu. 12. Аналог інсуліну за одним або декількома попередніми пунктами, причому B29 відповідає Lys. 13. Аналог інсуліну за одним або декількома попередніми пунктами, причому B30 відповідає Thr. 14. Аналог інсуліну за одним або декількома попередніми пунктами, причому B31 відповідає Arg або Lys. 15. Аналог інсуліну за одним або декількома попередніми пунктами, причому B32 відповідає Arg-NH2 або Lys-NH2. 16. Аналог інсуліну за одним або декількома попередніми пунктами, вибраний з групи, що містить: Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Glu (A15), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Glu (A15), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B30), Arg (B31) - NH2 - людський інсулін, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B30), Lys (B31) - NH2 - людський інсулін. 17. Спосіб одержання аналога інсуліну за одним з пп. 1-16, причому одержують рекомбінантно попередник аналога інсуліну, попередник ферментативно обробляють з одержанням дволанцюжкового інсуліну, проводять сполучення з аргінінамідом в присутності ферменту з трипсиновою активністю, і виділяють аналог інсуліну. 18. Застосування аналога інсуліну за одним з пп. 1-16 для одержання лікарського засобу для лікування цукрового діабету. 19. Застосування за п. 18 в способі одержання лікарського засобу для лікування цукрового діабету типу I або типу II або для терапевтичної підтримки регенерації бета-клітин. 20. Лікарський засіб, який містить аналог інсуліну за одним з пп. 1-16 і/або його фізіологічно прийнятні солі. 21. Композиція, яка містить аналог інсуліну за одним з пп. 1-16. 22 UA 103015 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 22. Композиція за п. 21, причому композиція знаходиться у водній формі, що містить розчинений аналог інсуліну. 23. Композиція за п. 21, причому композиція знаходиться у вигляді порошку. 24. Композиція за п. 23, причому аналог інсуліну за одним з пп. 1-16 знаходиться в кристалічній і/або аморфній формі. 25. Композиція за п. 21, причому композиція знаходиться в формі суспензії. 26. Композиція за п. 21, причому композиція додатково містить хімічний шаперон. 27. ДНК, яка кодує попередник аналога інсуліну за одним з пп. 1-16. 28. ДНК за п. 27, яка включає кодуючий А-ланцюг аналога інсуліну за одним з пп. 1-16. 29. ДНК за п. 27, яка включає кодуючий В-ланцюг аналога інсуліну за одним з пп. 1-16. 30. Вектор, який містить ДНК за одним або декількома пунктами 27-29. 31. Організм-хазяїн, який містить ДНК за одним або декількома пунктами 27-29 або вектор за п. 30. 32. Композиція за одним або декількома пунктами 21-26, в якій додатково містяться глюкагоноподібні пептиди-1 (GLP1) або їх аналог або похідне, або ексендин-3 або -4 або його аналог або похідне. 33. Композиція за п. 32, в якій додатково міститься ексендин-4. 34. Композиція за п. 32, в якій аналог ексендину-4 вибраний з групи, що містить: 36 H-desPro -Exendin-4-Lys6-NH2, 36,37 H-des(Pro )-Exendin-4-Lys4-NH2 і 36,37 H-des(Pro )-Exendin-4-Lys5-NH2, або їх фармакологічно прийнятну сіль. 35. Композиція за п. 32, в якій аналог ексендину-4 вибраний з групи, що містить: 36 28 desPro [Asp ]Exendin-4(1-39), 36 28 desPro [IsoAsp ]Exendin-4(1-39), 36 14 28 desPro [Met(О) ,Asp ]Exendin-4(1-39), 36 14 28 desPro [Met(О) , IsoAsp ]Exendin-4(1-39), 36 25 28 desPro [Trp(O2) ,Asp ]Exendin-2(1-39), 36 25 28 desPro [Trp(O2) , IsoAsp ]Exendin-2(1-39), 36 14 25 28 desPro [Met(О) Trp(O2) ,Asp ]Exendin-4(1-39) і 36 14 25 28 desPro [Met(О) Trp(O2) , IsoAsp ]Exendin-4(1-39) або його фармакологічно прийнятну сіль. 36. Композиція за п. 35, в якій до С-кінців аналогів ексендину-4 приєднаний пептид -Lys6-NH2. 37. Композиція за п. 32, в якій аналог ексендину-4 вибраний з групи, що містить: 36 28 Н-(Lys)6-desPro [Asp ]Exendin-4(1-39)-Lys6-NH2, 28 36 37 38 desAsp Pro ,Pro ,Pro Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 28 Н-(Lys)6-desPro ,Pro ,Pro [Asp ]Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 28 H-Asn-(Glu)5-desPro ,Pro ,Pro [Asp ]Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 28 desPro ,Pro ,Pro [Asp ]Exendin-4(1-39)-(Lys)6-NH2, 36 37 38 28 Н-(Lys)6-desPro ,Pro ,Pro [Asp ]Exendin-4(1-39)-(Lys)6-NH2, 36 37 38 28 H-Asn-(Glu)5-desPro ,Pro ,Pro [Asp ]Exendin-4(1-39)-(Lys)6-NH2, 36 25 28 Н-(Lys)6-desPro [Trp(O2) ,Asp ]Exendin-4(1-39)-Lys6-NH2, 28 36 37 38 25 H-desAsp Pro ,Pro ,Pro [Trp(O2) ]Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 25 28 Н-(Lys)6-desPro ,Pro ,Pro [Trp(O2) ,Asp ]Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 25 28 H-Asn-(Glu)5-desPro ,Pro ,Pro [Trp(O2) ,Asp ]Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 25 28 desPro ,Pro ,Pro [Trp(O2) ,Asp ]Exendin-4(1-39)-(Lys)6-NH2, 36 37 38 25 28 Н-(Lys)6-desPro ,Pro ,Pro [Trp(O2) ,Asp ]Exendin-4(1-39)-(Lys)6-NH2, 36 37 38 25 28 H-Asn-(Glu)5-desPro ,Pro ,Pro [Trp(O2) ,Asp ]Exendin-4(1-39)-(Lys)6-NH2, 36 14 28 Н-(Lys)6-desPro [Met(О) ,Asp ]Exendin-4(1-39)-Lys6-NH2, 14 28 37 38 desMet(О) Asp ,Pro36,Pro ,Pro Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 14 28 Н-(Lys)6-desPro ,Pro ,Pro [Met(О) ,Asp ]Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 14 28 H-Asn-(Glu)5-desPro ,Pro ,Pro [Met(О),Asp ]Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 14 28 desPro ,Pro ,Pro [Met(О) ,Asp ]Exendin-4(1-39)-(Lys)6-NH2, 36 37 38 14 28 Н-(Lys)6-desPro ,Pro ,Pro [Met(О) ,Asp ]Exendin-4(1-39)-Lys6-NH2, 36 37 38 14 28 H-Asn-(Glu)5-desPro ,Pro ,Pro [Met(О) ,Asp ]Exendin-4(1-39)-(Lys)6-NH2, 36 14 25 28 Н-(Lys)6-desPro [Met(О) ,Trp(O2) ,Asp ]Exendin-4(1-39)-Lys6-NH2, 28 36 37 38 14 25 desAsp Pro ,Pro ,Pro [Met(О) ,Trp(O2) ]Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 14 25 28 Н-(Lys)6-desPro ,Pro ,Pro [Met(О) ,Trp(O2) ,Asp ]Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 14 28 H-Asn-(Glu)5-desPro ,Pro ,Pro [Met(О) ,Asp ]Exendin-4(1-39)-NH2, 36 37 38 14 25 28 desPro ,Pro ,Pro [Met(О) ,Trp(O2) ,Asp ]Exendin-4(1-39)-(Lys)6-NH2, 23 UA 103015 C2 36 5 10 37 38 14 25 28 Н-(Lys)6-desPro ,Pro ,Pro [Met(О) ,Trp(O2) ,Asp ]Exendin-4(1-39)-(Lys)6-NH2, 36 37 38 14 25 28 H-Asn-(Glu)5-desPro ,Pro ,Pro [Met(О) ,Trp(O2) ,Asp ]Exendin-4(1-39)-(Lys)6-NH2 або його фармакологічно прийнятну сіль. 34 26 ε α 38. Композиція за п. 32, в якій додатково міститься Arg ,Lys (N (γ-глутаміл(N гексадеканоїл)))GLP-1(7-37) [ліраглютид] або його фармакологічно прийнятна сіль. 39. Водна композиція аналога інсуліну за одним з пп. 1-16, яка не містить цинку або містить менше 15 мкг/мл цинку. 40. Водна композиція аналога інсуліну за одним з пп. 1-16, яка не містить цинку або містить від менше 15 мкг/мл до 2 мг/мл цинку. 41. Композиція за п. 40, в якій міститься 200 мкг/мл цинку. 24 UA 103015 C2 Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 25