Генетичні локуси, пов’язані зі стійкістю до летючої сажки у маїсу

Реферат: Винахід належить до способу забезпечення стійкості до летючої сажки за допомогою картування QTL, що надають стійкість до летючої сажки. Застосування послідовностей нуклеїнових кислот з генетичного локусу, що надає стійкість до летючої сажки, генів, що кодують білки, які надають стійкість до летючої сажки. UA 106722 C2 (12) UA 106722 C2 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Дана заявка витребовує пріоритет Попередньої Заявки США № 61/090704, поданої 21 серпня 2008, зміст якої включений в даний документ за допомогою посилання. Галузь винаходу Даний винахід відноситься до композицій і способів, придатних для збільшення стійкості до летючої сажки у маїсу. Передумови винаходу Летюча сажка являє собою системне захворювання у маїсу, що передається через ґрунт (Frederiksen 1977), викликане хазяїн-специфічним грибом Sphacelotheca reiliana (Kühn) Clint. Теліоспори з сорусів, занурених у ґрунт, є первинним джерелом інфекції, і можуть зберігатися три роки в ґрунті без втрати будь-якої інфікуючої здатності (Wu et al. 1981). Гриб інфікує розсаду через корені або колеоптилі під час і після проростання насіння (Krüger 1962). При інфікуванні сприйнятливого сорту рослини продовжують нормальний вегетативний ріст, але деякі можуть припиняти зростання (Matyac and Kommedahl 1985a). При дозріванні соруси заміщують качани або волоті інфікованих рослин, призводячи до того, що врожай з рослини маїсу майже відсутній. Співвідношення інфікованих рослин на інфікованому полі може складати до 80 % (Frederiksen 1977). Jin (2000) повідомляв, що частота цієї хвороби варіювала від 7,0 % до 35,0 %, іноді навіть досягаючи 62,0 %, виникаючи в результаті культивування сприйнятливих культурних сортів. У Північному Китаї летюча сажка спричиняє втрату врожаю до 0,3 мільйонів тонн щорічно (Bai et al. 1994). Повідомлялося, що маїс у Південній Європі, Північній Америці та Азії також серйозно страждає від цієї хвороби (Xu et al. 1999). Беручи до уваги як економічні, так і екологічні елементи, культивування стійких сортів є ефективним шляхом контролю епідемій летючої сажки. Селекція за генами множинної стійкості/QTL (локуси кількісної ознаки) проти летючої сажки в елітних сортах маїсу буде перспективним шляхом для поліпшення стійкості проти цієї хвороби. На даний час, багато дослідників дослідили генетичні моделі, обговорюючи стійкість проти летючої сажки. Mei et al. (1982) повідомляв, що стійкість проти летючої сажки контролювалася частково домінантними ядерними генами, не виявляючи відмінності в реципрокних схрещуваннях. Ma et al. (1983) повідомляв, що стійкість маїсу до летючої сажки є кількісною ознакою, на яку впливають гени часткової стійкості та їх неалельні взаємодії. Stromberg et al. (1984) відкрив, що F1 популяція показувала проміжну захворюваність між резистентним і сприйнятливим батьками. Ali і Baggett (1990) повідомляли, що адитивні і домінантні генетичні дії є переважними при різних обробках. Bernardo et al. (1992) вивчав генетичний ефект гена(ів) стійкості шляхом використання усередненого аналізу поколінь, підтверджуючи те, що адитивний ефект є очевидним, тоді як домінантний і епістатичний ефекти є слабкими. Shi et al. (2005) повідомляв, що крім адитивного ефекту, наддомінування також відіграє ключову роль у стійкості проти летючої сажки. Очевидно, що стійкість проти летючої сажки у маїсу може включати ряд генетичних елементів і діяти комплексним шляхом. Короткий опис даного винаходу Забезпечуються композиції і способи для визначення і селекції рослин маїсу зі збільшеною стійкістю до летючої сажки. У першому варіанті здійснення даний винахід стосується виділеного полінуклеотиду, що включає полінуклеотид, вибраний з групи, яка включає: (a) щонайменше, одну нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид, який надає або поліпшує стійкість до летючої сажки, вибрану з групи, що включає SEQ ID NO:27, 32, 35, 38, 41, 44, 105, 108, 111, 113 і 116; (b) щонайменше, одну нуклеотидну послідовність, здатну кодувати поліпептид, яка надає або посилює стійкість до летючої сажки, вибрану з групи, що включає SEQ ID NO:25, 26, 30, 31, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 45, 104, 106, 107, 109, 110, 112, 114, 115 і 117; і (c) комплементарну до нуклеотидної послідовності частину (a) або (b), де комплементарна та нуклеотидна послідовність складаються з однакового числа нуклеотидів і є 100 % комплементарними. В другому варіанті здійснення даний винахід стосується вектора, що містить заявлений виділений полінуклеотид. У третьому варіанті здійснення даний винахід стосується рекомбінантного ДНК-конструкта, що містить ізольований полінуклеотид даного винаходу, функціонально пов'язаний із, щонайменше, однією регуляторною послідовністю. У четвертому варіанті здійснення даний винахід стосується клітини маїсу, що містить рекомбінантний ДНК-конструкт або ізольований полінуклеотид даного винаходу. У п'ятому варіанті здійснення даний винахід стосується способу одержання рослини маїсу, що включає трансформацію клітини рослини з рекомбінантним ДНК-конструктом даного 1 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходу і регенерацію рослини з трансформованої клітини рослини. У шостому варіанті здійснення даний винахід стосується рослини маїсу, що містить рекомбінантний ДНК-конструкт даного винаходу. У сьомому варіанті здійснення даний винахід стосується насіння маїсу, що містить рекомбінантний ДНК-конструкт даного винаходу. У восьмому варіанті здійснення даний винахід стосується способу забезпечення або поліпшення стійкості до летючої сажки, що включає трансформацію рослини з рекомбінантним ДНК-конструктом даного винаходу, таким чином, надаючи або поліпшуючи стійкість до летючої сажки. У дев'ятому варіанті здійснення даний винахід стосується способу визначення присутності або відсутності полінуклеотиду даного винаходу в рослині маїсу, що включає, щонайменше, одне з наступного: (a) виділення молекул нуклеїнової кислоти з зазначеної рослини маїсу та ампліфікацію послідовностей, гомологічних з полінуклеотидом даного винаходу, або (b) виділення молекул нуклеїнової кислоти з зазначених рослин маїсу та проведення Саузерн-гібридизації, або (c) виділення білків із зазначеної рослини маїсу і проведення вестерн-блотингу з використанням антитіл до білка, або (d) виділення білків із зазначеної рослини маїсу і проведення аналізу ELISA з використанням антитіл до білка, або (e) демонстрацію присутності послідовностей мРНК, отриманих від мРНК транскрипту і властивих лише локусу стійкості до летючої сажки, таким чином, визначаючи присутність полінуклеотиду даного винаходу в зазначеній рослині маїсу. У десятому варіанті здійснення даний винахід стосується способу визначення присутності або відсутності локусу стійкості до летючої сажки в рослині маїсу, що включає, щонайменше, одне з наступного: (a) виділення молекул нуклеїнової кислоти з зазначеної рослини маїсу та ампліфікацію послідовностей, властивих тільки полінуклеотиду даного винаходу, або (b) виділення білків із зазначеної рослини маїсу і проведення вестерн-блотингу, використовуючи антитіла до білка, або (c) виділення білків із зазначеної рослини маїсу і проведення аналізу ELISA, використовуючи антитіла до білка, або (d) демонстрацію присутності мРНК послідовностей, отриманих від мРНК транскрипту і властивих тільки локусу стійкості до летючої сажки, таким чином, визначаючи присутність локусу стійкості до летючої сажки в зазначеній рослині маїсу. В одинадцятому варіанті здійснення даний винахід стосується способу зміни рівня експресії білка, здатного надавати стійкість до летючої сажки клітині маїсу, що включає: (a) трансформацію клітини маїсу з рекомбінантним ДНК-конструктом даного винаходу і (b) вирощування трансформованої клітини маїсу при умовах, що є придатними для експресії рекомбінантного ДНК-конструкта, де експресія рекомбінантного ДНК-конструкта призводить до продукції змінених рівнів білка, здатного надавати стійкість до летючої сажки в трансформованій клітині маїсу в порівнянні з рівнями експресії в рослині маїсу дикого типу, що має стійкість до летючої сажки. У дванадцятому варіанті здійснення даний винахід стосується способу зміни рівня експресії білка, здатного надавати стійкість до летючої сажки в клітині маїсу, що включає: (a) трансформацію клітини маїсу з рекомбінантним ДНК-конструктом даного винаходу і (b) вирощування трансформованої клітини маїсу при умовах, що є придатними для експресії рекомбінантного ДНК-конструкта, де експресія рекомбінантного ДНК-конструкта приводить до продукції змінених рівнів білка, здатного надавати стійкість до летючої сажки в трансформованій клітині маїсу в порівнянні з рівнями експресії в рослині маїсу дикого типу, що має стійкість до летючої сажки. У тринадцятому варіанті здійснення даний винахід стосується способу зміни рівня експресії білка, здатного надавати стійкість до летючої сажки в рослині маїсу, що включає: (a) трансформацію клітини рослини маїсу з рекомбінантним ДНК-конструктом даного винаходу; і (b) регенерацію трансформованої рослини маїсу з трансформованої клітини рослини маїсу; і (c) вирощування трансформованої рослини маїсу при умовах, що є придатними для експресії рекомбінантного ДНК-конструкта, де експресія рекомбінантного ДНК-конструкта 2 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 призводить до продукції змінених рівнів білка, здатного додавати стійкість до летючої сажки в трансформованій рослині маїсу в порівнянні з рівнями експресії в рослині маїсу дикого типу, що має стійкість до летючої сажки. У чотирнадцятому варіанті здійснення даний винахід стосується способу зміни рівня експресії білка, здатного додавати стійкість до летючої сажки в рослині маїсу, що включає: (a) трансформування клітини рослини маїсу з рекомбінантним ДНК-конструктом даного винаходу; і (b) регенерацію трансформованої рослини маїсу з трансформованої клітини рослини маїсу; і (c) вирощування трансформованої рослини маїсу при умовах, що є придатними для експресії рекомбінантного ДНК-конструкта, де експресія рекомбінантного ДНК-конструкта призводить до продукції змінених рівнів білка, здатного надавати стійкість до летючої сажки в трансформованій рослині маїсу в порівнянні з рівнями експресії в рослині маїсу дикого типу, що має стійкість до летючої сажки. У п'ятнадцятому варіанті здійснення даний винахід стосується способу визначення рослини маїсу, що виявляє стійкість до летючої сажки, де спосіб включає виявлення в рослині маїсу генетичного маркерного локусу, де: (a) генетичний маркерний зонд, що містить весь або частину генетичного маркерного локусу, або комплементарний йому, гібридизується при жорстких умовах з bacm.pk071.j12, bacm.pk007.18 і bacm2.pk166.h1; і (b) зазначений генетичний маркерний локус містить, щонайменше, один алель, що пов'язаний зі стійкістю до летючої сажки. У шістнадцятому варіанті здійснення даний винахід стосується способу визначення рослини маїсу, що виявляє стійкість до летючої сажки, де спосіб включає виявлення в ідіоплазмі рослини маїсу, щонайменше, одного алеля маркерного локусу, де: (a) маркерний локус знаходиться в 7 cM SSR148152, CAPS25082, STS171, SNP661 і STS1944; і (b) щонайменше, один алель пов'язаний зі стійкістю до летючої сажки. У сімнадцятому варіанті здійснення даний винахід стосується способу визначення рослини маїсу, що виявляє стійкість до летючої сажки, де спосіб включає виявлення в ідіоплазмі рослини маїсу, щонайменше, одного алеля маркерного локусу, де: (a) маркерний локус розташований у хромосомній ділянці, що містить і фланкована umc1736 і umc2184 або в хромосомній ділянці, що містить і фланкована SSR148152/SNP661; і (b) щонайменше, один алель пов'язаний зі стійкістю до летючої сажки. У вісімнадцятому варіанті здійснення даний винахід стосується способу селекції з використанням маркера, що включає: (a) одержання першої рослини маїсу, яка має, щонайменше, один алель маркерного локусу, де маркерний локус розташований у 7 cM SSR148152, CAPS25082, STS171, SNP661 і STS1944 на публічній IBM генетичній карті, і алель пов'язаний зі збільшеною стійкістю до летючої сажки; (b) схрещування зазначеної першої рослини маїсу з другою рослиною маїсу; (c) оцінку потомства стосовно, щонайменше, зазначеного алеля; і (d) добір потомства рослин маїсу, які мають, щонайменше, зазначений алель. У дев'ятнадцятому варіанті здійснення даний винахід стосується способу селекції з використанням маркера, що включає: (a) одержання першої рослини маїсу, яка має, щонайменше, один алель маркерного локусу, де маркерний локус розташований у хромосомній ділянці, що містить і фланкована umc1736 і umc2184, і алель пов'язаний зі збільшеною стійкістю до летючої сажки; (b) схрещування зазначеної першої рослини маїсу з другою рослиною маїсу; (c) оцінку потомства стосовно, щонайменше, зазначеного алеля; і (d) добір потомства рослин маїсу, які мають, щонайменше, зазначений алель. У дев'ятнадцятому варіанті здійснення даний винахід стосується способу виявлення локусу стійкості до летючої сажки, що включає виявлення присутності, щонайменше, одного маркерного алеля, вибраного з групи, що включає: MZA6393, 1M2-9, E6765-3, 2M4-1, 2M10-5, 2M11-3, 3M1-25 і STS148-1. Також зрозуміло, що в будь-якому із згаданих вище способів, кожний з описаних маркерних алелів, пов'язаних зі стійкістю до летючої сажки, може бути пов'язаний з будь-яким іншим маркерним алелем. Цей другий маркерний алель буде також пов'язаним зі стійкістю до летючої сажки і буде придатним в способах, описаних вище. Короткий опис фігур і Списків послідовностей Даний винахід можна зрозуміти більш повно з наступного докладного опису і супровідних графічних матеріалів і Списку послідовностей, що утворює частину даної заявки. Список 3 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовностей містить однобуквений код для умовних позначок нуклеотидної послідовності і трибуквені коди для амінокислот, як визначено відповідно до IUPAC-IUBMB стандартів, описаних в Nucleic Acids Research 13:3021-3030 (1985) і в Biochemical Journal 219 (No. 2): 345373 (1984), що включені в даний документ в їх повноті за допомогою посилання. Символи і формат, використані для даної нуклеотидної і амінокислотної послідовності, узгоджуються з правилами, викладеними в 37 C.F.R. § 1,822. ФІГУРА 1. Створення SNP маркера (SNP140313) для AZM4_140313 (зібрана Zea mays послідовність з TIGR) і його застосування в генотипуванні BC популяцій. ФІГУРА 2. Генетичне картування новостворених маркерів у bin2.09 області. ФІГУРА 3. Вирівнювання гена інгібітору ксиланази з Mo17 і B73. Mo17 послідовність виявляється в qHSR1, локусі, що надає стійкість до летючої сажки в маїсу. B73 є сортом маїсу, сприйнятливим до летючої сажки. ФІГУРА 4. Порівняльний малюнок Mo17, B73 і Huangzhao геномної структури в qHSR області. Як B73, так і Huangzhao мають делеції в області в порівнянні з Mo17. Маркери, що згадуються в даному винаході, показані зверху. Зазначено шість генів, що представляють інтерес: ген гідролази, властивий тільки Mo17; Ген 1, і білок з анкіриновим повтором, виявлений в усіх трьох лініях; Ген 2, що є асоційованою з клітинною стінкою кіназою, виявляється в Mo17 і B73; Ген 3 і Ген 4 відносяться до LRR-Xa21-подібних кіназ, що властиві лише Mo17; і Ген 5 являє собою третю LRR-Xa21D-подібну кіназу, що цілком або частково виявляється у всіх трьох лініях. Mo17 складає 172 т.н. (тисяча нуклеотидів) у довжину в цій області, і Huangzhao складає 56 т.н. у довжину. Опис послідовностей і доданий до нього Список послідовностей узгоджуються з правилами, що регулюють розкриття нуклеотидних і/або амінокислотних послідовностей у патентних заявках, як викладено в 37 C.F.R. §1.821-1.825. Список послідовностей містить однобуквений код для умовних позначень нуклеотидної послідовності і трибуквені коди для амінокислот, як визначено відповідно до IUPAC-IUBMB стандартів, описаних в Nucleic Acids Res. 13:3021-3030 (1985) і в Biochemical J. 219 (2):345-373 (1984), що включені в даний документ за допомогою посилання. Символи і формат, використані для даних нуклеотидних і амінокислотних послідовностей узгоджуються з правилами, викладеними в 37 C.F.R. §1,822. SEQ ID NO:1 являє собою праймер ампліфікації CAPS25082-L. SEQ ID NO:2 являє собою праймер ампліфікації CAPS25082-R. SEQ ID NO:3 являє собою праймер ампліфікації SNP140313-L. SEQ ID NO:4 являє собою праймер ампліфікації SNP140313-R. SEQ ID NO:5 являє собою праймер ампліфікації SNP140313-snpL. SEQ ID NO:6 являє собою праймер ампліфікації SNP140313-snpR. SEQ ID NO:7 являє собою праймер ампліфікації SNP661-L. SEQ ID NO:8 являє собою праймер ампліфікації SNP661-R. SEQ ID NO:9 являє собою праймер ампліфікації SNP661-snpL. SEQ ID NO:10 являє собою праймер ампліфікації SNP661-snpR. SEQ ID NO:11 являє собою праймер ампліфікації STS1944-L. SEQ ID NO:12 являє собою праймер ампліфікації STS1944-R. SEQ ID NO:13 являє собою праймер ампліфікації STS171-L. SEQ ID NO:14 являє собою праймер ампліфікації STS171-R. SEQ ID NO:15 являє собою праймер ампліфікації SSR148152-L. SEQ ID NO:16 являє собою праймер ампліфікації SSR148152-R. SEQ ID NO:17 являє собою праймер ампліфікації STSrga3195-L. SEQ ID NO:18 являє собою праймер ампліфікації STSrga3195-R. SEQ ID NO:19 являє собою праймер ампліфікації STSrga840810-L. SEQ ID NO:20 являє собою праймер ампліфікації STSrga840810-R. SEQ ID NO:21 являє собою праймер ампліфікації STSsyn1-L. SEQ ID NO:22 являє собою праймер ампліфікації STSsyn1-R. SEQ ID NO:23 являє собою MZA6393 маркер (з bacm.pk071.j12.f), що визначає один кінець BAC контига, що покриває qHSR1 локус. Huangzhao і B73 версії цієї маркерної області виявлені в SEQ ID NO:47 і 48, відповідно. SEQ ID NO:24 являє собою ST148 маркер з Mo17 версії ZMMBBc0478L09f, що визначає один кінець BAC контига, що покриває qHSR1 локус. Huangzhao версія цієї маркерної області може бути виявлена в SEQ ID NO:49. SEQ ID NO:25 являє собою BAC контиг, що складається з клонів bacm.pk071.j12, bacm.pk007.18 і bacm2.pk166.h1, які перекриваються, що покриває qHSR1 локус. SEQ ID NO:26 являє собою послідовність нуклеїнової кислоти з Mo17, що представляє 4 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кодуючу область для гена інгібітора ксиланази, що міститься в qHRS1 локусі. SEQ ID NO:27 являє собою продукт трансляції SEQ ID NO:26. SEQ ID NO:28 являє собою послідовність нуклеїнової кислоти з B73, що представляє кодуючу область для гена інгібітора ксиланази, що міститься в області B73 геному, що є синтетичною відносно qHRS1 локусу. SEQ ID NO:29 являє собою продукт трансляції SEQ ID NO:28. SEQ ID NO:30 являє собою область геномної ДНК із Mo17, що кодує інгібітор ксиланази SEQ ID NO:26/27 і 3 т.н. вище кодуючої області. SEQ ID NO:31 являє собою послідовність нуклеїнової кислоти з Mo17, що представляє кодуючу область для гена білка кінази, асоційованої з клітинною стінкою, що міститься у qHRS1 локусі. SEQ ID NO:32 являє собою продукт трансляції SEQ ID NO:31. SEQ ID NO:33 являє собою область геномної ДНК із Mo17, що кодує білок асоційованої з клітинною стінкою кінази SEQ ID NO:31/32 і 2,4 т.н. вище кодуючої області. SEQ ID NO:34 являє собою послідовність нуклеїнової кислоти з Mo17, що представляє кодуючу область для гена білка димеризації сімейства HAT (PCO662117), що міститься в qHRS1 локусі. SEQ ID NO:35 являє собою продукт трансляції SEQ ID NO:34. SEQ ID NO:36 являє собою область геномної ДНК із Mo17, що кодує ген білка димеризації сімейства HAT SEQ ID NO:34/35 і 2,4 т.н. вище кодуючої області. SEQ ID NO:37 являє собою послідовність нуклеїнової кислоти з Mo17, що представляє кодуючу область для гена білка димеризації сімейства HAT (PCO66 2162/PCO548849/PCO523172), що міститься в qHRS1 локусі. SEQ ID NO:38 являє собою продукт трансляції SEQ ID NO:37. SEQ ID NO:39 являє собою область геномної ДНК із Mo17, що кодує ген білка димеризації сімейства HAT SEQ ID NO:37/38 і 2,4 т.н. вище кодуючої області. SEQ ID NO:40 являє собою послідовність нуклеїнової кислоти з Mo17, що представляє кодуючу область для гена неохарактеризованого білка (PCO648231), що міститься в qHRS1 локусі. SEQ ID NO:41 являє собою продукт трансляції SEQ ID NO:40. SEQ ID NO:42 являє собою область геномної ДНК із Mo17, що кодує ген неохарактеризованого білка SEQ ID NO:40/41 і 2,4 т.н. вище кодуючої області. SEQ ID NO:43 являє собою послідовність нуклеїнової кислоти з Mo17, що представляє кодуючу область для гена неохарактеризованого білка (61_24), що міститься в qHRS1 локусі. SEQ ID NO:44 являє собою продукт трансляції SEQ ID NO:43. SEQ ID NO:45 являє собою область геномної ДНК із Mo17, що кодує ген неохарактеризованого білка SEQ ID NO:43/44 і 2,4 т.н. вище кодуючої області. SEQ ID NO:46 являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує окрему EST послідовність з Mo17, що міститься в qHRS1 локусі. SEQ ID NO:47 являє собою MZA6393 маркер, що покриває qHSR1 локус з Huangzhao. SEQ ID NO:48 являє собою MZA6393 маркер, що покриває qHSR1 локус з B73. SEQ ID NO:49 являє собою ST148 маркер з Huangzhao. SEQ ID NO:47 являє собою MZA6393 маркер з Huangzhao4. SEQ ID NO:48 являє собою MZA6393 маркер з B73. SEQ ID NO:49 являє собою STS 148-1 маркер з Huangzhao4. SEQ ID NO:50 являє собою праймер ампліфікації MZA6393L. SEQ ID NO:51 являє собою праймер ампліфікації MZA6393R. SEQ ID NO:52 являє собою праймер ампліфікації 1M2-9L. SEQ ID NO:53 являє собою праймер ампліфікації 1M2-9R. SEQ ID NO:54 являє собою 1M2-9 маркер з Mo17. SEQ ID NO:55 являє собою 1M2-9 маркер з Huangzhao4. SEQ ID NO:56 являє собою праймер ампліфікації E6765-3L. SEQ ID NO:57 являє собою праймер ампліфікації E6765-3R. SEQ ID NO:58 являє собою E6765-3 маркер з Mo17. SEQ ID NO:59 являє собою праймер ампліфікації 2M4-1L. SEQ ID NO:60 являє собою праймер ампліфікації 2M4-1R. SEQ ID NO:61 являє собою 2M4-1 маркер з Mo17. SEQ ID NO:62 являє собою праймер ампліфікації 2M10-5L. SEQ ID NO:63 являє собою праймер ампліфікації 2M10-5R. SEQ ID NO:64 являє собою 2M10-5 маркер з Mo17. 5 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO:65 являє собою праймер ампліфікації 2M11-3L. SEQ ID NO:66 являє собою праймер ампліфікації 2M11-3R. SEQ ID NO:67 являє собою 2M11-3 маркер з Mo17. SEQ ID NO:68 являє собою праймер ампліфікації 3M1-25L. SEQ ID NO:69 являє собою праймер ампліфікації 3M1-25R. SEQ ID NO:70 являє собою 3M1-25 маркер з Mo17. SEQ ID NO:71 являє собою 3M1-25 маркер з Huangzhao4 SEQ ID NO:72 являє собою праймер ампліфікації STS148-1L. SEQ ID NO:73 являє собою праймер ампліфікації STS148-1R. SEQ ID NO:74 являє собою праймер ампліфікації MZA15839-4-L. SEQ ID NO:75 являє собою праймер ампліфікації MZA15839-4-R. SEQ ID NO:76 являє собою праймер ампліфікації MZA18530-16-L. SEQ ID NO:77 являє собою праймер ампліфікації MZA18530-16-R. SEQ ID NO:78 являє собою праймер ампліфікації MZA5473-801-L. SEQ ID NO:79 являє собою праймер ампліфікації MZA5473-801-R. SEQ ID NO:80 являє собою праймер ампліфікації MZA16870-15-L. SEQ ID NO:81 являє собою праймер ампліфікації MZA16870-15-R. SEQ ID NO:82 являє собою праймер ампліфікації MZA4087-19-L. SEQ ID NO:83 являє собою праймер ампліфікації MZA4087-19-R. SEQ ID NO:84 являє собою праймер ампліфікації MZA158-30-L. SEQ ID NO:85 являє собою праймер ампліфікації MZA158-30-R. SEQ ID NO:86 являє собою праймер ампліфікації MZA15493-15-L. SEQ ID NO:87 являє собою праймер ампліфікації MZA15493-15-R. SEQ ID NO:88 являє собою праймер ампліфікації MZA9967-11-L. SEQ ID NO:89 являє собою праймер ампліфікації MZA9967-11-R. SEQ ID NO:90 являє собою праймер ампліфікації MZA1556-23-L. SEQ ID NO:91 являє собою праймер ампліфікації MZA1556-23-R. SEQ ID NO:92 являє собою праймер ампліфікації MZA1556-801-L. SEQ ID NO:93 являє собою праймер ампліфікації MZA1556-801-R. SEQ ID NO:94 являє собою праймер ампліфікації MZA17365-10-L. SEQ ID NO:95 являє собою праймер ампліфікації MZA17365-10-R. SEQ ID NO:96 являє собою праймер ампліфікації MZA17365-801-L. SEQ ID NO:97 являє собою праймер ампліфікації MZA17365-801-R. SEQ ID NO:98 являє собою праймер ампліфікації MZA14192-8-L. SEQ ID NO:99 являє собою праймер ампліфікації MZA14192-8-R. SEQ ID NO:100 являє собою праймер ампліфікації MZA15554-13-L. SEQ ID NO:101 являє собою праймер ампліфікації MZA15554-13-R. SEQ ID NO:102 являє собою праймер ампліфікації MZA4454-14-L. SEQ ID NO:103 являє собою праймер ампліфікації MZA4454-14-R. SEQ ID NO:104 являє собою послідовність нуклеїнової кислоти з Mo17, що представляє кодуючу область гена для білка з анкіриновим повтором (Ген 1 Фігура 4). SEQ ID NO:105 являє собою продукт трансляції SEQ ID NO:104. SEQ ID NO:106 являє собою область геномної ДНК із Mo17, що кодує білок з анкіриновим повтором. SEQ ID NO:107 являє собою послідовність нуклеїнової кислоти з Mo17, що представляє кодуючу область гена для гідролази. SEQ ID NO:108 являє собою продукт трансляції SEQ ID NO:107. SEQ ID NO:109 являє собою область геномної ДНК із Mo17, що кодує гідролазу. SEQ ID NO:110 являє собою послідовність нуклеїнової кислоти з Mo17, що представляє кодуючу область гена для області, яка кодує, LRR-Xa21-подібної кінази (Ген 3, Фігура 4) SEQ ID NO:111 являє собою продукт трансляції SEQ ID NO:110. SEQ ID NO:112 являє собою послідовність нуклеїнової кислоти з Mo17, що представляє кодуючу область гена для області, що кодує LRR-Xa21-подібну кіназу (Ген 4, Фігура 4) SEQ ID NO:113 являє собою продукт трансляції SEQ ID NO:112. SEQ ID NO:114 являє собою область геномної ДНК із Mo17, що кодує LRR-Xa21-подібну кіназу (Ген 4, Фігура 4). SEQ ID NO:115 являє собою послідовність нуклеїнової кислоти з Mo17, що представляє область, що кодує ген, для LRR-Xa21D-подібної кінази (Ген 5, Фігура 4). SEQ ID NO:116 являє собою продукт трансляції SEQ ID NO:115. SEQ ID NO:117 являє собою область геномної ДНК із Mo17, що кодує LRR-Xa21D-подібну 6 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кіназу (Ген 5, Фігура 4). ДОКЛАДНИЙ ОПИС Даний винахід забезпечує алельні композиції у маїсу і способи визначення та селекції рослин маїсу з підвищеною стійкістю до летючої сажки. Також в обсязі даного винаходу знаходяться алельні композиції і способи, що використовуються для визначення і для зворотної селекції рослин маїсу, що мають знижену стійкість до летючої сажки. Наступні визначення надаються як допомога для розуміння даного винаходу. Картування локуса стійкості до летючої сажки викладено в рукописі "Identification and finemapping of a major QTL conferring resistance against head smut in maize" Yongsheng Chen, Qing Chao, Guoqing Tan, Jing Zhao, Meijing Zhang, Qing Ji і Mingliang Xu. Рукопис додається як додаток до опису. Термін "алель" відноситься до одної з двох або більше різних нуклеотидних послідовностей, що знаходяться у визначеному локусі. "Сприятливий алель" - це алель у конкретному локусі, що надає, або робить внесок в агрономічно бажаний фенотип, наприклад, підвищену стійкість до летючої сажки, або альтернативно, являє собою алель, що дозволяє визначити рослини зі зниженою стійкістю до летючої сажки, які можна видалити з програми схрещування або вирощування ("зворотна селекція"). Сприятливий алель маркера являє собою маркерний алель, що сегрегує зі сприятливим фенотипом, або альтернативно, сегрегує з несприятливим фенотипом рослини, таким чином, забезпечуючи перевагу для визначення рослин. Сприятлива алельна форма хромосомного сегменту являє собою хромосомний сегмент, що включає нуклеотидну послідовність, що вносить вклад у кращі агрономічні показники на одному або більше генетичних локусах, фізично розташованих на хромосомному сегменті. "Частота алелю" відноситься до частоти (пропорції або процентного співвідношення), при якій алель представлений на локусі в особині, в лінії або в популяції ліній. Наприклад, для алелю "A", диплоїдні особини генотипу "AA", "Aa" або "aa" мають частоти алелю 1,0, 0,5 або 0,0, відповідно. Оцінити частоту алелю в лінії можна шляхом усереднення частот алелю зразка особин з цієї лінії. Аналогічно, можна розрахувати частоту алеля в популяції ліній шляхом усереднення частот алеля ліній, що утворюють дану популяцію. Для популяції з обмеженим числом особин або ліній частота алелю може бути виражена як число особин або ліній (або будь-якої іншої визначеної групи), що містять алель. Алель є "позитивно" зв'язаним з ознакою, коли він зв'язаний з нею, і коли присутність алелю є індикатором того, що бажана ознака або форма ознаки буде спостерігатися в рослини, що містить алель. Алель є "негативно" зв'язаним з ознакою, коли він зв'язаний з нею, і коли присутність алелю є індикатором того, що бажана ознака або форма ознаки не буде спостерігатися в рослини, що містить алель. Особина є "гомозиготною" на локусі, якщо особина має лише один тип алелю на локусі (наприклад, диплоїдний організм має копію того самого алелю на локусі для кожної з двох гомологічних хромосом). Організм є "гетерозиготним" на локусі, якщо більш ніж один тип алеля є присутнім на цьому локусі (наприклад, диплоїдна особина з однією копією кожного з двох різних алелів). Термін "гомогенність" позначає, що члени групи мають однаковий генотип на одному або більше специфічних локусах. На відміну від цього, термін "гетерогенність" використовується для позначення, що особини в групі відрізняються за генотипом на одному або більше специфічних локусах. Як використовується в даному документі, терміни "ділянка хромосоми" або "хромосомний сегмент" означають суміжний лінійний інтервал геномної ДНК, що находиться in planta на окремій хромосомі. Генетичні елементи або гени, розташовані на окремій ділянці хромосоми, є фізично зв'язаними. Розмір ділянки хромосоми особливо не обмежений. У деяких аспектах генетичні елементи, розташовані в окремій ділянці хромосоми, є генетично зв'язаними, як правило, з відстанню генетичної рекомбінації, наприклад, меншою або рівною 20 cМ або, альтернативно, меншою або рівною 10 cМ. Тобто, два генетичних елементи в окремій ділянці хромосоми піддаються рекомбінації з частотою меншою або рівною 20 % або 10 %. Термін "схрещений" або "схрещування" означає злиття гамет через запилення для створення потомства (наприклад, клітин, насіння або рослин). Термін включає як статеві схрещування (запилення однієї рослини іншою) і самозапліднення (самозапилення, наприклад, коли пилок і сім'ябрунька походять від однієї рослини). "Топкросс аналіз" являє собою тест потомства, отриманого шляхом схрещування кожної батьківської особини з тим самим тестером, зазвичай гомозиготною лінією. Батьківська особина, яку необхідно проаналізувати, може бути перехреснозапильним сортом, кросом або інбредною лінією. "Генетична карта" – це опис взаємовідносин генетичних зчеплень між локусами на одній або більше хромосомах (або груп зчеплень) в даних видах, як правило, представлена у формі 7 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 діаграми або таблиці. "Генетичне картування" – це спосіб визначення взаємовідносин зчеплень локусів за допомогою застосування генетичних маркерів, популяцій, сегрегуючих для маркерів, і стандартних генетичних принципів частоти рекомбінації. "Положення на генетичній карті" являє собою положення на генетичній карті відносно до навколишніх генетичних маркерів в тій самій групі зчеплення, де специфічний маркер може бути виявлений в межах даних видів. Якщо два різних маркера мають однакове положення на генетичній карті, то два маркера знаходяться в такій безпосередній близькості один від одного, що рекомбінація відбувається між ними з настільки низькою частотою, що вона не визначається. Порядок і генетичні відстані між генетичними маркерами можуть відрізнятися від однієї генетичної карти до іншої. Це відбувається тому, що кожна генетична карта є продуктом картування популяції, типів використаних маркерів і поліморфного потенціалу кожного маркера між різними популяціями. Наприклад, 10 cМ на внутрішньо отриманій генетичній карті (яка в даному документі також називається "PHB" за Pioneer Hi-Bred) грубо еквівалентні 25-30 cМ на IBM2 2005 публічній карті рамки найближчих сусідів (карта високої чіткості доступна на maizeGDB). Однак, інформація може бути співвіднесена від однієї карти до іншої із використанням основної рамки загальних маркерів. Фахівець у даній галузі може застосувати рамку загальних маркерів для визначення положень генетичних маркерів і QTL на кожній окремій генетичній карті. Порівняння маркерних положень між внутрішньо отриманою генетичною картою і IBM2 генетичною картою найближчих сусідів можна побачити в Таблиці 3. "Частота генетичної рекомбінації" являє собою частоту явища кроинговеру (рекомбінації) між двома генетичними локусами. Частота рекомбінації може спостерігатися за допомогою наступної сегрегації маркерів і/або ознак після мейозу. Частота генетичної рекомбінації може бути виражена в сантиморганах (cМ), де один cМ являє собою відстань між двома генетичними маркерами, що показують 1 % частоту рекомбінації (тобто, явище кросинговеру відбувається між цими двома маркерами один раз на кожні 100 клітинних поділів). Термін "генотип" є генетичною конституцією особини (або групи особин) на одному або більше генетичних локусах, на противагу ознаці, що спостерігається (фенотип). Генотип визначається алелем(ями) одного або більше відомих локусів, що особина успадкувала від своїх батьків. Термін генотип може використовуватися для позначення генетичної конституції особини на окремому локусі, на множинних локусах, або в більш загальному змісті термін генотип може використовуватися для позначення генетичної конституції особини для всіх генів у її геномі. "Ідіоплазма" відноситься до генетичного матеріалу особини або від особини (наприклад, рослини), групи особин (наприклад, лінії рослин, сорту або родини) або клону, отриманого від лінії, сорту, видів або культури. Ідіоплазма може бути частиною організму або клітини, або може бути відділена від організму або клітини. В цілому, ідіоплазма забезпечує генетичний матеріал зі специфічним молекулярним складом, що забезпечує фізичну основу для деяких або всіх спадкових властивостей організму або культури клітин. Як використовується в даному документі, ідіоплазма включає клітини, насіння або тканини, з яких можуть вирости нові рослини або частини рослини, такі як листи, стебла, пилок або клітини, що можуть бути культивовані в цілу рослину. "Гаплотип" являє собою генотип особини на кількох генетичних локусах, тобто комбінацію алелів. Як правило, генетичні локуси, описані гаплотипом, є фізично і генетично зв'язаними, тобто, знаходяться на однаковому хромосомному сегменті. "Гібридизація" або "гібридизація нуклеїнової кислоти" відноситься до кон'югації комплементарних РНК і ДНК ланцюгів, а також до кон'югації окремих комплементарних ДНК ниток. "Жорсткість" відноситься до умов, що стосуються температури, іонної сили і присутності деяких органічних розчинників, таких як формамід, при яких проводять гібридизації нуклеїнових кислот. В умовах високої жорсткості (висока температура і низький вміст солі) два фрагменти нуклеїнової кислоти будуть кон'югуватися, або "гібридизуватися", тільки якщо має місце висока частота послідовностей комплементарних основ між ними. Термін "інтрогресія" відноситься до передачі бажаного алелю генетичного локусу з одного генетичного фону до іншого. Наприклад, інтрогресія бажаного алеля у специфічному локусі може бути передана, щонайменше, одному потомству через статеве схрещування між двома батьками одних тих самих видів, коли, щонайменш, один з батьків має бажаний алель у своєму геномі. Альтернативно, наприклад, передача алеля може відбуватися шляхом рекомбінації між двома донорськими геномами, наприклад, у злитому протопласті, де, щонайменше, один з донорських протопластів має бажаний алель у своєму геномі. Бажаний алель може бути, наприклад, вибраним алелем маркера, QTL, трансгена або подібного. У будь-якому випадку потомок, що містить бажаний алель, може бути повторно зворотно схрещений з лінією, що має 8 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бажаний генетичний фон і вибрана за бажаним алелем, для одержання алелю, що стає закріпленим в вибраному генетичному фоні. "Лінія" або "штам" являє собою групу особин однакового походження, що є, як правило, інбредними до деякої міри, і, як правило, є гомозиготними і гомогенними у більшості локусів (ізогенні або майже ізогенні). "Сублінія" відноситься до інбредної субпопуляції потомків, що є генетично відмінними від інших подібних інбредних субпопуляцій, що походять від одного предка. "Предкова лінія" являє собою батьківську лінію, використану як джерело генів, наприклад, для розробки елітних ліній. "Предкова популяція" – це група предків, що внесли основну масу генетичного розмаїття, що використовувалося для розробки елітних ліній. "Нащадки" – це потомство предків, і можуть бути відділені від їх предків за допомогою багатьох поколінь розведення. Наприклад, елітні лінії являють собою нащадків своїх предків. "Генеалогічна структура" означає взаємозв'язок між нащадком і кожним предком, що призвів до виникнення цього нащадка. Генеалогічна структура може охоплювати одне або більше поколінь, описуючи взаємовідносини між нащадком і його батьками, прабатьками, прапрабатьками і т. д. "Елітна лінія" або "елітний штам" являє собою агрономічно найкращу лінію, що була отримана в результаті багатьох циклів розмноження і селекції за найкращою агрономічною характеристикою. Різноманітні елітні лінії є доступними і відомими фахівцям у даній галузі розмноження маїсу. "Елітна популяція" являє собою набір елітних особин або ліній, що можуть бути використані, щоб відображати рівень даної галузі з точки зору агрономічно найкращих генотипів даних культурних видів, таких як маїс. Подібним чином, "елітна ідіоплазма" або елітний штам ідіоплазми являють собою агрономічно найкращу ідіоплазму, як правило, отриману від і/або здатну приводити до створення рослини з найкращою агрономічною характеристикою, наприклад, існуючої або новоутвореної елітної лінії маїсу. "Публічна IBM генетична карта" відноситься до будь-якої з наступних карт: IBM, IBM2, IBM2 найближчі сусіди, IBM2 FPC0507, IBM2 2004 найближчі сусіди, IBM2 2005 найближчі сусіди або IBM2 2005 найближчі сусіди рамка. Усі IBM генетичні карти засновані на B73 x Mo17 популяції, у якій потомство від первинного схрещування було спарене випадковим чином для одержання кількох поколінь до створення рекомбінантних інбредних ліній для картування. Новітні версії відображують додавання генетичних і BAC картованих локусів, а також посилену деталізацію карти завдяки включенню інформації, отриманої з інших генетичних карт. На відміну від цього, "екзотичний штам маїсу" або "екзотична ідіоплазма маїсу" являє собою штам або ідіоплазму, отриману від маїсу, що не належить до доступної елітної лінії маїсу або штаму ідіоплазми. У контексті схрещування двох рослин маїсу або штамів ідіоплазми, екзотична ідіоплазма не є близько пов'язаною за походженням з елітною ідіоплазмою, з якою схрещується. Найбільш часто екзотична ідіоплазма не походить ні від однієї відомої елітної лінії маїсу, але частіше відбирається для введення нових генетичних елементів (типово нових алелів) у програму розмноження. Як використовується в даному документі, термін "зчеплення" використовується для опису ступеня, з яким один маркерний локус "зв'язаний з" іншим маркерним локусом або деяким іншим локусом (наприклад, локусом стійкості до летючої сажки). Взаємовідносини зчеплення між молекулярним маркером і фенотипом приймають за "імовірність" або "відрегульовану імовірність". Значення імовірності (також відоме як p-значення) являє собою статистичну імовірність того, що конкретна комбінація фенотипу і присутності або відсутності конкретного маркерного алеля є випадковою. Таким чином, чим нижче показник імовірності, тим вище імовірність того, що фенотип і конкретний маркер будуть косегрегувати. У деяких аспектах показник імовірності розглядається як "достовірний" або "недостовірний". У деяких варіантах здійснення показник імовірності 0,05 (p=0,05 або 5 % імовірність) випадкової вибірки розглядається як достовірна ознака косегрегації. Однак, прийнятною імовірністю може бути будь-яка імовірність менше ніж 50 % (p=0,5). Наприклад, достовірна імовірність може бути менше ніж 0,25, менше ніж 0,20, менше ніж 0,15, менше ніж 0,1, менше ніж 0,05, менше ніж 0,01 або менше ніж 0,001. У інтервальному картуванні зчеплення між двома маркерними локусами може бути обчислене з використанням співвідношень шансів (тобто співвідношення зчеплення проти відсутності зчеплення). Це співвідношення більш традиційно виражається як логарифм співвідношень і називається значення логарифма шансів (LOD) або LOD показник (Risch, Science 255:803-804 (1992)). LOD значення 3 між двома маркерами означає, що зчеплення є в 1000 разів більш імовірним, ніж відсутність зчеплення. Більш низькі LOD значення, такі як 2,0 або 2,5, можна використовувати для визначення більшого рівня зчеплення. "Зчеплені локуси" розташовані в безпосередній близькості так, щоб мейотична рекомбінація 9 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 між парами гомологічних хромосом не відбувалася з високою частотою (частота дорівнює або менше ніж 10 %) між двома локусами, наприклад, зчеплені локуси косегрегують, щонайменше, приблизно 90 % часу, наприклад, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,75 % або більше часу. Маркерні локуси є особливо корисними, коли вони показують достовірну імовірність косегрегації (зчеплення) з бажаною ознакою (наприклад, підвищена стійкість до летючої сажки). Наприклад, у деяких аспектах ці маркери можна назвати "зчепленими QTL маркерами". Зчеплення може бути виражене як бажана межа або діапазон. Наприклад, в деяких варіантах здійснення будь-який маркер зчеплений (генетично і фізично) з будь-яким іншим маркером, коли маркери розділені менше ніж 50, 40, 30, 25, 20 або 15 одиницями карти (або cМ). Додатково зчеплення може бути описане розділеннями 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 одиниць карти (або cМ). У деяких аспектах краще визначити взятий у дужки діапазон зчеплення, наприклад, від 10 до 20 cМ, від 10 до 30 cМ або від 10 до 40 cМ. Чим тісніше маркер зчеплений з другим локусом, тим кращим індикатором для другого локусу стає цей маркер. Таким чином, "близько зчеплені локуси", такі як маркерний локус і другий локус, показують внутрішньолокусну частоту рекомбінації 10 % або менше, або приблизно 9 % або менш, або приблизно 8 % або менше, або приблизно 7 % або менше, або приблизно 6 % або менше, або приблизно 5 % або менше, або приблизно 4 % або менше, або приблизно 3 % або менше, і або приблизно 2 % або менше. В інших варіантах здійснення відповідні локуси показують частоту рекомбінації приблизно 1 % або менше, наприклад, приблизно 0,75 % або менше, або приблизно 0,5 % або менше, або приблизно 0,25 % або менше. Два локуси, що розташовані на одній хромосомі, і на такій відстані, що рекомбінація між двома локусами відбувається з частотою менше ніж 10 % (наприклад, приблизно 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,75 %, 0,5 %, 0,25 % або менше), також називаються "близькими" один до одного. Оскільки cМ – це відстань між двома генетичними маркерами, що показують 1 % частоту рекомбінації, то будь-який маркер є близько зчепленим (генетично і фізично) з будь-яким іншим маркером, що знаходиться в безпосередній близькості, наприклад, на відстані, рівній або менше ніж 10 cМ. Два близько зчеплених маркери на одній хромосомі можуть розташовуватися на 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,75, 0,5, 0,25, 0,1, 0,075, 0,05, 0,025 або 0,01 cМ або менше один від іншого. Коли мова йде про взаємовідносини між двома генетичними елементами, такими як генетичний елемент, що вносить вклад у підвищену стійкість до летючої сажки, і близький маркер, зчеплення у фазі "кньюгації" позначає стан, де "сприятливий" алель на локусі сили стебла фізично зв'язаний на тій же нитці хромосоми, що і "сприятливий" алель відповідного зчепленого маркерного локусу. У фазі кон'югації обидва сприятливі алелі успадковуються разом потомством, що успадковує цю нитку хромосоми. При зчепленні у фазі "розходження" "сприятливий" алель на локусі інтересу фізично зчеплений з "несприятливим" алелем на локусі близького маркера, і два "сприятливі" алелі не успадковуються разом (тобто, два локуси знаходяться "не у фазі" один з одним). Термін "нерівноважне зчеплення" відноситься до невипадкової сегрегації генетичних локусів або ознак (або обох). У будь-якому випадку нерівноважне зчеплення передбачає, що відповідні локуси знаходяться в достатній фізичній близькості по довжині хромосоми, щоб вони сегрегували разом з частотою більшою, ніж випадкова (тобто, невипадковою) (у випадку косегрегуючих ознак локуси, що лежать в основі ознак, знаходяться в достатній близькості один від одного). Маркери, що показують нерівноважне зчеплення, розглядаються як зчеплені. Зчеплені локуси косегрегують більше ніж 50 % часу, наприклад, від приблизно 51 % до приблизно 100 % часу. Іншими словами, два маркери, що косегрегують, мають частоту рекомбінації менше ніж 50 % (та за визначенням відділені на менше ніж 50 cМ на тій самій групі зчеплення.) Як використовується в даному документі, зчеплення може бути між двома маркерами або альтернативно між маркером і фенотипом. Маркерний локус може бути "зв'язаним з" (зчепленим з) ознакою, наприклад, стійкістю до летючої сажки. Ступінь зчеплення молекулярного маркера з фенотипічною ознакою виміряються, наприклад, як статистична імовірність косегрегації цього молекулярного маркера з фенотипом. 2 Нерівноважне зчеплення найчастіше оцінюється з використанням критерію r , що обчислюють, використовуючи формулу, описану Hill, W.G. i Robertson, A, Theor. Appl. Genet. 2 38:226-231(1968). Коли r =1, повний LD існує між двома маркерними локусами, означаючи, що 2 маркери не були відділені рекомбінацією і мають однакову частоту алелю. Значення для r вище 1/3 означають істотно сильний LD, придатний для картування (Ardlie et al., Nature Reviews 2 Genetics 3:299-309 (2002)). Отже, алелі знаходяться в нерівноважному зчепленні, коли r значення між парними маркерними локусами більше або рівні 0,33, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 або 10 UA 106722 C2 1,0. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як використовується в даному документі, "рівноважне зчеплення" описує ситуацію, коли два маркери незалежно сегрегують, тобто, розділяються в потомстві випадковим чином. Маркери, що показують рівноважне зчеплення, розглядаються як незчеплені (поза залежністю від того, лежать вони на одній хромосомі, або ні). "Локус" являє собою хромосомну область, де розташований ген або маркер. Наприклад, "генний локус" – це специфічне хромосомне положення в геномі видів, де може бути знайдений специфічний ген. "Маїс" і "кукурудза" використовуються в даному документі взаємозамінно. Терміни "маркер", "молекулярний маркер", "маркерна нуклеїнова кислота" і "маркерний локус" відносяться до нуклеотидної послідовності або кодованого нею продукту (наприклад, білка), що використовують як точку відліку, коли визначають зчеплений локус. Маркер може бути отриманий від геномної нуклеотидної послідовності або від експресованих нуклеотидних послідовностей (наприклад, від сплайсованої РНК або кДНК), або від кодованого поліпептиду. Термін також відноситься до послідовностей нуклеїнової кислоти, комплементарних або фланкуючих маркерних послідовностей, таких як нуклеїнові кислоти, що використовуються як зонди, або пари праймерів, здатні до ампліфікації маркерної послідовності. "Маркерний зонд" – це послідовність нуклеїнової кислоти або молекула, яку можна використовувати для визначення присутності маркерного локусу, наприклад, зонд нуклеїнової кислоти, що є комплементарним послідовності маркерного локусу, за допомогою гібридизації нуклеїнової кислоти. Маркерні зонди, що містять 30 або більше суміжних нуклеотидів маркерного локусу ("вся або частина" послідовності маркерного локусу) можуть бути використані для гібридизації нуклеїнової кислоти. Альтернативно, у деяких аспектах маркерний зонд відноситься до зонда будь-якого типу, що здатний розрізняти (тобто, генотип) конкретний алель, що є присутнім на маркерному локусі. Нуклеїнові кислоти є "комплементарними", коли вони, зокрема, "гібридизуються" або кон'югуються у розчині, наприклад, відповідно до правил кон'югації основ Уотсона-Кріка. Маркери з позначенням PHM представляють набір праймерів, що ампліфікують специфічний фрагмент ДНК, в даному документі позначені як "амплікон". Порівнюються нуклеотидні послідовності ампліконів з кількох ліній маїсу, і визначаються поліморфізми або варіації. Поліморфізми включають окремі нуклеотидні поліморфізми (SNP), прості повтори послідовності (SSR), вставки/делеції (вставки-делеції) і т. п. "Маркерний алель", альтернативно "алель маркерного локусу", може відноситися до однієї з кількох поліморфних нуклеотидних послідовностей, виявлених на маркерному локусі в популяції, що є поліморфною по маркерному локусу. Альтернативно, маркерні алелі, позначені числом, представляють специфічну комбінацію алелів, що також має назву "гаплотип", на інформативних поліморфних сайтах цього специфічного маркерного локусу. У деяких аспектах забезпечуються маркерні локуси, що корелюють зі стійкістю до летючої сажки у маїсу. "Маркерний локус" - це локус, який можна використовувати для відстеження присутності другого зчепленого локусу, наприклад, зчепленого локусу, що кодує або робить внесок у вираження фенотипічної ознаки. Наприклад, маркерний локус можна використовувати для контролю сегрегації алелів на локусі, такому як QTL, що генетично або фізично зчеплені з маркерним локусом. "Генетичні маркери" - це нуклеїнові кислоти, що є поліморфними в популяції, і маркерні алелі можуть визначатися і виділятися за допомогою одного або більше аналітичних способів, наприклад, RFLP, AFLP, ізозим, SNP, SSR і подібне. Термін також відноситься до послідовностей нуклеїнової кислоти, комплементарних геномним послідовностям, таким як нуклеїнові кислоти, що використовуються як зонди. Маркери, що відповідають генетичним поліморфізмам між членами популяції, можна визначити способами, загальноприйнятими в даній галузі. Вони включають, наприклад, ДНК секвенування, способи специфічної для послідовностей ампліфікації на основі ПЛР, виявлення поліморфізмів довжин рестрикційних фрагментів (RFLP), визначення ізозимних маркерів, визначення полінуклеотидних поліморфізмів за допомогою алель-специфічної гібридизації (ASH), визначення ампліфікованих варіабельних послідовностей рослинного геному, виявлення реплікації послідовностей, що самопідтримується, визначення простих повторів послідовностей (SSR), виявлення однонуклеотидних поліморфізмів (SNP) або виявлення поліморфізмів довжин ампліфікованих фрагментів (AFLP). Загальноприйняті способи також відомі для виявлення міток експресованих послідовностей (EST) і SSR маркерів, отриманих від EST послідовностей, і випадковим чином ампліфікованої поліморфної ДНК (RAPD). "Стійкість до летючої сажки" відноситься до здатності рослини маїсу протистояти інфекції 11 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хазяїн-специфічного гриба Sphacelotheca reiliana (Kühn) Clint. Вона включає, але не обмежується, знижене утворення сорусів, поліпшену життєвість рослини, поліпшену функцію волоті і поліпшений врожай кукурудзи в порівнянні з рослинами маїсу, що не мають локусу стійкості, описаного у даному документі. Нуклеїнові кислоти і поліпептиди варіантів здійснення знаходять застосування в способах забезпечення або посилення грибкової стійкості рослини. Джерело стійкості може бути генетичним локусом стійкості природного походження, що інтрогресує через розмноження в сприйнятливу популяцію маїсу, що не має локусу стійкості, або, альтернативно, гени, що надають стійкість можуть бути ектопічно експресовані як трансгени, що надають стійкість, коли експресовані в сприйнятливій популяції. Відповідно, композиції і способи, розкриті в даному документі, придатні для захисту рослин від грибкових патогенів. "Стійкість до патогену", "стійкість до грибка" і "стійкість до хвороби" означають, що рослина уникає симптомів хвороби, що є результатом взаємодій рослина-патоген. Тобто, патогени зазнають труднощів в тому, щоб спричинювати хвороби рослин і пов'язані з хворобою симптоми, або альтернативно, симптоми хвороби, викликані патогеном, мінімізовані або зменшені, такі як, наприклад, зниження стресу і пов'язаної втрати врожаю. Фахівцю в даній галузі зрозуміло, що композиції і способи, розкриті в даному документі, можуть використовуватися з іншими композиціями і способами, доступними на даній галузі для захисту рослин від нападу патогенів. Отже, способи варіантів здійснення можуть використовуватися для захисту рослин від хвороби, особливо тих хвороб, що спричинюються грибковими патогенами рослин. Як використовується в даному документі, “ стійкість до грибків" відноситься до посиленої стійкості або толерантності до грибкового патогену в порівнянні з такою у рослини дикого типу. Ефекти можуть варіювати від невеликого збільшення толерантності до дії грибкового патогену (наприклад, часткове інгібування) до повної стійкості так, що рослина не піддається впливу в присутності грибкового патогену. Підвищений рівень стійкості проти конкретного грибкового патогену або проти більш широкого спектра грибкових патогенів складає "посилену" або поліпшену стійкість до грибків. Варіанти здійснення даного винаходу також будуть підсилювати або поліпшувати стійкість рослини до грибкового патогену так, що стійкість рослини до грибкового патогену або патогенів буде підвищуватися. Термін "підсилювати" відноситься до наступного: поліпшувати, збільшувати, ампліфікувати, множити, підвищувати, піднімати і подібного. У даному описі рослини даного винаходу описуються як стійкі до інфекції Sphacelotheca reiliana (Kühn) Clint або такі, що мають 'посилену стійкість' до інфекції Sphacelotheca reiliana (Kühn) Clint, як результат локусу стійкості до летючої сажки даного винаходу. Відповідно, вони типово виявляють підвищену стійкість до хвороби в порівнянні з еквівалентними рослинами, що є сприйнятливими до інфекції Sphacelotheca reiliana (Kühn) Clint, тому що в них відсутній локус стійкості до летючої сажки. У конкретних аспектах способи для забезпечення або посилення грибкової стійкості в рослині включають введення в рослину, щонайменше, однієї касети експресії, де касета експресії містить нуклеотидну послідовність, що кодує протигрибковий поліпептид варіантів здійснення, функціонально зчеплений з промотором, що направляє експресію в рослині. Рослина експресує поліпептид, таким чином, додаючи стійкість до грибка всій рослині або поліпшуючи уроджений рівень стійкості рослини. У конкретних варіантах здійснення ген надає стійкість до грибкового патогену Sphacelotheca reiliana (Kühn) Clint. Експресія протигрибкового поліпептиду варіантів здійснення може бути націлена на специфічні тканини рослини, де стійкість до патогену особливо важлива, такі як, наприклад, листя, корені, стебла або судинні тканини. Така тканино-специфічна експресія може здійснюватися переважними для кореня, переважними для листа, переважними для судинної тканини, переважними для стебла або переважними для насіння промоторами. "Нуклеотидна послідовність", "полінуклеотид", "послідовність нуклеїнової кислоти" і "фрагмент нуклеїнової кислоти" використовуються взаємозамінно і відносяться до полімеру РНК або ДНК, що є одно- або двонитковою, факультативно містить синтетичні, ненатуральні або змінені нуклеотидні основи. "Нуклеотид" являє собою мономерну одиницю, з якої побудовані ДНК або РНК полімери, і містить пуринову або піримідинову основу, пентозу і групу фосфорної кислоти. Нуклеотиди (зазвичай знаходяться в їх формі 5'-монофосфату) називаються їх однобуквеним позначенням у такий спосіб: "A" для аденілату або дезоксиаденілату (для РНК або ДНК, відповідно), "C" для цитидилату або дезоксицитидилату, "G" для гуанілату або дезоксигуанілату, "U" для уридилату, "T" для дезокситимідилату, "R" для пуринів (A або G), "Y" для піримідинів (C або T), "K" для G або T, "H" для A або C, або T, "I" для інозину, і "N" для будь-якого нуклеотиду. Терміни "поліпептид", "пептид" і "білок" використовуються взаємозамінно в даному 12 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 документі для позначення полімеру амінокислотних залишків. Терміни відносяться до амінокислотних полімерів, у яких один або більше амінокислотних залишків являють собою штучний хімічний аналог відповідної амінокислоти, що зустрічається в природі, а також амінокислотних полімерів, що зустрічаються в природі. Поліпептиди варіантів здійснення можуть бути отримані або з нуклеїнової кислоти, розкритої в даному документі, або застосуванням стандартних методик молекулярної біології. Наприклад, укорочений білок варіантів здійснення може бути отриманий експресією рекомбінантної нуклеїнової кислоти варіантів здійснення в прийнятній клітині-хазяїні, або, альтернативно, шляхом комбінації ex vivo процедур, таких як обробка протеазою та очищення. Як використовується в даному документі, терміни "кодуючий" або "кодований", при використанні в контексті специфічної нуклеїнової кислоти, означають, що нуклеїнова кислота містить необхідну інформацію для прямої трансляції нуклеотидної послідовності в специфічний білок. Інформація, якою кодується білок, визначається застосуванням кодонів. Нуклеїнова кислота, що кодує білок, може містити нетрансльовані послідовності (наприклад, інтрони) всередині трансльованих областей нуклеїнової кислоти або може не містити такі проміжні нетрансльовані послідовності (наприклад, як у кДНК). Варіанти здійснення даного винаходу включають ізольовані або, по суті, очищені полінуклеотидні або білкові композиції. "Ізольований" або "очищений" полінуклеотид або білок, або їх біологічно активна частина, є, по суті, або істотно звільненою від компонентів, що у нормі супроводжують або взаємопов'язані з полінуклеотидом або білком, що виявляється в їх оточенні, що зустрічається в природі. Таким чином, ізольований або очищений полінуклеотид або білок є, по суті, вільним від іншого клітинного матеріалу, або культурального середовища, коли його одержують рекомбінантними техніками (наприклад, ПЛР ампліфікацією), або, по суті, вільним від хімічних попередників або інших хімічних сполук, коли його синтезують хімічним шляхом. Оптимально, "ізольований" полінуклеотид є вільним від послідовностей (наприклад, послідовностей, що кодують білок), що в природних умовах обмежують полінуклеотид (тобто, послідовності, розташовані на 5' і 3' кінцях полінуклеотиду) у геномної ДНК організму, з якого походить полінуклеотид. Наприклад, в різних варіантах здійснення ізольований полінуклеотид може містити менше ніж приблизно 5 т.н., приблизно 4 т.н., приблизно 3 т.н., приблизно 2 т.н., приблизно 1 т.н., приблизно 0,5 т.н. або приблизно 0,1 т.н. нуклеотидної послідовності, що в природних умовах обмежує полінуклеотид в геномній ДНК клітини, з якої походить полінуклеотид. Білок, що є, по суті, вільним від клітинного матеріалу, включає композиції білка, що мають менше ніж приблизно 30 %, приблизно 20 %, приблизно 10 %, приблизно 5 % або приблизно 1 % (на суху вагу) забруднюючого білка. Коли білок варіантів здійснення або його біологічно активну частину одержують рекомбінантно, то оптимально в культуральному середовищі присутні менше ніж приблизно 30 %, приблизно 20 %, приблизно 10 %, приблизно 5 % або приблизно 1 % (на суху вагу) хімічних попередників або хімічних сполук, що не є білком інтересу. Фрагменти і варіанти розкритих нуклеотидних послідовностей і білків, кодованих у такий спосіб, також включені у варіанти здійснення. Під "фрагментом" мається на увазі частина нуклеотидної послідовності або частина амінокислотної послідовності і, отже, білок, кодований у такий спосіб. Фрагменти нуклеотидної послідовності можуть кодувати білкові фрагменти, що зберігають біологічну активність нативного білка і, отже, мають здатність надавати стійкість до грибків рослині. Альтернативно, фрагменти нуклеотидної послідовності, що є придатними в якості зондів гібридизації, не обов'язково кодують фрагментні білки, що зберігають біологічну активність. Таким чином, фрагменти нуклеотидної послідовності, можуть знаходитися в діапазоні від, щонайменше, приблизно 15 нуклеотидів, приблизно 50 нуклеотидів, приблизно 100 нуклеотидів, і до повнорозмірної нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептиди варіантів здійснення. Фрагмент нуклеотидної послідовності, що кодує біологічно активну частину поліпептиду варіантів здійснення, буде кодувати, щонайменше, приблизно 15, приблизно 25, приблизно 30, приблизно 40 або приблизно 50 суміжних амінокислот, або до повного числа амінокислот, що є присутніми у повнорозмірному поліпептиді варіантів здійснення. Фрагментам нуклеотидної послідовності, що придатні як зонди гібридизації або ПЛР праймери звичайно не потрібно кодувати біологічно активну частину білка. Як використовується в даному документі, "повнорозмірна послідовність", у відношенні зазначеного полінуклеотиду, означає присутність цілої послідовності нуклеїнової кислоти нативної послідовності. "Нативна послідовність" означає ендогенну послідовність, тобто, несконструйовану послідовність, виявлену в геномі організму. Таким чином, фрагмент нуклеотидної послідовності варіантів здійснення може кодувати 13 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 біологічно активну частину поліпептиду, або він може бути фрагментом, що може використовуватися як зонд гібридизації або ПЛР праймер із застосуванням способів, розкритих нижче. Біологічно активна частина антипатогенного поліпептиду може бути отримана шляхом виділення частини однієї з нуклеотидних послідовностей варіантів здійснення, експресії кодованої частини білка і оцінки здатності кодованої частини білка надавати або посилювати стійкість до грибків у рослини. Молекули нуклеїнової кислоти, що є фрагментами нуклеотидної послідовності варіантів здійснення, містять, щонайменше, приблизно 15, приблизно 20, приблизно 50, приблизно 75, приблизно 100 або приблизно 150 нуклеотидів, або до числа нуклеотидів, що є присутніми у повнорозмірній нуклеотидній послідовності, розкритій в даному документі. "Варіанти" призначені означати суттєво подібні послідовності. Для полінуклеотидів варіант містить делецію і/або вставку одного або більше нуклеотидів на одному або більше внутрішніх сайтах в нативному полінуклеотиді і/або заміну одного або більше нуклеотидів на одному або більше сайтах в нативному полінуклеотиді. Як використовується в даному документі, "нативний" полінуклеотид або поліпептид містить нуклеотидну послідовність або амінокислотну послідовність, відповідно, що зустрічається в природі. Фахівцю в даній області буде зрозуміло, що варіанти нуклеїнових кислот варіантів здійснення можна буде сконструювати так, щоб зберігалася відкрита рамка зчитування. Для полінуклеотидів консервативні варіанти включають ті послідовності, що через виродженість генетичного коду кодують амінокислотну послідовність одного з поліпептидів варіантів здійснення. Алельні варіанти, що зустрічаються в природі, такі як ці, можна визначити з застосуванням загальновідомих методик молекулярної біології, наприклад, методик полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і гібридизації, як викладено нижче. Полінуклеотидні варіанти також включають синтетично отримані полінуклеотиди, такі як ті, що отримано, наприклад, шляхом використання сайт-направленого мутагенезу, але які все ще кодують білок варіантів здійснення. Загалом, варіанти конкретного полінуклеотиду варіантів здійснення будуть мати, щонайменше, приблизно 40 %, приблизно 45 %, приблизно 50 %, приблизно 55 %, приблизно 60 %, приблизно 65 %, приблизно 70 %, приблизно 75 %, приблизно 80 %, приблизно 85 %, приблизно 90 %, приблизно 91 %, приблизно 92 %, приблизно 93 %, приблизно 94 %, приблизно 95 %, приблизно 96 %, приблизно 97 %, приблизно 98 %, приблизно 99 % або більше ідентичності послідовності до цього конкретного полінуклеотиду, як визначається програмами вирівнювання послідовностей і параметрами, описаними в даному документі. Варіанти специфічного полінуклеотиду варіантів здійснення (тобто еталонний полінуклеотид) можуть також оцінюватися шляхом порівняння процентної ідентичності послідовностей між поліпептидом, кодованим варіантним полінуклеотидом, і поліпептидом, кодованим еталонним полінуклеотидом. Таким чином, наприклад, розкриваються ізольовані полінуклеотиди, що кодують поліпептид з даною процентною ідентичністю послідовностей з поліпептидом SEQ ID NO: 3. Процентна ідентичність послідовностей між будь-якими двома поліпептидами може бути обчислена з використанням програм і параметрів вирівнювання послідовностей, описаних в даному документі. У випадку, коли будь-яка дана пара полінуклеотидів варіантів здійснення оцінюється шляхом порівняння процентної ідентичності послідовностей, що мають два поліпептиди, які вони кодують, то процентна ідентичність послідовностей між двома кодованими поліпептидами складає, щонайменше, приблизно 40 %, приблизно 45 %, приблизно 50 %, приблизно 55 %, приблизно 60 %, приблизно 65 %, приблизно 70 %, приблизно 75 %, приблизно 80 %, приблизно 85 %, приблизно 90 %, приблизно 91 %, приблизно 92 %, приблизно 93 %, приблизно 94 %, приблизно 95 %, приблизно 96 %, приблизно 97 %, приблизно 98 %, приблизно 99 % або більше ідентичності послідовності. "Варіантний" білок означає білок, отриманий від нативного білка шляхом делеції або вставки однієї або більше амінокислот на одному або більше внутрішніх сайтах в нативному білку і/або заміни однієї або більше амінокислот на одному або декількох сайтах у нативному білку. Варіантні білки, включені у варіанти здійснення, є біологічно активними, тобто вони зберігають бажану біологічну активність нативного білка, тобто, здатність надавати або підсилювати стійкість рослини до грибкового патогену, як описано в даному документі. Такі варіанти можуть бути результатом, наприклад, генетичного поліморфізму або в результаті маніпуляцій, проведених людиною. Біологічно активні варіанти нативного білка варіантів здійснення будуть мати, щонайменше, приблизно 40 %, приблизно 45 %, приблизно 50 %, приблизно 55 %, приблизно 60 %, приблизно 65 %, приблизно 70 %, приблизно 75 %, приблизно 80 %, приблизно 85 %, приблизно 90 %, приблизно 91 %, приблизно 92 %, приблизно 93 %, приблизно 94 %, приблизно 95 %, приблизно 96 %, приблизно 97 %, приблизно 98 %, приблизно 99 % або більшу ідентичність послідовностей з амінокислотною послідовністю для нативного білка, як 14 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 визначається за допомогою програм і параметрів вирівнювання послідовностей, описаних в даному документі. Біологічно активний варіант білка варіантів здійснення може відрізнятися від такого білка на мінімальну кількість у приблизно 1-15 амінокислотних залишків, на мінімальну кількість у приблизно 1-10, таке як приблизно 6-10, на мінімальну кількість у приблизно 5, на мінімальну кількість у 4, 3, 2 або навіть 1 амінокислотний залишок. Білки варіантів здійснення можна змінити різними способами, включаючи амінокислотні заміни, делеції, відсікання і вставки. Способи для таких маніпуляцій є загальновідомими в даній галузі. Наприклад, варіанти і фрагменти амінокислотної послідовності антипатогенних білків можна одержати шляхом мутацій в ДНК. Способи мутагенезу і полінуклеотидних змін є загальновідомими в даній галузі. Дивися, наприклад, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; Патент США № 4873192; Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Нью-Йорк) і посилання, що цитуються там. Посібник щодо прийнятних амінокислотних замін, що не діють на біологічну активність білка інтересу, можна знайти в моделі Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), включеній в даний опис шляхом посилання. Консервативні заміни, такі як заміщення однієї амінокислоти на іншу, що має подібні властивості, можуть бути оптимальними. Таким чином, гени і полінуклеотиди варіантів здійснення включають як послідовності, що зустрічаються в природі, а також мутантні форми. Подібним чином, білки варіантів здійснення включають як білки, що зустрічаються в природі, а також їх варіації і модифіковані форми. Такі варіанти продовжуватимуть мати бажану здатність надавати або посилювати стійкість рослини до грибкового патогену. Очевидно, що мутації, які будуть зроблені в ДНК, що кодує варіант, не повинні переміщувати послідовність за рамку зчитування та оптимально не утворюватимуть комплементарні області, що можуть продукувати вторинну структуру мРНК. Дивися Європейський патент № 0075444. Не передбачається, що ці делеції, вставки і заміни білкових послідовностей, включені в даний опис, утворюють радикальні зміни в характеристиках білка. Однак, коли важко передбачити точний ефект заміни, делеції або вставки перш ніж зробити це, фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що ефект буде оцінений шляхом скринінгу трансгенних рослин, що були трансформовані з варіантним білком, щоб встановити вплив на здатність рослини протистояти грибковій патогенній атаці. Варіантні полінуклеотиди і білки також включають послідовності і білки, отримані від мутагенних або рекомбіногенних процедур, включаючи і не обмежуючись процедурами, такими як перестановка в ДНК. Фахівець у даній галузі може передбачити модифікації, що будуть змінювати діапазон патогенів, на які відповідає білок. Завдяки такій процедурі одна або більше різних послідовностей, що кодують білок, можуть використовуватися для створення нового білка, що має бажані властивості. Таким способом, бібліотеки рекомбінантних полінуклеотидів створюються з популяції полінуклеотидів зі зв'язаною послідовністю, які містять області послідовностей, що мають істотну ідентичність послідовностей, і можуть бути гомологічно рекомбіновані in vitro або in vivo. Наприклад, із застосуванням цього підходу мотиви послідовності, що кодують домен інтересу, можуть піддатися перестановці між геном білка варіантів здійснення та інших відомих генів білка для одержання нового гена, що кодує білок з поліпшеною властивістю інтересу, такою як збільшена здатність надавати або посилювати стійкість рослини до грибкового патогену. Стратегії для такої перестановки в ДНК відомі в даній галузі. Дивися, наприклад, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; і патенти США №№ 5605793 і 5837458. Полінуклеотиди варіантів здійснення можуть використовуватися для виділення відповідних послідовностей з інших організмів, зокрема інших рослин. Таким способом, методи, такі як ПЛР, гібридизація і подібні, можна використовувати для визначення таких послідовностей, ґрунтуючись на їх гомології послідовності з послідовностями, наведеними в даному описі. Послідовності, ізольовані на підставі їх ідентичності послідовностей з цілими послідовностями, наведеними в даному документі, або їх варіантами і фрагментами, включені у варіанти здійснення. Такі послідовності включають послідовності, що є ортологами розкритих послідовностей. "Ортологи" означають гени, отримані від загального предкового гена, і які виявляються в різних видах як результат видоутворення. Гени, виявлені в різних видах, розглядаються як ортологи, коли їх нуклеотидні послідовності і/або їх кодовані білкові послідовності розділяють, щонайменше, приблизно 60 %, приблизно 70 %, приблизно 75 %, приблизно 80 %, приблизно 85 %, приблизно 90 %, приблизно 91 %, приблизно 92 %, приблизно 15 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 93 %, приблизно 94 %, приблизно 95 %, приблизно 96 %, приблизно 97 %, приблизно 98 %, приблизно 99 % або більше ідентичності послідовностей. Функції ортологів часто є високо консервативними всередині виду. Таким чином, ізольовані полінуклеотиди, які кодують білок, що надає або підсилює стійкість рослини до грибкового патогену, і які гібридизуються при жорстких умовах з послідовностями, розкритими в даному документі, або з їх варіантами або фрагментами, включені у варіанти здійснення. У підході ПЛР, олігонуклеотидні праймери можуть бути розроблені для застосування в ПЛР реакціях для ампліфікації відповідних ДНК послідовностей з кДНК або геномної ДНК, екстрагованої з будь-якого організму інтересу. Способи для конструювання ПЛР праймерів і ПЛР клонування є загальнодоступними в даній галузі та описані в Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Нью-Йорк). Дивися також Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Нью-Йорк); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Нью-Йорк); і Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, НьюЙорк). Відомі способи ПЛР включають і не обмежуються способами, що використовують кон'юговані праймери, гніздові праймери, окремі специфічні праймери, вироджені праймери, ген-специфічні праймери, вектор-специфічні праймери, частково-неспівпадаючі праймери і подібне. У методиках гібридизації весь або частина відомого полінуклеотиду використовується як зонд, що селективно гібридизується з іншими відповідними полінуклеотидами, присутніми в популяції клонованих фрагментів геномної ДНК або кДНК фрагментів (тобто, геномної або кДНК бібліотек) з вибраного організму. Зонди гібридизації можуть бути фрагментами геномної ДНК, кДНК фрагментами, РНК фрагментами або іншими олігонуклеотидами, і можуть бути позначені 32 групою, що виявляється, такою як P, або будь-яким іншим маркером, що виявляється. Таким чином, наприклад, зонди для гібридизації можуть бути створені шляхом мічення синтетичних олігонуклеотидів, в основі яких лежать полінуклеотиди варіантів здійснення. Способи для одержання зондів для гібридизації і для конструювання кДНК і геномних бібліотек є загальновідомими в даній галузі і розкриті в Sambrook et al. (1989) вище. Наприклад, цілий полінуклеотид, розкритий в даному документі, або одна або більше його частин, можуть бути використані як зонд, здатний, зокрема, гібридизуватися з відповідними полінуклеотидами та інформаційними РНК. Для досягнення специфічної гібридизації при різноманітних умовах такі зонди включають послідовності, що є унікальними і мають оптимально, щонайменше, приблизно 10 нуклеотидів у довжину, щонайменше, приблизно 15 нуклеотидів у довжину або, щонайменше, приблизно 20 нуклеотидів у довжину. Такі зонди можуть використовуватися для ампліфікації відповідних полінуклеотидів з вибраного організму за допомогою ПЛР. Ця методика може використовуватися для виділення додаткових кодуючих послідовностей, з бажаного організму або як діагностичний аналіз для визначення присутності послідовностей, що кодують, в організмі. Методики гібридизації включають гібридизаційний скринінг ДНК бібліотек, висіяних на планшети (або плями, або колонії; дивися, наприклад, Sambrook et al. (1989) вище). Гібридизація таких послідовностей може бути проведена при жорстких умовах. Під "жорсткими умовами" або "жорсткими умовами гібридизації" мають на увазі умови, при яких зонд буде гібридизуватися з послідовністю-мішенню з визначено більшим ступенем, ніж інші послідовності (наприклад, щонайменше, у 2 рази більше, ніж фон). Жорсткі умови залежать від послідовності і будуть відрізнятися при різних обставинах. Шляхом контролювання жорсткості гібридизації і/ або умов відмивання, послідовності-мішені, що є 100 % комплементарними зонду, можуть бути визначені (гомологічне зондування). Альтернативно, жорсткі умови можуть регулюватися так, щоб допускати деяку розбіжність у послідовностях, так щоб визначалися більш низькі ступені подібності (гетерологічне зондування). У цілому, зонд має менше ніж приблизно 1000 нуклеотидів у довжину, оптимально менше ніж 500 нуклеотидів у довжину. Типово, жорсткі умови будуть такими, при яких концентрація солі складає менше ніж приблизно 1,5 M іонів Na, типово приблизно 0,01-1,0 M іонів Na (або інших солей) при pH 7,08,3, і температура складає, щонайменше, приблизно 30 °C для коротких зондів (наприклад, 1050 нуклеотидів) і, щонайменше, приблизно 60 °C для довгих зондів (наприклад, більше ніж 50 нуклеотидів). Жорсткі умови можуть також бути досягнуті з додаванням дестабілізуючих агентів, таких як формамід. Приклади умов низької жорсткості включають гібридизацію з буферним розчином 30-35 % формаміду, 1 M NaCl, 1 % SDS (додецил сульфат натрію) при 37 °C, і відмивання в 1X-2X SSC (20X SSC=3,0 M NaCl/0,3 M тринатрію цитрат) при 50–55 °C. Приклади умов помірної жорсткості включають гібридизацію в 40-45 % формаміду, 1,0 M NaCl, 1 % SDS при 37 °C, і відмивання в 0,5X-1X SSC при 55–60 °C. Приклади умов високої жорсткості 16 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включають гібридизацію в 50 % формаміді, 1 M NaCl, 1 % SDS при 37 °C, і кінцеве відмивання в 0,1X SSC при 60–65 °C протягом, щонайменше, 30 хвилин. Факультативно, промивні буфери можуть містити від приблизно 0,1 % до приблизно 1 % SDS. Тривалість гібридизації, в цілому, складає менше ніж приблизно 24 години, зазвичай від приблизно 4 до приблизно 12 годин. Тривалість часу відмивання буде, щонайменше, відрізком часу, достатнім для досягнення рівноваги. Специфічність типово є функцією пост-гібридизаційних відмивань, причому критичними факторами є іонна сила і температура кінцевого промивного розчину. Для ДНК-ДНК гібридів термічна точка плавлення (T m) може бути виведена з рівняння Meinkoth і Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm=81,5 °C+16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; де M - це молярність одновалентних катіонів, %GC - це процентне співвідношення гуанозинових і цитозинових нуклеотидів в ДНК, % form - це процентне співвідношення формаміду в розчині гібридизації, і L – це довжина гібрида в парах основ. T m - це температура (при визначеній іонній силі і pH), при якій 50 % комплементарної послідовності-мішені гібридизується з точно співпадаючим зондом. Tm знижується на приблизно 1 °C для кожного 1 % невідповідності; таким чином, Tm, гібридизація і/або умови відмивання можуть бути відрегульовані для того, щоб гібридизуватися з послідовностями бажаної ідентичності. Наприклад, якщо шукають послідовності з >90 % ідентичності, то Tm може бути знижена на 10 °C. Загалом, жорсткі умови вибирають так, щоб вони були на приблизно 5 °C нижче, ніж Tm для специфічної послідовності і комплементарної їй при визначеній іонній силі і pН. Однак особливо жорсткі умови можуть використовувати гібридизацію і/або відмивання при 1, 2, 3 або 4 °C нижче, ніж Tm; помірно жорсткі умови можуть використовувати гібридизацію і/або відмивання при 6, 7, 8, 9 або 10 °C нижче, ніж Tm; умови низької жорсткості можуть використовувати гібридизацію і/або відмивання при 11, 12, 13, 14, 15 або 20 °C нижче, ніж Tm. Використовуючи рівняння, композиції для гібридизації і відмивання і бажану T m, фахівцям у даній галузі буде зрозуміло, що варіації у жорсткості гібридизації і/або розчинах відмивання по суті є описаними. Якщо бажаний ступінь розбіжності є результатом T m менше ніж 45 °C (водний розчин) або 32 °C (розчин формаміду), то оптимальним є підвищити концентрацію SSC, щоб можна було використовувати більш високу температуру. Докладний посібник з гібридизації нуклеїнових кислот можна знайти в Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); і Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Дивися Sambrook et al. (1989) вище. Різні процедури можуть бути використані для перевірки присутності або відсутності конкретної послідовності ДНК, РНК або білка. Вони включають, наприклад, саузерн-блотинги, нозерн-блотинги, вестерн-блотинги і ELISA аналіз. Методики, такі як приведені, є добре відомим фахівцям у даній галузі, і існує безліч посилань, що забезпечують детальні протоколи. Такі посилання включають Sambrook et al. (1989) вище, і Crowther, J.R. (2001), The ELISA Guidebook, Humana Press, Totowa, NJ, USA. Наступні терміни застосовуються для опису взаємовідносин послідовностей між двома або більше полінуклеотидами або поліпептидами: (a) "еталонна послідовність, " (b) "вікно порівняння, " (c) "ідентичність послідовностей" і (d) "процентне співвідношення ідентичності послідовностей." (a) Як використовується в даному документі, "еталонна послідовність" позначає послідовність, що використовується як основа для порівняння послідовностей. Еталонна послідовність може бути частиною або цілою специфічною послідовністю; наприклад, як сегмент повнорозмірної кДНК або генної послідовності, або повна кДНК або генна послідовність. (b) Як використовується в даному документі, "вікно порівняння" посилається на суміжний і специфічний сегмент полінуклеотидної послідовності, де полінуклеотидна послідовність у вікні порівняння може містити вставки або делеції (тобто, гепи) у порівнянні з еталонною послідовністю (яка не містить вставок або делецій) для оптимального вирівнювання двох полінуклеотидів. Загалом, вікно порівняння складає, щонайменше, приблизно 20 суміжних нуклеотидів у довжину, і факультативно може складати приблизно 30, приблизно 40, приблизно 50, приблизно 100 або довше. Фахівцю в даній галузі зрозуміло, що для того, щоб уникнути високого ступеню подібності до еталонної послідовності через включення гепів у полінуклеотидну послідовність, типово вводиться штраф за геп, і він віднімається з кількості збігів. Способи вирівнювання послідовностей для порівняння є добре відомими в даній галузі. Таким чином, визначення процентної ідентичності послідовностей між будь-якими двома послідовностями можна провести, використовуючи математичний алгоритм. Не обмежуючі 17 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 приклади таких математичних алгоритмів являють собою алгоритм Myers і Miller (1988) CABIOS 4:11-17; алгоритм локального вирівнювання Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; алгоритм глобального вирівнювання Needleman і Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; спосіб пошуку на локальне вирівнювання Pearson і Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448; алгоритм Karlin і Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264, модифікований за Karlin і Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Комп'ютерна реалізація цих математичних алгоритмів може бути використана для порівняння послідовностей для визначення ідентичності послідовностей. Такі реалізації включають і не обмежуються наступним: CLUSTAL у PC/Gene програмі (доступна від Intelligenetics, Mountain View, Каліфорнія); програма ALIGN (Версія 2,0) і GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA і TFASTA у GCG Wisconsin Genetics Software Package, Версія 10 (доступні від Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, Сан Дієго, Каліфорнія, США). Вирівнювання з використанням цих програм можуть бути проведені із застосуванням параметрів за замовчуванням. Програма CLUSTAL добре описана Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65; і Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. Програма ALIGN ґрунтується на алгоритмі Myers і Miller (1988) вище. PAM120 таблиця ваги залишків, штраф за продовження гепа 12 і штраф за відкриття гепа 4 можуть використовуватися з програмою ALIGN, коли порівнюються амінокислотні послідовності. Програми BLAST Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403 ґрунтуються на алгоритмі Karlin і Altschul (1990) вище. BLAST пошуки нуклеотидів можуть бути проведені BLASTN програмою, бал = 100, довжина слова = 12, для одержання нуклеотидних послідовностей, гомологічних нуклеотидній послідовності, що кодує білок варіантів здійснення. BLAST пошуки білка можуть бути проведені BLASTX програмою, бал = 50, довжина слова = 3, для одержання амінокислотних послідовностей, гомологічних білку або поліпептиду варіантів здійснення. Для одержання вирівнювань, що містять гепи для цілей порівняння, Gapped BLAST (у BLAST 2,0) може бути використаний, як описано в Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Альтернативно, PSI-BLAST (у BLAST 2,0) може бути використаний для проведення повторюваного пошуку, що визначає дистанційні взаємовідносини між молекулами. Дивися Altschul et al. (1997) вище. При використанні BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, можуть бути використані параметри за замовчуванням відповідних програм (наприклад, BLASTN для нуклеотидних послідовностей, BLASTX для білків). Дивися www.ncbi.nlm.nih.gov. Вирівнювання може бути також проведене вручну шляхом огляду. Якщо не зазначено інше, значення ідентичності послідовностей/подібності, приведені у даному описі, відносяться до значення, отриманого з використанням GAP Версії 10 із застосуванням наступних параметрів: % ідентичності і % подібності для нуклеотидної послідовності із застосуванням ваги гепа, рівної 50, і ваги продовження, рівної 3, і nwsgapdna.cmp матриці замін; % ідентичності і % подібності для амінокислотної послідовності із застосуванням ваги гепа, рівної 8, і ваги продовження, рівної 2, і BLOSUM62 матриці замін; або будь-якої еквівалентної їм програми. Під "еквівалентною програмою" мається на увазі будь-яка програма порівняння послідовностей, що для будь-яких двох аналізованих послідовностей створює вирівнювання, яке має збіги ідентичних нуклеотидних або амінокислотних залишків і ідентичну процентну ідентичність послідовностей у порівнянні з відповідним вирівнюванням, утвореним GAP Версії 10. GAP використовує алгоритм Needleman і Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, для виявлення вирівнювання двох повних послідовностей, що робить максимальним число збігів і мінімізує кількість гепів. GAP розглядає всі можливі вирівнювання і положення гепів і створює вирівнювання з найбільшим числом основ, що збіглися, і найменшими гепами. Програма допускає припущення штрафу за відкриття гепа і штрафу за продовження гепа в одиницях основ, що збіглися. GAP повинний виносити користь з числа штрафів за відкриття гепа збігів для кожного гепа, що він уводить. Якщо вибраний штраф за продовження гепа більше ніж нуль, GAP повинний додатково виносити користь для кожного гепа, введеного по довжині з випадків відкриття гепа штраф за продовження гепа. Значення штрафу за відкриття гепа за замовчуванням і значення штрафу за продовження гепа за замовчуванням у Версії 10 GCG Wisconsin Genetics Software Package для білкових послідовностей складають 8 і 2, відповідно. Для нуклеотидних послідовностей штраф за відкриття гепа за замовчуванням складає 50, тоді як штраф за продовження гепа за замовчуванням складає 3. Штрафи за відкриття гепа і продовження гепа можуть бути виражені як ціле число, вибране з групи цілих чисел, що містять від 0 до 200. Таким чином, наприклад, штрафи за відкриття гепа і за продовження гепа можуть складати 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 або більше. GAP є одним з членів родини найкращих вирівнювань. Може існувати багато членів цього 18 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сімейства, і ніякий інший член не має кращої якості. GAP показує чотири малюнки характеристики для вирівнювань: Якість, Співвідношення, Ідентичність і Подібність. Якість - це показник, збільшений для того, щоб вирівняти послідовності. Співвідношення – це якість, поділена на число основ у більш короткому сегменті. Відсоток ідентичності - це відсоток символів, що дійсно збігаються. Відсоток подібності - це відсоток символів, що є подібними. Символи, що знаходяться навпроти гепів, пропускаються. Подібність оцінюють, коли значення матриці замін для пари символів складає більше ніж або дорівнює 0,50, критичному рівню подібності. Матриця замін, використовувана у Версії 10 GCG Wisconsin Genetics Software Package, являє собою BLOSUM62 (дивися Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915). (c) Як використовується в даному документі, "ідентичність послідовностей" або "ідентичність" у контексті двох полінуклеотидів або поліпептидних послідовностей відноситься до залишків у двох послідовностях, що є однаковими, коли вирівнюються для максимальної відповідності через визначене вікно порівняння. Коли процентне співвідношення ідентичності послідовностей використовується у відношенні білків, то воно означає, що положення залишків, що не ідентичні, часто відрізняються за консервативними амінокислотними замінами, де амінокислотні залишки заміщені на інші амінокислотні залишки з подібними хімічними властивостями (наприклад, заряд або гідрофобність) і, отже, не змінюють функціональних властивостей молекули. Коли послідовності відрізняються в консервативних замінах, процентна ідентичність послідовностей може бути відрегульована вбік збільшення для надання заміні консервативної природи. Вказується, що послідовності, що відрізняються за такими консервативними замінами, мають "подібність послідовностей" або "подібність". Засоби для проведення такого регулювання добре відомі фахівцям у даній галузі. Типово це включає оцінювання консервативної заміни як часткове, а не повне неспівпадіння, що, таким чином, підвищує процентне співвідношення ідентичності послідовностей. Таким чином, наприклад, якщо ідентична амінокислота представлена балом 1, а неконсервативна заміна представлена нулем, то консервативна заміна представлена балом між нулем і 1. Оцінювання консервативних замін обчислюється, наприклад, як реалізація в програмі PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Каліфорнія). (d) Як використовується в даному документі, "процентне співвідношення ідентичності послідовностей" означає значення, визначене порівнянням двох оптимально вирівняних послідовностей через вікно порівняння, де частина полінуклеотидної послідовності у вікні порівняння може містити вставки або делеції (тобто, гепи) у порівнянні з еталонною послідовністю (яка не містить вставок або делецій) для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Процентне співвідношення обчислюють шляхом визначення числа положень, у яких ідентична основа нуклеїнової кислоти або амінокислотний залишок знаходяться в двох послідовностях для одержання числа положень, що збіглися, ділячи число положень, що збіглися, на загальне число положень у вікні порівняння, і множачи результат на 100 для одержання процентного співвідношення ідентичності послідовностей. Застосування терміну "полінуклеотид" не має на увазі обмеження варіантів здійснення до полінуклеотидів, що містять ДНК. Фахівцям у даній галузі зрозуміло, що полінуклеотиди можуть містити рибонуклеотиди і комбінації рибонуклеотидів і дезоксирибонуклеотидів. Такі дезоксирибонуклеотиди і рибонуклеотиди включають як молекули, що зустрічаються в природі, так і синтетичні аналоги. Полінуклеотиди варіантів здійснення також включають усі форми послідовностей, включаючи і не обмежуючись наступним: однониткові форми, двониткові форми і подібне. Ізольовані полінуклеотиди варіантів здійснення можуть бути вбудовані в рекомбінантні ДНКконструкти, здатні проникати і реплікуватися в клітині-хазяїні. "Вектор" може бути таким конструктом, що включає систему реплікації і послідовності, що здатні до транскрипції і трансляції поліпептид-кодуючої послідовності у даній клітині-хазяїні. Ряд векторів, що підходять для стабільної трансфекції рослинних клітин або для створення трансгенних рослин, були описані, наприклад, у Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987; Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; і Flevin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Типово, рослинні вектори експресії включають, наприклад, один або більше клонованих рослинних генів при транскрипційному контролі 5' і 3' регуляторних послідовностей і домінантний селектований маркер. Такі рослинні вектори експресії також можуть містити промоторну регуляторну область (наприклад, регуляторну область, що контролює індуцибельну або конститутивну, регульовану навколишнім середовищем або регульовану розвитком, або клітино- або тканино-специфічну експресію), стартовий сайт ініціації транскрипції, сайт зв'язування з рибосомою, сигнал 19 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 процесингу РНК, сайт термінації транскрипції і/або сигнал поліаденіляції. Терміни "рекомбінантний конструкт", "касета експресії", "конструкт експресії", "химерний конструкт", "конструкт", "рекомбінантний ДНК-конструкт" і "рекомбінантний ДНК фрагмент" використовуються взаємозамінно в даному описі і являють собою фрагменти нуклеїнової кислоти. Рекомбінантний конструкт містить штучну комбінацію фрагментів нуклеїнової кислоти, включаючи, і без обмеження, регуляторну і кодуючу послідовності, що не виявляються разом у природі. Наприклад, рекомбінантний ДНК-конструкт може містити регуляторні послідовності і кодуючі послідовності, що походять з різних джерел, або регуляторні послідовності і кодуючі послідовності, що походять з одного джерела і розташовуються способом, що відрізняється від того, що виявляється в природі. Такий конструкт може використовуватися сам по собі або може використовуватися в сполученні з вектором. Якщо використовується вектор, то вибір вектора залежить від способу, що буде використовуватися для трансформації клітин-хазяїв, що добре відомо фахівцям даної галузі. Наприклад, може бути використаний плазмідний вектор. Фахівцю в даній галузі добре знайомі генетичні елементи, що повинні бути присутні у векторі для того, щоб успішно трансформувати, відбирати і репродукувати хазяйські клітини, що містять будьякий з ізольованих фрагментів нуклеїнової кислоти варіантів здійснення. Скринінг для одержання ліній, що виявляють бажаний рівень експресії і структуру полінуклеотидів або Rcg1 локус, може бути здійснений за допомогою ампліфікації, саузерн-аналізу ДНК, нозерн-аналізу експресії мРНК, аналізу імуноблотингу білкової експресії, фенотипічного аналізу і подібного. Термін "рекомбінантний ДНК-конструкт" відноситься до ДНК-конструкта, зібраного з фрагментів нуклеїнової кислоти, отриманих з різних джерел. Типи і джерела фрагментів нуклеїнової кислоти можуть бути дуже різні. У деяких варіантах здійснення додатково забезпечуються касети експресії, що містять промотор, функціонально зчеплений з гетерологічною нуклеотидною послідовністю варіантів здійснення. Касети експресії варіантів здійснення знаходять застосування у створенні трансформованих рослин, рослинних клітин і мікроорганізмів і в практичних способах для індукування стійкості рослини до грибкового патогену, розкритої в даному документі. Касета експресії буде включати 5' і 3' регуляторні послідовності, функціонально зчеплені з полінуклеотидом варіантів здійснення. "Функціонально зчеплений" означає функціональне зчеплення між двома або більше елементами. "Регуляторні послідовності" відносяться до нуклеотидів, розташованих вище (5" послідовності, що не кодують), в або нижче (3" послідовності, що не кодують, ) кодуючої послідовності, і які можуть впливати на транскрипцію, РНК процесинг, стабільність або трансляцію зв'язаної кодуючої послідовності. Регуляторні послідовності можуть включати, і без обмеження, промотори, лідерні послідовності трансляції, інтрони і послідовності розпізнавання поліаденіляції. Наприклад, функціональне зчеплення між полінуклеотидом інтересу і регуляторною послідовністю (промотором, наприклад) – це функціональний зв'язок, що дозволяє експресію полінуклеотиду інтересу. Функціонально зчеплені елементи можуть бути суміжними або несуміжними. При використанні для позначення сполучення двох кодуючих білок областей під функціонально зчеплений мають на увазі те, що області, що кодують, знаходяться в тій же рамці зчитування. Касета може додатково містити, щонайменше, один додатковий ген, що підлягає котрансформації в організмі. Альтернативно, додатковий ген(и) може забезпечуватися на множинних касетах експресії. Така касета експресії забезпечується з кількома сайтами рестрикції і/або сайтами рекомбінації для вставки полінуклеотиду, що кодує антипатогенний поліпептид, що підлягає транскрипційній регуляції регуляторних областей. Касета експресії може додатково містити селектовані маркерні гени. Касета експресії буде включати в 5'-3' напрямку транскрипції область ініціації транскрипції (тобто, промотор), область ініціації трансляції, полінуклеотид варіантів здійснення, область термінації трансляції і, факультативно, ділянку термінації транскрипції, що функціонує в організмі-хазяїні. Регуляторні області (тобто, промотори, транскрипційні регуляторні області і трансляційні термінаційні області) і/або полінуклеотид варіантів здійснення можуть бути нативними/аналогічними клітині-хазяїну або один одному. Альтернативно, регуляторні області і/або полінуклеотид варіантів здійснення можуть бути гетерологічними клітині-хазяїну або один одному. Як використовується в даному документі, "гетерологічний" відноситься до послідовності, яка являє собою послідовність, що походить від чужих видів, або, якщо з тих самих видів, то істотно модифікована від його нативної форми в композиції і/або геномному локусі шляхом навмисного втручання людини. Наприклад, промотор, функціонально зчеплений з гетерологічним полінуклеотидом, походить від видів, відмінного від видів, з яких отриманий полінуклеотид, або, якщо від тих самих/аналогічних видів, то один або обидва є істотно модифікованими від їх оригінальної форми і/або геномного локусу, або промотор являє собою не нативний промотор для функціонально зчепленого полінуклеотиду. 20 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Факультативно включена термінаційна область може бути нативною з областю ініціації транскрипції, може бути нативною з функціонально зчепленим полінуклеотидом інтересу, може бути нативною з рослиною-хазяїном або може походити з іншого джерела (тобто, чужого або гетерологічного) для промотору, полінуклеотиду інтересу, хазяїна або будь-якої їх комбінації. Придатні термінаційні області доступні від Ti-плазміди A. tumefaciens, наприклад, термінаційні області октопін-синтази і нопалін-синтази. Дивися також Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; і Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639. В конкретних варіантах здійснення використовується термінатор гена інгібітору протеази картоплі II (PinII). Дивися, наприклад, Keil et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:5641-5650; і An et al. (1989) Plant Cell 1:115-122, включені в даний опис шляхом посилання в усій їх повноті. Ряд промоторів може бути використаний у практичному втіленні варіантів здійснення, включаючи нативний промотор полінуклеотидної послідовності інтересу. Промотори можуть бути вибрані на підставі бажаного результату. Широкий діапазон рослинних промоторів описаний в останньому огляді Potenza et al. (2004) In Vitro Cell Dev Biol – Plant 40:1-22, включеному в даний опис шляхом посилання. Наприклад, нуклеїнові кислоти можуть бути скомбіновані з конститутивними, переважними для тканин промоторами, патоген-індукованими або іншими промоторами для експресії в рослинах. Такі конститутивні промотори включають, наприклад, коровий промотор Rsyn7 промотору та інші конститутивні промотори, розкриті в WO 99/43838 і патенті США № 6072050; коровий CaMV 35S промотор (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); актин рису (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); убіквітин (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 і Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); ALS промотор (Патент США № 5659026) і подібні. Інші конститутивні промотори включають, наприклад, патенти США №№ 5608149; 5608144; 5604121; 5569597; 5466785; 5399680; 5268463; 5608142; і 6177611. Іноді може бути вигідною експресія гена з індукованого промотору, конкретно з патогеніндукованого промотору. Такі промотори включають ті, які походять від зв'язаних з патогенезом білків (PR білки), що індукуються після інфікування патогеном; наприклад, PR білки, SAR білки, бета-1,3-глюканаза, хітиназа і т. п. Дивися, наприклад, Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4:645-656; і Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116. Дивися також WO 99/43819, включену в даний опис шляхом посилання. Становлять інтерес промотори, що викликають експресію білка локально на або біля сайта патогенної інфекції. Дивися, наприклад, Marineau et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton et al. (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93-98; і Yang (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972-14977. Дивися також, Chen et al. (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2507-2511; Warner et al. (1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1:961-968; патент США № 5750386 (нематодою індукований); і посилання, що цитуються там. Особливий інтерес представляє індукований промотор для PRms гена маїсу, чия експресія індукується патогеном Fusarium moniliforme (дивися, наприклад, Cordero et al. (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189-200). Крім того, оскільки патогени проникають у рослини через рани або ушкодження комахами, індукований раною промотор може бути використаний у конструкціях варіантів здійснення. Такі індуковані раною промотори включають ген інгібітору протеїнази картоплі (pin II) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan et al. (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wun1 і wun2, Патент США № 5428148; win1 і win2 (Stanford et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); системін (McGurl et al. (1992) Science 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323:73-76); MPI ген (Corderok et al. (1994) Plant J. 6(2):141-150) і подібні, включені в даний опис за допомогою посилання. Хімічно-регульовані промотори можуть бути використані для модуляції експресії гена в рослині за допомогою застосування екзогенного хімічного регулятора. В залежності від мети промотор може бути хімічно-індукованим промотором, де застосування хімікату індукує генну експресію, або хімічно-репресованим промотором, де застосування хімікату репресує генну експресію. Хімічно-індуковані промотори відомі в даній галузі і включають, але не обмежуються, In2-2 промотор маїсу, що активується бензолсульфонамідними гербіцидними антидотами, GST промотор маїсу, що активується гідрофобними електрофільними сполуками, що використовуються як досходові гербіциди, і PR-1a промотор тютюну, що активується саліциловою кислотою. Інші хімічно-регульовані промотори інтересу включають сприйнятливі до 21 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стероїдів промотори (дивися, наприклад, індукований глюкокортикоїдом промотор у Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 і McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2):247-257), тетрациклін-індуковані і тетрациклін-репресовані промотори (дивися, наприклад, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237 і патенти США №№ 5814618 і 5789156), включені в даний опис шляхом посилання. Переважні для тканин промотори можуть використовуватися для націленої посиленої експресії поліпептидів варіантів здійснення в конкретній тканині рослини. Наприклад, переважний для тканин промотор може бути використаний для експресії поліпептиду в рослинній тканині, де стійкість до хвороби є особливо важливою, такій як, наприклад, корені, стебло або листя. Переважні для тканини промотори включають Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; і GuevaraGarcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Такі промотори можуть бути модифіковані, при необхідності, для слабкої експресії. Переважні для судинної тканини промотори відомі в даній галузі і включають такі промотори, що селективно направляють білкову експресію в, наприклад, ксилемній або флоемній тканині. Переважні для судинної тканини промотори включають, і не обмежуються, промотор гена пруназин-гідролази Prunus serotina (дивися, наприклад, Міжнародну публікацію № WO 03/006651), а також ті, що можна знайти в патентній заявці США з серійним номером 10/109488. Переважні для стебла промотори можуть бути використані для керування експресії поліпептиду варіантів здійснення. Приклади стебло-специфічних промоторів включають промотор MS8-15 гена маїсу (дивися, наприклад, патент США № 5986174 і Міжнародну публікацію № WO 98/00533) і ті, що виявлені в Graham et al. (1997) Plant Mol Biol 33(4): 729-735. Переважні для листа промотори відомі в даній галузі. Дивися, наприклад, Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138; і Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590. Переважні для кореня промотори відомі і можуть бути вибрані з багатьох доступних з літературних джерел або виділені de novo з різних сумісних видів. Дивися, наприклад, Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (переважний для кореня ген глутамін-синтетази сої); Keller і Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10):1051-1061 (переважний для кореня контрольний елемент у GRP 1,8 гені квасолі звичайної); Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (переважний для кореня промотор гена маннопін-синтази (MAS) Agrobacterium tumefaciens); і Miao et al. (1991) Plant Cell 3(1):11-22 (повнорозмірний кДНК клон, що кодує цитозольну глютамінсинтетазу (GS), що експресується в коренях і кореневих бульбочках сої). Дивися також Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2(7):633-641, де описуються два корінь-специфічних промотори, ізольовані з генів гемоглобіну з азотфіксуючого небобового Parasponia andersonii і спорідненого неазотфіксуючого небобового Trema tomentosa. Промотори цих генів зчеплені з репортерним геном β-глюкуронідази і введені як у небобове Nicotiana tabacum, так і бобове Lotus corniculatus, і в обох випадках зберігається корінь-специфічна промоторна активність. Leach і Aoyagi (1991) описують їх аналіз промоторів високо експресованих rolС і rolD корень-індукуючих генів Agrobacterium rhizogenes (дивися Plant Science (Limerick) 79(1):69-76). Вони зробили висновок, що енхансер і переважні для тканини ДНК детермінанти дисоціюють у цих промоторах. Teeri et al. (1989) використовував злиття генів з lacZ для демонстрації того, що Agrobacterium T-ДНК ген, який кодує октопін-синтазу є особливо активним в епідермісі кореневого кінчика, і що TR2' ген є переважним для кореня в інтактній рослині і стимулюється пораненням в листовій тканині, особливо бажаною комбінацією характеристик для застосування з інсектицидним або ларвіцидним геном (дивися EMBO J. 8(2):343-350). TR1' ген, злитий з nptII (неоміцинфосфотрансфераза II), показав подібні характеристики. Додаткові переважні для кореня промотори включають промотор VfENOD-GRP3 гена (Kuster et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29(4):759-772); і rolB промотор (Capana et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681-691. Дивися також патенти США №№ 5837876; 5750386; 5633363; 5459252; 5401836; 5110732 і 5023179. "Переважні для насіння" промотори включають як "насіння-специфічні" промотори (ті промотори, що активні під час розвитку насіння, такі як промотори запасних білків насіння), а також промотори "проростання насіння" (ті промотори, що активні під час проростання насіння). 22 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Дивися Thompson et al. (1989) BioEssays 10:108, включений у даний опис шляхом посилання. Такі переважні для насіння промотори включають, і не обмежуються, Cim1 (цитокінініндукований сигнал); cZ19B1 (19 кДа зеїн маїсу); milps (міо-інозитол-1-фосфатсинтаза) (дивися WO 00/11177 і патент США № 6225529; включені в даний опис шляхом посилання). Гамма-зеїн є переважним ендосперм-специфічним промотором. Glob-1 є переважним ембріо-специфічним промотором. Для дводольних рослин насіння-специфічні промотори включають, і не обмежуються, β-фазеолін квасолі, напін, β-конгліцинін, соєвий лектин, круциферин і подібне. Для однодольних рослин насіння-специфічні промотори включають, і не обмежуються, 15 кДа зеїн маїсу, 22 кДа зеїн, 27 кДа зеїн, g-зеїн, воскоподібний, зморшкуватий 1, зморшкуватий 2, глобулін 1 і т. п. Дивися також WO 00/12733, де розкриваються переважні для насіння промотори з end1 і end2 генів; включену в даний опис шляхом посилання. Відомі додаткові модифікації послідовності для посилення генної експресії в клітинному хазяїні. Вони включають виключення послідовностей, що кодують помилкові сигнали поліаденіляції, сигнали сайта сплайсинга екзон-інтрон, транспозон-подібні повтори та інші добре охарактеризовані послідовності, що можуть бути шкідливі для генної експресії. G-C вміст послідовності може бути відрегульований до рівнів середніх для даного клітинного хазяїна, що обчислюється на основі відомих генів, експресованих у клітині-хазяїні. Якщо можливо, послідовність модифікують для того, щоб уникнути передбачених вторинних мРНК структур "шпильок". Касети експресії можуть додатково містити 5' лідерні послідовності. Такі лідерні послідовності можуть діяти, щоб посилювати трансляцію. Трансляційні лідери відомі в даній галузі і включають: лідери пікорнавірусу, наприклад, EMCV лідер (Encephalomyocarditis 5' некодуюча область) (Elroy Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); лідери потівірусу, наприклад, TEV лідер (вірус гравірування тютюну) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2):233-238), MDMV лідер (вірус карликової мозаїки маїсу), і з'єднуючий білок важкого ланцюга імуноглобуліну людини (BiР) (Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); нетрансльований лідер із мРНК білка оболонки вірусу мозаїки люцерни (AMV РНК 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); лідер вірусу мозаїки тютюну (TMV) (Gallie et al. (1989) у Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, Нью-Йорк), pp. 237-256) і лідер вірусу хлоротичної крапчастості маїсу (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Дивися також, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Можуть бути також використані інші відомі способи для посилення трансляції, наприклад, інтрони і подібне. При одержанні касети експресії різними ДНК фрагментами можна маніпулювати так, щоб забезпечити ДНК послідовності в належній орієнтації і, у відповідних випадках, у правильній рамці зчитування. Для цієї мети можуть застосовуватися адаптери або лінкери для сполучення ДНК фрагментів, або можуть бути задіяні інші маніпуляції в забезпеченні придатних сайтів рестрикції, видаленні зайвої ДНК, видаленні сайтів рестрикції або подібного. Для цієї мети можуть бути включені in vitro мутагенез, репарація праймера, рестрикція, відпалювання, повторні заміни, наприклад, транзиції і трансверсії. Касета експресії може також містити селектований маркерний ген для селекції трансформованих клітин. Селектовані маркерні гени використовуються для селекції трансформованих клітин або тканин. Маркерні гени включають гени, що кодують стійкість до антибіотиків, такі як ті, що кодують неоміцин-фосфотрансферазу II (NEO) і гігроміцинфосфотрансферазу (HPT), а також гени, що додають стійкість до гербіцидних сполук, таких як глюфозинат амонію, бромоксиніл, імідазолінони і 2,4-дихлорфеноксиацетат (2,4-D). Додаткові селектовані маркери включають фенотипічні маркери, такі як β-галактозидаза і флуоресцентні білки, такі як зелений флуоресцентний білок (GFP) (Su et al. (2004) Biotechnol Bioeng 85:610-9 і Fetter et al. (2004) Plant Cell 16:215-28), блакитний флуоресцентний білок (CYP) (Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117:943-54 і Kato et al. (2002) Plant Physiol 129:913-42) і жовтий флуоресцентний білок (PhiYFP від Evrogen, дивися, Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117:94354). Для додаткових селектованих маркерів дивися, загалом, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) у The Operon, pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 23 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10:143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al. (1988) Nature 334:721-724. Ці описи включені в даний документ шляхом посилання. Не мається на увазі, що приведений вище список генів селектованих маркерів є обмежуючим. Будь-який селектований маркерний ген може бути використаний у варіантах здійснення. У визначених варіантах здійснення послідовності нуклеїнової кислоти варіантів здійснення можуть піддаватися стекінгу з будь-якою комбінацією полінуклеотидних послідовностей інтересу, для того, щоб створити рослини з бажаним фенотипом. Цей стекінг може бути здійснений шляхом комбінації генів в ДНК-конструкті або шляхом схрещування Rcg1 з іншою лінією, що містить цю комбінацію. Наприклад, полінуклеотиди варіантів здійснення можуть піддаватися стекінгу з будь-якими іншими полінуклеотидами варіантів здійснення або з іншими генами. Утворені комбінації можуть також включати кілька копій будь-якого одного з полінуклеотидів інтересу. Полінуклеотиди варіантів здійснення можуть також піддаватися стекінгу з будь-яким іншим геном або комбінацією генів для одержання рослин з різноманітними комбінаціями бажаних ознак, включаючи і не обмежуючись ознаками, описаними для корму для тварин, такі як гени високого вмісту олії (наприклад, патент США № 6232529); збалансовані амінокислоти (наприклад, хордотіоніни (патенти США №№ 5990389; 5885801; 5885802 і 5703409); ячмінь з високим вмістом лізину (Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; і WO 98/20122) і білки з високим вмістом метіоніну (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara et al. (1988) Gene 71:359; і Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 123)); підвищена перетравлюваність (наприклад, модифіковані запасні білки (заявка на патент США серійний номер 10/053410, подана 7 листопада 2001 р.) і тіоредоксини (заявка на патент США серійний номер 10/005429, подана 3 грудня 2001 р.)), описи яких включені в даний документ шляхом посилання. Полінуклеотиди варіантів здійснення можуть також піддаватися стекінгу з ознаками, бажаними для стійкості до комах, хвороб або гербіцидів (наприклад, Bacillus thuringiensis токсичні білки (патенти США №№ 5366892; 5747450; 5737514; 5723756; 5593881; Geiser et al (1986) Gene 48:109); лектини (Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:825); гени дезінтоксифікації фумонізину (патент США № 5792931); гени авірулентності і стійкості до хвороби (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); мутанти ацетолактат-синтази (ALS), що призводить до гербіцидної стійкості, такі як S4 і/або Hra мутації; інгібітори глутамін-синтази, такі як фосфінотрицин або basta (наприклад, ген bar); і глікофосфатна стійкість (EPSPS гени, GAT гени, такі як ті, що розкриті в публікації патентної заявки США US2004/0082770, також WO02/36782 і WO03/092360)); і ознаки, бажані для процесингу або продуктів процесингу, такі як високий вміст олії (наприклад, патент США № 6232529); модифіковані олії (наприклад, гени жирнокислотної десатурази (патент США № 5952544; WO 94/11516)); модифіковані крохмалі (наприклад, ADPG пірофосфорилази (AGPаза), крохмаль-синтази (SS), ферменти розгалуження крохмалю (SBE) і ферменти дерозгалуження крохмалю (SDBE)); і полімери або біопластмаси (наприклад, патент США № 5602321; бета-кетотіолаза, полігідроксибутират синтаза та ацетоацетил-CoА редуктаза (Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) полегшена експресія полігідроксиалканоатів (PHA)), описи яких включені в даний документ за допомогою посилання. Можна також комбінувати полінуклеотиди варіантів здійснення з полінуклеотидами, що забезпечують агрономічні ознаки, такі як чоловіча стерильність (наприклад, дивися патент США № 5583210), сила стебла, час цвітіння або ознаки трансформаційної техніки, такі як регуляція клітинного циклу або генне мічення (наприклад, WO 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821), описи яких включені в даний документ шляхом посилання. Ці комбінації, отримані в результаті стекінгу, можуть бути створені будь-яким способом, ® включаючи і не обмежуючи кросбридінгом рослин будь-якою придатної або TopCross методикою або генетичною трансформацією. Якщо ознаки піддаються стекінгу шляхом генетичної трансформації рослин, то полінуклеотидні послідовності інтересу можуть комбінуватися в будь-який час і в будь-якому порядку. Наприклад, трансгенна рослина, що містить один або більше бажаних ознак, може бути використана як мішень для введення додаткових ознак шляхом подальшої трансформації. Ознаки можуть бути введені одночасно в протоколі котрансформації з полінуклеотидами інтересу, забезпеченими будь-якою комбінацією касет трансформації. Наприклад, якщо дві послідовності будуть вводитися, то дві послідовності можуть міститися в окремих касетах трансформації (транс) або міститися в одній касеті 24 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 трансформації (цис). Експресія послідовностей може направлятися однаковим промотором або різними промоторами. У певних випадках може бути бажаним введення касети трансформації, що буде пригнічувати експресію полінуклеотиду інтересу. Вона може бути комбінована з будьякою комбінацією інших касет супресії або касет надекспресії для утворення бажаної комбінації ознак в рослині. Способи варіантів здійснення можуть включати, і не обмежуються, введення поліпептиду або полінуклеотиду в рослину. "Введення" означає представлення рослині полінуклеотиду. У деяких варіантах здійснення полінуклеотид буде забезпечений таким чином, що послідовність отримує доступ до внутрішнього вмісту клітини рослини, включаючи її можливу вставку в геном рослини. Способи варіантів здійснення не залежать від конкретного способу введення послідовності в рослину, за винятком того, що полінуклеотид отримує доступ до внутрішнього вмісту, щонайменше, однієї клітини рослини. Способи для введення полінуклеотидів в рослини відомі в даній галузі, включаючи, і не обмежуючись, способи стабільної трансформації, способи нестійкої трансформації та вірус-опосередковані способи. "Трансформація" відноситься до переносу фрагмента нуклеїнової кислоти в геном організму-хазяїна, призводячи до генетично стабільного успадкування. Хазяйські організми, що містять трансформовані фрагменти нуклеїнової кислоти, називаються "трансгенні" організми. "Клітина-хазяїн" відноситься до клітини, у якій має місце трансформація рекомбінантного ДНКконструкта, і може включати дріжджову клітину, бактеріальну клітину і рослинну клітину. Приклади способів рослинної трансформації включають Agrobacterium-опосередковану трансформацію (De Blaere et al., 1987, Meth. Enzymol. 143:277) і технологію трансформації прискоренням частинок або "генної гармати" (Klein et al., 1987, Nature (London) 327:70-73; патент США № 4945050), серед інших. "Стабільна трансформація" має на увазі те, що нуклеотидний конструкт, введений у рослину, інтегрує в геном рослини і може бути успадкований її потомством. "Нестійка трансформація" або "нестійка експресія" має на увазі те, що полінуклеотид вводиться в рослину, а не інтегрується в геном рослини, або поліпептид вводиться в рослину. Протоколи трансформації, а також протоколи введення поліпептидів або полінуклеотидних послідовностей в рослини, можуть змінюватися в залежності від типу рослини або рослинної клітини, тобто, однодольна або дводольна, націлена для трансформації. Придатні способи введення поліпептидів і полінуклеотидів у рослинні клітини включають мікроін'єкцію (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), електропорацію (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, Agrobacterium-опосередковану трансформацію (патенти США №№ 5563055 і 5981840), спрямований перенос гена (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722) і балістичне прискорення частинок (дивися, наприклад, Sanford et al., патенти США №№ 4945050; 5879918; 5886244 і 5932782; Tomes et al. (1995) у Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg і Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923926) і Lec1 трансформацію (WO 00/28058). Також дивися, Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (цибуля); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (соя); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923926 (соя); Finer і McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (соя); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (соя); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (рис); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (маїс); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (маїс); патенти США №№ 5240855; 5322783 і 5324646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440444 (маїс); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (маїс); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763-764; Патент США № 5736369 (зернові); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (лілейні); De Wet et al. (1985) у The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, Нью-Йорк), pp. 197-209 (пилок); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 і Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (віскеропосередкована трансформація); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (електропорація); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 і Christou i Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (rice); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (маїс за допомогою Agrobacterium tumefaciens); всі з яких включені в даний опис шляхом посилання. Способи відомі в даній галузі для націленої вставки полінуклеотиду в специфічне положення в рослинний геном. В одному варіанті здійснення вставка полінуклеотиду в бажане геномне положення досягається з використанням системи сайт-специфічної рекомбінації. Дивися, наприклад, WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 і WO99/25853, що включені в даний опис шляхом посилання. Коротко, полінуклеотид варіантів здійснення може міститися в касеті переносу, фланкованій двома неідентичними сайтами рекомбінації. Ця касета переносу вводиться в рослину, стабільно включається в його геном, сайт-мішень якої фланкований двома 25 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 неідентичними сайтами рекомбінації, що відповідають сайтам касети переносу. Забезпечується відповідна рекомбіназа, і касета переносу інтегрується в сайт-мішень. Полінуклеотид інтересу, таким чином, інтегрується в специфічне хромосомне положення в рослинному геномі. Клітини, що були трансформовані, можуть бути вирощені в рослини відповідно до придатних методів. Дивися, наприклад, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Ці рослини можуть бути потім вирощені і, або запилені таким же трансформованим штамом, або різними штамами, і визначають отримане потомство, що має конститутивну експресію бажаної фенотипічної характеристики. Два або більше покоління можуть бути вирощені для того, щоб гарантувати, що експресія бажаної фенотипічної характеристики стабільно підтримується та успадковується, а потім насіння збираєься, щоб гарантувати, що експресію бажаної фенотипічної характеристики було досягнуто. Таким способом, варіанти здійснення забезпечують трансформоване (також назване "трансгенне насіння"), що має нуклеотидний конструкт варіантів здійснення, наприклад, касету експресії варіантів здійснення, стабільно вбудовану в їх геном. Як використовується в даному документі, термін "рослина" може бути цілою рослиною, будь-якою її частиною або клітинною чи тканинною культурою, отриманою з рослини. Таким чином, термін "рослина" може відноситися до будь-якого з наступного: цілі рослини, рослинні компоненти або органи (включаючи, але не обмежуючись, зародки, пилок, сім'ябруньки, насіння, листя, квіти, гілки, плоди, зерна, качани, стрижні качанів, листові обгортки качанів, стебла, корені, кореневі кінчики, пиляки і подібне), рослинні тканини, рослинні клітини, рослинні протопласти, клітинні культури тканин рослин, з яких рослина маїсу може бути регенерована, рослинні калюси, кущі рослин і насіння рослин. Рослинна клітина - це клітина рослини, або взята безпосередньо з насіння, або з рослини, або отримана за допомогою культури з клітини, отриманої з рослини. Під зерном мають на увазі зріле насіння, вироблене комерційними виробниками для цілей, відмінних від вирощування або репродукції видів. Потомство, варіанти і мутанти регенерованих рослин також включені в обсяг варіантів здійснення, що забезпечено тим, що ці частини містять введені полінуклеотиди. Варіанти здійснення даного винаходу можуть бути використані для того, щоб надавати або посилювати стійкість рослини до грибкового патогену або захищати від атаки грибкового патогену в рослинах, особливо кукурудзі (Zea mays). Буде здійснюватися захист різних частин рослини від атаки патогенів, включаючи, і не обмежуючись, стебла, качани, листя, корені і волоть. Інші види рослини можуть також становити інтерес у практичному застосуванні варіантів здійснення даного винаходу, включаючи, і не обмежуючись наступним. Терміни "фенотип", або "фенотипічна ознака", або "ознака" відноситься до одної або більше ознак організму. Фенотип можна спостерігати неозброєним оком або будь-якими іншими засобами оцінки, відомими в даній галузі, наприклад, мікроскопія, біохімічний аналіз або електромеханічне дослідження. В деяких випадках фенотип прямо контролюється окремим геном або генетичним локусом, тобто, є "ознакою одиночного гена". В інших випадках фенотип є результатом кількох генів. "Фізична карта" геному - це карта, що показує лінійний порядок знаків, що ідентифікуються (включаючи гени, маркери і т. п.) на хромосомній ДНК. Однак, на відміну від генетичних карт, відстані між знаками є абсолютними (наприклад, виміряні в парах основ або ізольованих і суміжних генетичних фрагментах, що перекриваються) і не ґрунтуються на генетичній рекомбінації. У маїсу певна кількість BAC, або штучних хромосом бактерій, кожна з який містить велику вставку геномної ДНК маїсу, збиралася в контиги (суміжні генетичні фрагменти або "суміжні ДНК"). BAC може збиратися в контиг на основі вирівнюванні послідовностей, якщо BAC секвенують, або за допомогою вирівнювання його BAC фінгерпринту з фінгерпринтами інших BAC у контизі. Збірки доступні для громадськості із застосуванням геному Maize Genome Browser, що є загальнодоступним в Інтернеті. "Рослина" може бути цілою рослиною, будь-якою її частиною або клітинною або тканинною культурою, отриманої з рослини. Таким чином, термін "рослина" може відноситися до будьякого з: цілі рослини, рослинні компоненти або органи (наприклад, листя, стебла, корені і т. п.), рослинні тканини, насіння, рослинні клітини і/або їх потомство. Рослинна клітина - це клітина рослини, взята з рослини або отримана шляхом культивування з клітини, взятої з рослини. Таким чином, термін "рослина маїсу" включає цілі рослини маїсу, клітини рослини маїсу, протопласт рослини маїсу, клітинну або тканинну культуру рослини маїсу, з яких рослини маїсу можуть бути регенеровані, калюси рослини маїсу і клітини рослини маїсу, що є інтактними в рослинах маїсу, або частини рослин маїсу, такі як насіння маїсу, стрижні качанів маїсу, квіти маїсу, сім'ядолі маїсу, листя маїсу, стебла маїсу, бруньки маїсу, корені маїсу, кореневі кінчики 26 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 маїсу і подібні. Термін "локус кількісної ознаки" або "QTL" відноситься до області ДНК, що зв'язана з диференціальною експресією фенотипічної ознаки в, щонайменше, одному генетичному фоні, наприклад, у, щонайменше, одній популяції для розмноження. QTL близько зчеплені з геном або генами, що лежать в основі шуканої ознаки. Перед описом даного винаходу в деталях необхідно зрозуміти, що даний винахід не обмежується конкретними варіантами здійснення. Також необхідно розуміти, що термінологія, використана в даному документі, застосовується з метою опису конкретних варіантів здійснення, і не мається на увазі, що вона є обмежуючою. Як використовується в даному документі і у доданій формулі винаходу, термін в однині і форми однини, наприклад, включає об'єкти в множині, якщо тільки точний зміст не визначає зворотне. Таким чином, наприклад, посилання на "рослину" також включає кілька рослин. У залежності від контексту застосування терміну "рослина" може також включати генетично подібне або ідентичне потомство такої рослини. Застосування терміну "нуклеїнова кислота" факультативно включає кілька копій такої молекули нуклеїнової кислоти. Забезпечуються способи для визначення рослин маїсу з підвищеною стійкістю до летючої сажки за допомогою генотипування зв'язаних маркерних локусів. Стійкість до летючої сажки у маїсу являє собою агрономічно важливу ознаку, тому що інфекція летючої сажки знижує врожай. Досить давно було виявлено, що специфічні хромосомні локуси (або ділянки) можуть бути картовані в геномі організму, що корелюють з конкретними кількісними фенотипами, такими як стійкість до летючої сажки. Такі локуси називаються локусами кількісної ознаки або QTL. Селекціонер рослин може переважно застосовувати молекулярні маркери для визначення бажаних особин шляхом ідентифікації маркерних алелів, що показують статистично достовірну імовірність косегрегації з бажаним фенотипом, що проявляється як нерівноважне зчеплення. Шляхом визначення молекулярного маркера або кластерів молекулярних маркерів, що косегрегують з кількісною ознакою, селекціонер, таким чином, визначає QTL. Шляхом визначення і селекції маркерного алеля (або бажаних алелів із множинних маркерів), що асоціює з бажаним фенотипом, селекціонер рослин здатний швидко відібрати бажаний фенотип шляхом селекції по точному молекулярному маркерному алеля (спосіб названий селекцією з використанням маркера або MAS). Різноманітні способи, добре відомі в даній галузі, доступні для виявлення молекулярних маркерів або кластерів молекулярних маркерів, що косегрегують з кількісною ознакою, такою як стійкість до летючої сажки. Головна ідея, що лежить в основі всіх цих способів, полягає у визначенні маркерів, для яких альтернативні генотипи (або алелі) мають вірогідно різні усереднені фенотипи. Таким чином, проводиться порівняння між маркерними локусами по величині відмінності серед альтернативних генотипів (або алелів) або рівнем значимості цієї відмінності. Роблять висновок, що гени ознаки розташовані поблизу маркера(ів), що мають найбільшу спряжену генотипічну відмінність. Два таких способи, використаних для визначення QTL, являють собою: 1) структурований аналіз спряженості на основі популяцій і 2) аналіз спряженості на генеалогічній основі. У структурованому аналізі спряженості на основі популяцій лінії отримують від раніше існуючих популяцій з множинними засновниками, наприклад елітні генеалогічні лінії. Аналізи спряженостей на основі популяцій ґрунтуються на виродженні нерівновагого зчеплення (LD) і ідеї про те, що в неструктурованій популяції, лише кореляції між QTL і маркерами, близько зчепленими з QTL, будуть зберігатися після багатьох поколінь випадкового спарювання. Насправді, більшість раніше існуючих популяцій мають популяційну підструктуру. Таким чином, застосування структурованого підходу спряженостей допомагає контролювати популяційну структуру шляхом розподілу особин у популяції, використовуючи дані, отримані від маркерів, випадково розподілених усередині геному, таким чином, мінімізуючи нерівноважний стан завдяки популяційній структурі в межах окремих популяцій (також названих субпопуляціями). Фенотипічні значення порівнюються з генотипами (алелями) на кожному маркерному локусі для кожної лінії в субпопуляції. Достовірне спряження маркер-ознака означає безпосередню близькість між маркерним локусом і одним або більше генетичними локусами, що включені в експресію цієї ознаки. В аналізах спряженостей на генеалогічній основі LD генерується шляхом створення популяції з невеликої кількості засновників. Наприклад, у підході інтервального картування (Lander і Botstein, Genetics 121:185-199 (1989), кожне з багатьох положень уздовж генетичної карти (приблизно з інтервалами в 1 cМ) аналізується на імовірність того, що QTL розташовано в цьому положенні. Дані генотипу/фенотипу використовуються для обчислення для кожного аналізованого положення LOD показника (логарифм співвідношення шансів). Коли 27 UA 106722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 LOD показник досягає критичного граничного значення (тут рівного 2,5), існує достовірна підстава для розташування QTL у цьому положенні на генетичній карті (яке буде знаходитися між двома конкретними маркерними локусами). Маркери, зв'язані з ознакою стійкості до летючої сажки, визначаються в даному документі як маркерні алелі, пов'язані або з підвищеною, або зі зниженою стійкістю до летючої сажки. Способи включають виявлення присутності, щонайменше, одного маркерного алелю, пов'язаного або з підвищеною, або зі зниженою стійкістю до летючої сажки в ідіоплазмі рослини маїсу. Загальний ступінь зчеплення - це частота, з якою ознаки косегрегують. Вона може бути виражена як процентне співвідношення косегрегації (частота рекомбінації) або в сантиморганах (cМ). cМ – це одиниця виміру частоти генетичної рекомбінації. Один cМ дорівнює 1 % шансу того, що ознака на одному генетичному локусі буде відділена від ознаки на іншому локусі завдяки кросинговеру в одному поколінні (означаючи, що ознаки сегрегують разом 99 % часу). Оскільки хромосомна відстань є приблизно пропорційною частоті явищ кросинговеру між ознаками, то існує приблизна фізична відстань, що корелює з частотою рекомбінації. Наприклад, у маїсу 1 cМ корелює, у середньому, з приблизно 2140000 парами основ (2,14 Mbp). Маркерні локуси самі по собі є ознаками, і їх можна оцінити відповідно до стандартного аналізу зчеплення шляхом відстеження маркерних локусів під час сегрегації. Таким чином, один cМ дорівнює 1 % шансу того, що маркерний локус буде відділений від іншого, внаслідок кросинговеру в окремому поколінні. Інші маркери, зчеплені з QTL маркерами, можуть використовуватися для передбачення стану стійкості до летючої сажки в рослині маїсу. Це включає будь-який маркер в межах 50 cМ генетичного локусу. Чим ближче маркер розташований до QTL маркера, тим більш ефективно і переважно цей маркер виступає як індикатор для бажаної ознаки. Близько зчеплені локуси виявляють внутрішньолокусну частоту кросинговеру приблизно 10 % або менше, переважно приблизно 9 % або менше, більш переважно приблизно 8 % або менше, ще більш переважно приблизно 7 % або менше, більш переважно приблизно 6 % або менше, ще більш переважно приблизно 5 % або менше, більш переважно приблизно 4 % або менше, ще більш переважно приблизно 3 % або менше, і більш переважно приблизно 2 % або менше. У високо переважних варіантах здійснення відповідні локуси (наприклад, маркерний локус і локус-мішень, такий як QTL) виявляють частоту рекомбінації приблизно 1 % або менше, наприклад, приблизно 0,75 % або менше, більш переважно приблизно 0,5 % або менше, або ще більш переважно приблизно 0,25 % або менше. Таким чином, локуси складають приблизно 10 cМ, 9 cМ, 8 cМ, 7 cМ, 6 cМ, 5 cМ, 4 cМ, 3 cМ, 2 cМ, 1 cМ, 0,75 cМ, 0,5 cМ, 0,25 cМ, 0,1 cМ, 0,075 cМ, 0,05 cМ, 0,025 cМ або 0,01 cМ, або менше окремо. Іншими словами, вказується, що два локуси, розташовані на одній хромосомі і на такій відстані, що рекомбінація між двома локусами відбувається з частотою менше ніж 10 % (наприклад, приблизно 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,75 %, 0,5 %, 0,25 %, 0,1 %, 0,075 %, 0,05 %, 0,025 % або 0,01 % або менше), є "близькими" один до одного. Хоча конкретні маркерні алелі можуть показувати косегрегацію з фенотипом стійкості до летючої сажки, важливо відзначити, що маркерний локус не обов'язково є частиною QTL локусу, відповідального за експресію фенотипу стійкості до летючої сажки. Наприклад, немає необхідності, щоб маркерна полінуклеотидна послідовність була частиною гена, що надає підвищену стійкість до летючої сажки (наприклад, була частиною гена відкритої рамки зчитування). Спряження між специфічним маркерним алелем з фенотипом або підвищеної, або зниженої стійкості до летючої сажки, відбувається завдяки оригінальній фазі "кон'югації" зчеплення між маркерним алелем і QTL алелем в предковій лінії маїсу, від якої походить QTL алель. В результаті, з повторюваною рекомбінацією події кросинговеру між маркером і QTL локусом можуть змінити цю орієнтацію. З цією метою сприятливий маркерний алель може змінюватися в залежності від фази зчеплення, що існує у стійкого батька, використовуваного для створення сегрегуючих популяцій. Це не змінює факт того, що генетичний маркер може використовуватися для контролю сегрегації фенотипу. Це змінює тільки те, яка маркерна алель розглядається сприятливої в даної сегрегуючої популяції. Різноманітні способи, добре відомі в даній галузі, доступні для визначення ділянок хромосоми. Межі таких ділянок хромосоми наносяться для того, щоб включати маркери, що будуть зчеплені з одним або більше QTL. Іншими словами, ділянка хромосоми наноситься так, щоб будь-який маркер, що лежить в ділянці (включаючи термінальні маркери, що позначають межі ділянки), міг бути використаний як маркер для стійкості до летючої сажки. Кожна ділянка містить, щонайменше, один QTL і, крім того, може звичайно містити більш ніж один QTL. Безпосередня близькість кількох QTL в одній ділянці може заплутувати кореляцію конкретного 28