Рекомбінантна бактерія deіnococcus та її застосування для одержання етанолу

Реферат: Винахід належить до бактерії Deinococcus, яка містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту, яка кодує ген PDC та ADH, конструкцій нуклеїнової кислоти, прийнятних для одержання бактерії за UA 104467 C2 (12) UA 104467 C2 даним винаходом, а також застосування бактерії Deinococcus, для одержання технічного етанолу. UA 104467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід стосується рекомбінантних бактерій і їх застосувань, зокрема, для отримання етанолу. Даний винахід також стосується способів отримання таких бактерій, а також конструкцій нуклеїнової кислоти, прийнятних для такого отримання. Даний винахід конкретно стосується бактерій, що не мають функціонального гена LDH і/або містять рекомбінантну нуклеїнову кислоту, яка кодує PDC або ADH. Бактерії за даним винаходом можуть бути отримані з будь-яких стресостійких бактерій, зокрема, з будь-якого штаму Deinococcus, включаючи екстремофільні штами, такі як, без обмеження, D. radiodurans, D. geothermalis, D. Murrayi, D. cellulosilyticus або D. deserti. Вступ У літературі повідомлялося про бактерії, які мають здатність наново збирати свій геном, зруйнований стресом, такий як бактерії Deinococcus. Deinococcus являє собою грампозитивну бактерію, яка була відкрита в 1956 році Андерсоном і співробітниками. Цей екстремофільний організм резистентений до пошкодження ДНК під впливом УФ і іонізуючих випромінювань або перехреснозшиваючого агента (мітоміцину С) і стійкий до висушування. У WO01/023526 показана незвичайна стійкість Deinococcus до радіації і, крім того, запропоновані їх інженерія і застосування в біоремедіації. У патентній заявці № WO2009/063079, неопублікованій на дату пріоритету даної заявки, показано, що бактерії Deinococcus можуть виявляти стійкість до розчинників і трансформувати біомасу, виробляючи етанол. Інші стресостійкі бактерії описані в патентній заявці № EP09 305041.7, в цей час неопублікованої, також як і способи їх отримання і/або вибору і їх здатність виробляти метаболіти, такі як антибіотики. Генетично змінені грампозитивні або Geobacillus штами згадані в WO95/27064 і WO2006/131734. Для вказаних штамів не було описано задовільного отримання метаболітів для перспективи промислового виробництва. Більш того штами Geobacillus утворюють спори, що являє собою значний недолік для промислового застосування. У даному винаході показано, що геном стресостійких бактерій, зокрема, бактерій Deinococcus, можна модифікувати, поліпшивши їх здатність виробляти етанол. Більш конкретно, в даному винаході показано, що існує можливість модифікації метаболічних шляхів в стресостійких бактеріях, зокрема, бактеріях Deinococcus, для того щоб збільшити їх продуктивність в отриманні етанолу. Суть винаходу Мета даного винаходу стосується рекомбінантної стресостійкої бактерії, зокрема, бактерії Deinococcus, причому вказана бактерія має модифікований геном, який містить інактивований ген L-лактатдегідрогенази (LDH). У конкретному варіанті здійснення ген LDH видалений, повністю або частково, і не кодує функціональний фермент лактатдегідрогенази. Рекомбінантна бактерія за даним винаходом переважно додатково містить рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує піруватдекарбоксилазу (PDC) і/або алкогольдегідрогеназу (ADH). У зв'язку з цим наступною метою даного винаходу є рекомбінантна стресостійка бактерія, зокрема, бактерія Deinococcus, причому вказана бактерія містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту, переважно плазміду, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує піруватдекарбоксилазу і/або алкогольдегідрогеназу. Бактерія за даним винаходом може бути вибрана з різних видів стресостійких бактерій, таких як бактерії Deinococcus, бактерії Tepidimonas, бактерії Truepera, бактерії Porphyrabacter, бактерії Novosphingobium або бактерії Exiguobacterium. Переважними бактеріями за даним винаходом є бактерії Deinococcus, такі як, без обмеження, D. radiodurans, D. geothermalis, D murrayi, D. cellulosilyticus або D. deserti, переважно термофільна бактерія Deinococcus. Наступною метою даного винаходу є спосіб отримання біопалива, зокрема, етанолу, що включає культивування бактерії, визначеної вище, в присутності відповідного субстрату і збір біопалива. Даний винахід також стосується застосування бактерії, визначеної вище, для отримання етанолу. Даний винахід також стосується способу отримання рекомбінантної стресостійкої бактерії, зокрема, бактерії Deinococcus, визначеної вище, або її предка, що включає: - отримання (батьківської) стресостійкої бактерії, зокрема, бактерії Deinococcus; - обробку бактерії з метою інактивації гена LDH і - відбір бактерії з інактивованим геном LDH. 1 UA 104467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід також стосується способу отримання рекомбінантної стресостійкої бактерії, зокрема, бактерії Deinococcus, визначеної вище, або її предка, що включає: - отримання (батьківської) стресостійкої бактерії, зокрема, бактерії Deinococcus; - введення у вказану бактерію молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує PDC і/або ADH, і - відбір бактерії, яка експресує вказану нуклеїнову кислоту. Даний винахід також стосується плазмідної конструкції, причому вказана плазміда реплікується в бактерії Deinococcus і містить нуклеїнову кислоту, яка кодує PDC і/або ADH. Пояснення до фігур Фіг. 1: Конструювання і структура інтегративної конструкції pDR-LDHdel для часткової делеції LDH. Вставку з гомологічними областями і хлорамфенікольною касетою синтезували і R R клонували в LITMUS28i. Cam , стійкість до хлорамфеніколу; Amp , стійкість до ампіциліну; GDR_term85, передбачуваний термінатор транскрипції Deinococcus radiodurans; P D. rad., передбачуваний промотор Deinococcus radiodurans; 5'HR, 5'-гомологічна область; 3'HR, 3'гомологічна область; Е. coli ORI, точка початку реплікації Escherichia coli. Фіг. 2: Гомологічні області послідовностей 5' (SEQ ID NO: 1) і 3' (SEQ ID NO: 2). Фіг. 3: Спосіб конструювання L-лактатдегідрогеназних (локус DR_2364) мутантів Deinococcus R R radiodurans за допомогою гомологічної рекомбінації. Cam , стійкість до хлорамфеніколу; Amp , стійкість до ампіциліну; 5'HR, 5'-гомологічна область; 3'HR, 3'-гомологічна область; Е. coli ORI, точка початку реплікації Escherichia coli. Фіг. 4: Послідовності нуклеїнових кислот генів ZmPDC (SEQ ID NO: 3) і ZmADH II (SEQ ID NO: 4). Фіг. 5: Конструювання і структура плазмід pI3-DR-P-PDC-ADH (a), pI3-DR-P-PDCtag-ADHtag (b), pI3-DR-P-PDC-P-ADH (с) і pI3-DR-P-PDCtag-P-ADHtag (d). Оперон RBS groESL, область сайту зв'язування рибосом, розташована проти ходу транскрипції відносно оперона groESL R R Deinococcus radiodurans (Meima et al, 2001); Amp , стійкість до ампіциліну; Cam , стійкість до хлорамфеніколу; Е. coli ORI, точка початку реплікації Escherichia coli; PtufA, 432 п.о., розташовані вище відносно передбачуваного стартового кодона трансляції гена tufA; PtufB, 234 п.о., розташовані вище відносно передбачуваного стартового кодона трансляції гена tufB; ZmPDC, ген піруватдекарбоксилази Zymomonas mobilis; ZmADH, ген алкогольдегідрогенази II Zymomonas mobilis; Term85, міжгенна послідовність, розташована між локусом DR_1184 і DR_1185, що містить передбачуваний термінатор транскрипції; Term116, термінатор транскрипції Term116 (Lecointe et al, 2004); D. rad. ORI, точка початку реплікації Deinococcus radiodurans; P D. rad., промотор Deinococcus radiodurans. Фіг. 6: Активність алкогольдегідрогенази для D. radiodurans, трансформованої за допомогою pI3-DR-P-PDC-P-ADH (a) або pI3-DR-P-PDCtag-P-ADHtag (b). Фіг. 7: Перебудований метаболічний шлях. Фіг. 8: Трикомпонентне лігування продуктів ПЛР для створення мутанта PDC+ADH+LDH. R Cam , стійкість до хлорамфеніколу; PtufA, 432 п.о., розташовані вище відносно передбачуваного стартового кодона трансляції гена tufA; PtufB, 234 п.о., розташовані вище відносно передбачуваного стартового кодона трансляції гена tufB; ZmPDC, ген піруватдекарбоксилази Zymomonas mobilis; ZmADH, ген алкогольдегідрогенази II Zymomonas mobilis; Term85, міжгенна послідовність, розташована між локусом DR_1184 і DR_1185, що містить передбачуваний термінатор транскрипції; Term116, термінатор транскрипції Term116 (Lecointe et al, 2004); P D. rad., передбачуваний промотор Deinococcus radiodurans; 5'HR, 5'гомологічна область; 3'HR, 3'-гомологічна область. Таблиця 1: Назви рекомбінантів, що використовуються для метаболічного аналізу. Таблиці 2-5: Рекомбінанти Deinococcus: отримання метаболітів в комплексному середовищі або середовищі певного складу. Докладний опис винаходу Даний винахід стосується рекомбінантних стресостійких бактерій і їх застосувань для отримання біопалива або інших метаболітів. У контексті даного винаходу термін "стресостійка бактерія" означає більш конкретно бактерію, яка має здатність наново збирати свій геном, повністю або частково, коли він зруйнований стресом. Стрес може являти собою будь-який руйнуючий клітину ушкоджуючий ДНК вплив, тобто вплив, якого достатньо, для того щоб викликати смерть 90 % клітин або більше в культурі бактерій Е. coli. Ще більш переважно руйнуючий клітину ушкоджуючий ДНК вплив являє собою вплив, якого достатньо, для того щоб зменшити на щонайменше 2 порядки бактерійний титр в культурі Е. coli. Приклади такого впливу включають опромінення, переважно багаторазове і послідовне УФ опромінення, і/або застосування генотоксичних речовин. 2 UA 104467 C2 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Переважним стресовим впливом є УФ вплив між 0,5 і 400 мДж/см , більш переважно між 1 і 200 2 2 мДж/см , звичайно між 1 і 100 мДж/см , прикладений протягом періоду часу приблизно від 5 2 секунд до 5 хвилин. Переважно УФ вплив становить 4 мДж/см протягом 30 секунд, який можна повторювати з інтервалом між 1 і 8 годинами, переважно від 3 до 5 годин і більш переважно приблизно 4 години. Конкретні стресові впливи на клітину відповідно до даного винаходу описані в патентній заявці № EP09 305041.7, неопублікованій, яка включена в даний опис за допомогою посилання. Стійкі до клітинного стресу бактерії відповідно до даного винаходу включають більш конкретно бактерії Deinococcus, бактерії Tepidimonas, бактерії Truepera, бактерії Porphyrabacter, бактерії Novosphingobium або бактерії Exiguobacterium. Переважними бактеріями за даним винаходом є бактерії Deinococcus, зокрема, екстремофільні бактерії Deinococcus, більш переважно бактерії Deinococcus вибрані з D. radiodurans, D. geothermalis, D. Murrayi, D. cellulosilyticus або D. deserti, переважно термофільна бактерія Deinococcus. Було показано, що бактерії Deinococcus мають здатність наново збирати свій геном, повністю або частково, коли він зруйнований стресом. Як відмічено вище, було запропоновано застосовувати вказані бактерії, зокрема, D. radiodurans, для біоремедіації. Здатність бактерій Deinococcus отримувати біоенергетичні продукти з біомаси розкрита в WO2009/063079, неопублікованої на дату пріоритету даної заявки. Тепер в даному винаході показано, що продуктивність стресостійких бактерій, таких як бактерії Deinococcus, можна поліпшити за допомогою перебудови метаболічних шляхів за допомогою рекомбінантних методів. Більш конкретно, даний винахід пропонує нові рекомбінантні стресостійкі бактерії, у яких перебудований шлях біосинтез етанолу. У зв'язку з цим автори даного винаходу розробили і створили нові біосинтетичні шляхи в стресостійких бактерійних штамах, які основані на зміні шляху перетворення пірувату. Більш конкретно, автори розробили нові рекомбінантні штами, в яких піруват ефективно використовується як субстрат для отримання етанолу. У зв'язку з цим автори ввели один або декілька ферментів (або відповідних генів), які викликають або каталізують перетворення пірувату в етанол. Автори також видалили ендогенний шлях, який використовує піруват, для того щоб отримати лактат, за допомогою цього збільшивши кількість пірувату, що бере участь в дорозі синтезу етанолу. Мета даного винаходу, таким чином, стосується (рекомбінантної або генетично модифікованої) стресостійкої бактерії, зокрема, бактерії Deinococcus, причому вказана бактерія містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту, яка кодує PDC. Термін "рекомбінантна бактерія" означає бактерію, яка містить модифікований геном в результаті або делеції і/або вставки гетерологічної (наприклад, відсутньої в природі у вказаної бактерії) послідовності або молекули нуклеїнової кислоти. "Рекомбінантна нуклеїнова кислота", отже, означає нуклеїнову кислоту, яка була сконструйована і не виявляється як така в бактеріях дикого типу. Інша мета даного винаходу стосується (рекомбінантної або генетично модифікованої) стресостійкої бактерії, зокрема, бактерії Deinococcus, причому вказана бактерія містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту, яка кодує ADH. У ще одному переважному варіанті здійснення даний винахід стосується (рекомбінантної або генетично модифікованої) стресостійкої бактерії, зокрема, бактерії Deinococcus, причому вказана бактерія містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту, яка кодує PDC і ADH. Інша мета даного винаходу стосується (рекомбінантної або генетично модифікованої) стресостійкої бактерії, зокрема, бактерії Deinococcus, причому вказана бактерія має модифікований геном, який містить інактивований ген лактатдегідрогенази (LDH). Найбільш переважною метою даного винаходу є (рекомбінантна або генетично модифікована) стресостійка бактерія, зокрема, бактерія Deinococcus, причому вказана бактерія має модифікований геном, який містить інактивований ген лактатдегідрогенази (LDH), і причому, крім того, вказана бактерія містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту, яка кодує PDC і/або ADH. Піруватдекарбоксилаза (PDC, EC: 4.1.1.1) каталізує моно-окислювальне декарбоксилування пірувату до ацетальдегіду і діоксиду вуглецю. Алкогольдегідрогеназа (ADH, EC: 1.1.1.1) каталізує перетворення ацетальдегіду в етанол. Для того щоб створити або поліпшити вказаний метаболічний шлях, молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує PDC і/або ADH, клонували і успішно ввели в стресостійку бактерію, зокрема, штаму Deinococcus. Термін нуклеїнова кислота означає переважно ДНК, хоч рекомбінантна нуклеїнова кислота може являти собою РНК. У залежності від ситуації молекула нуклеїнової кислоти може бути дво- або одноланцюжковою. 3 UA 104467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Більш конкретно, була отримана молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує функціональну PDC. Така молекула нуклеїнової кислоти може повністю або частково містити послідовність природного або синтетичного або мутантного гена PDC, при умові, що молекула нуклеїнової кислоти кодує білок, який каталізує моно-окислювальне декарбоксилування пірувату до ацетальдегіду і діоксиду вуглецю. PDC присутній в рослинах, грибах і дріжджах, але рідко зустрічається в бактеріях. У геномі D. radiodurans, який був повністю секвенований, не було знайдено явної PDC. Гени PDC були виявлені в різних штамах, як наприклад, в Zymomonas mobilis (Brau і Sahm, 1986; Conway et al, 1987a; Neale et al, 1987), в Acetobacter pasteurianus (Genbank: AF368435) (Chandra et al, 2001), в Sarcina ventriculi (Genbank: AF354297) (Lowe і Zeikus, 1992) і в Zymobacter palmae (Genbank: AF474145) (Raj et al, 2002). У переважному варіанті здійснення нуклеїнова кислота PDC містить повністю або частково послідовність бактерійного гена PDC. У певному варіанті здійснення нуклеїнова кислота містить послідовність гена PDC з Zymomonas mobilis (ZmPDC, ZMO 1360). Послідовність гена ZmPDC містить 1707 пар основ і подана на фіг. 4. Крім того, для того щоб створити ADH активність у стресостійких бактерій, таких як Deinococcus, отримали молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує функціональну ADH. Така молекула нуклеїнової кислоти може повністю або частково містити послідовність природного або синтетичного або мутантного гена ADH, при умові, що молекула нуклеїнової кислоти кодує білок, який каталізує перетворення ацетальдегіду в етанол. Гени ADH клонували з різних організмів, включаючи, без обмеження, Zymomonas mobilis (Ingram et al, 1987), Lactobacillus brevis (Liu et al, 2007) або Geobacillus stearothermophilus (Genbank: Z25544) (Talarico et al, 2005). Передбачуваний ген ADH (DR_2279) був також виявлений в геномі D. radiodurans. Проте, його експресія окремо, як представляється, не дозволяє здійснити ефективне отримання етанолу. У переважному варіанті здійснення нуклеїнова кислота ADH містить повністю або частково послідовність бактерійного гена ADH. У певному варіанті здійснення нуклеїнова кислота містить послідовність гена ADH з Zymomonas mobilis (ZmADH, ZMO 1596). ZmADH II містить 1152 пар основ, і його послідовність зображена на фіг. 4. Вказані нуклеїнові кислоти можуть додатково містити регуляторні послідовності або області, такі як, наприклад, промотор (наприклад, промотор tufB) і термінатор. Промотор може бути ендогенним для хазяя (наприклад, промотор з гена Deinoccocus для клонування рекомбінантної нуклеїнової кислоти за даним винаходом в штамі Deinococcus) або гетерологічним (наприклад, з іншого джерела, такого як інша бактерія, фаг, синтетичний або гібридний промотор і т. д.). Переважними промоторами є ендогенні. У зв'язку з цим були вивчені і застосовані для експресія генів промотори Deinococcus. Приклади таких промоторів включають PtufA і PtufB з генів tufA (DR0309) і tufB (DR2050) факторів елонгації трансляції Tu, промотор гена resU, що кодує передбачувану резольвазу, розташований в pI3, і область промотору PgroESL оперону groESL (Lecointe et al, 2004; Miema et al, 2001). Нуклеїнові кислоти можуть бути клоновані як окремі одиниці (наприклад, різні конструкції нуклеїнової кислоти), або в одній і тій же конструкції, під керуванням різних областей промотору або в опероні. Запропоновані в даній заявці приклади розкривають створення нових конструкцій, в яких генів ZmPDC і генів алкогольдегідрогенази II з Zymomonas mobilis (ZmADH) клонували в одній і тій же конструкції, або під керуванням окремих промоторів, або в опероні. Вказані конструкції успішно вводили в штами Deinococcus, що приводило до отримання етанолу з вказаних рекомбінантних штамів, в той час як немодифікований (батьківський) штам зовсім не виробляв етанол в досліджених умовах. Нуклеїнова(і) кислота(и) може бути вставлена в геном бактерії або вставлена як (автономно) репліковані молекули, наприклад, на плазміді, епісомі, штучній хромосомі і т. д. У типовому варіанті здійснення рекомбінантну нуклеїнову кислоту(и) клонують у відповідний вектор, який може реплікуватися в Deinococcus. Типові плазміди містять, в доповнення до клонованої вставки, ген відбору (наприклад, стійкість до антибіотика, барвник і т. д.) і точку початку реплікації, ефективну в Deinococcus або допускаючу інтеграцію в геном Deinococcus. Плазміда (або рекомбінантні нуклеїнові кислоти) може додатково містити регуляторні послідовності, такі як, наприклад, промотори, термінатори і/або енхансери. Приклади таких векторів включають pMD66, pI3, pRAD1 і pUE30. pMD66 являє собою великий вектор (27 т.н.) для D. radiodurans і Е. coli, що містить фрагмент pI3 розміром 12 pI3 був описаний Masters і Minton (1992). pRAD1 являє собою D. radiodurans-E. coli човникову плазміду, що містить мінімальний реплікон для D. radiodurans (Meima і Lidstrom, 2000). pUE30 являє 4 UA 104467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 собою ендогенну плазміду, яка походить зі штаму D. Radiopugnans, яка здатна реплікуватися в Deinococcus (дивіться US2003/0175977). Конкретною метою даного винаходу є плазмідна конструкція, причому вказана плазміда реплікується в стресостійкій бактерії, зокрема, бактерії Deinococcus, і містить нуклеїнову кислоту, яка кодує PDC і/або ADH. Кодуючі PDC і ADH нуклеїнові кислоти можуть розташовуватися в опероні або являти собою різні одиниці експресії в одній і тій же плазміді або в різних плазмідах. Переважні плазміди за даним винаходом кодують PDC і/або ADH з Zymomonas. Конкретними прикладами плазмід за даним винаходом є pI3-DR-P-PDC-ADH, pI3DR-P-PDCtag-ADHtag, pI3-P-PDC-P-ADH і pI3-DR-P-PDCtag-P-ADHtag. Рекомбінантну нуклеїнову кислоту можна також клонувати в інтегративній касеті, прийнятній для інтеграції в геном бактерії Deinococcus. Така интегративна касета містить, як правило, рекомбінантну нуклеїнову кислоту, пов'язану з (або фланковану) однією або декількома послідовностями, що допускають інтеграцію, переважно сайт-специфічну інтеграцію. Такі послідовності можуть являти собою, наприклад, послідовності нуклеїнових кислот, гомологічні цільовій області геному, що допускають інтеграцію за допомогою кроссинговера. У зв'язку з цим певна бактерія за даним винаходом містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту, яка кодує PDC і/або ADH, інтегровану в свій геном, замість всього або частини ендогенного гена, що кодує LDH. У цьому контексті термін "частина гена LDH" означає будь-яку частину гена, делеція якої достатня, для того щоб викликати інактивацію гена в клітині. Для того щоб вставити рекомбінантну(і) молекулу(и) нуклеїнової кислоти в стресостійкі бактерії, зокрема, Deinococcus, можна використати різні методи. Зокрема, їх можна вставити за допомогою природної трансформації (яка може бути додатково посилена в присутності хлориду кальцію) або електропорації. У зв'язку з цим даний винахід також стосується способу отримання рекомбінантної стресостійкої бактерії, зокрема, бактерії Deinococcus, визначеної вище, або її предка, що включає: - отримання (батьківської) стресостійкої бактерії, зокрема, бактерії Deinococcus; - введення у вказану бактерію молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує PDC і/або ADH, і - відбір бактерії, яка експресує вказану нуклеїнову кислоту. Рекомбінанти, в які відбулося введення нуклеїнових кислот, можуть бути відібрані відповідно до методів, відомими per se, такими як стійкість до антибіотиків. Експресію відповідних PDC або ADH можна перевірити за допомогою кількісної ПЛР, а отримання вказаних ферментів можна перевірити за допомогою вестерн-блотингу або за допомогою ферментних аналізів, відомими per se в рівні техніки. Активність PDC можна +, виміряти за допомогою аналізу відновлення NAD а активність ADH можна виміряти за + допомогою аналізу відновлення NAD або окислення NADH внаслідок активності вказаних ферментів (Conway et al, 1987a і b). Як розкрито в експериментальному розділі, були отримані бактерії Deinococcus, що містять рекомбінантну нуклеїнову кислоту, яка кодує PDC і ADH. Вказані бактерії можна культивувати, вони життєздатні і постійно містять рекомбінантну нуклеїнову кислоту. Стабільність рекомбінантів переважно така, що більше ніж 95 % трансформованих бактерій все ще містять вектор після 2 циклів росту. Результати демонструють, що геномна вставка PDC і ADH стабільна навіть після 2 циклів росту. Вказані бактерії виробляють етанол і з'єднують в собі багато переваг з точки зору субстратної специфічності, умов культивування і отримання метаболіту. Крім того, для того щоб додатково поліпшити отримання етанолу, також були отримані стресостійкі бактерії, зокрема, бактерії Deinococcus, в яких генів лактатдегідрогенази інактивований. Ген LDH (лактатдегідрогенази) бере участь в перетворенні пірувату в лактат. Ген LDH D. radiodurans клонували в 1996 році Narumi і Watanabe. Даний фермент являє собою тетрамер, і визначена його кристалографічна структура (Coquelle et al, 2007). Тепер автори створили нову бактерію, в якій вказаний фермент неактивний. У конкретному варіанті здійснення ген LDH видалений повністю або частково і не кодує функціональний білок. Ген LDH може бути інактивований у вказаній бактерії або її предку за допомогою гомологічної рекомбінації, заміщення гена або направленого мутагенезу або будь-якого іншого методу, відомого per se в рівні техніки. У переважному варіанті здійснення генів LDH інактивований за допомогою делеції щонайменше частини вказаного гена, яка може бути заміщена гетерологічною нуклеїновою кислотою (наприклад, селекційним маркером). 5 UA 104467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Ген LDH містить 915 пар основ. Він розташований між координатами 2362890 і 2363804 в геномі Deinococcus. Послідовність вказаного гена доступна, наприклад, як geneSeq1799712. У переважному варіанті здійснення бактерія за даним винаходом не має частини вказаного гена, переважно щонайменше 100 його послідовних нуклеотидів, більш переважно щонайменше 200, 300, 400 або 500. У прикладах був отриманий дефектний штам Deinococcus, який не має 589 послідовних нуклеотидів гена LDH. Вказаний штам був отриманий шляхом подвійного кроссинговера із застосуванням певної конструкції, що містить маркерний ген, фланкований двома областями, гомологічними частинам гена LDH і (необов'язково) частинам областей, які фланкують ген LDH (дивіться фіг. 3). Типові гомологічні області повинні мати достатню довжину, для того щоб зробити можливими гібридизацію і кроссинговер, наприклад, понад 200 нуклеотидів, переважно понад 300 нуклеотидів, як правило між 300 і 700. Такі конструкції являють собою конкретну мету даного винаходу (дивіться фіг. 1 і 2). У зв'язку з цим даний винахід також стосується способу отримання рекомбінантної стресостійкої бактерії, зокрема, бактерії Deinococcus, визначеної вище, або її предка, що включає: - отримання (батьківської) стресостійкої бактерії, зокрема, бактерії Deinococcus; - обробку бактерії з метою інактивації гена LDH і - відбір бактерії з інактивованим геном LDH. Бактерію за даним винаходом можна культивувати і/або зберігати в будь-якому відповідному культуральному середовищі і пристрої. Приклади такого середовища включають комплексне глюкозне середовище або середовище певного складу, як розкрито в прикладах, таке як, наприклад, середовище певного складу з сахарозою, середовище певного складу з крохмалем. Прийнятні середовища також комерційно доступні. Інша мета даного винаходу стосується застосування бактерії, визначеної вище, для отримання етанолу або інших метаболітів. Даний винахід також стосується способу отримання біопалива, зокрема, етанолу, що включає культивування бактерії, визначеної вище, в присутності відповідного субстрату і збір біопалива. Субстрат може являти собою будь-яке культуральне середовище, або різні типи біомаси, або продукти, які походять від них. Зокрема, біопаливо можна отримувати з відновлюваних ресурсів, особливо рослинної або тваринної біомаси, або з міських і промислових відходів. Термін біопаливо відповідно до даного винаходу включає "біопаливо першого покоління" і/або "біопаливо другого покоління". Біопалива першого покоління отримують з рослинного або тваринного органічного матеріалу, переважно з цукру, крохмалю, рослинної олії або тваринних жирів. Основним джерелом отримання біопалив першого покоління є їстівні рослини або їх частини. Біопалива першого покоління включають рослинну олію, біодизельне паливо, біоспирти, біогаз, синтез-газ і тверді біопалива. Біоспирти включають етанол, пропанол і бутанол. Біопалива другого покоління отримують переважно з неїстівних рослин або неїстівних частин рослин. Вони включають непродовольчі культури, відходи біомаси, стебла пшениці, кукурудзу і деревину. Більш переважно спосіб за даним винаходом застосовують для отримання етанолу. Спосіб за даним винаходом можна здійснювати в реакторі перетворення. Під "реактором" розуміється звичайний ферментаційний чан або будь-який апарат або система для перетворення біомаси, спеціально розроблений для того, щоб здійснювати винахід і, отже, що складається, зокрема, з біореакторів, біофільтрів, дискових біологічних контакторів і інших газових і/або рідкофазних біореакторів, особливо пристосованих для обробки біомаси або похідних біомаси. Апарат, який можна застосовувати відповідно до даного винаходу, можна застосовувати безперервно або із завантаженнями порціями. У реакторі, для того щоб здійснювати спосіб за даним винаходом, використовується щонайменше одна бактерія за даним винаходом, або її бактерійний екстракт, в той час як вказаний реактор розташовують і живлять, так щоб в ньому були встановлені і підтримувалися фізико-хімічні умови, так щоб вказана бактерія виявляла активність для застосування, що розглядається, і так щоб, необов'язково, в ньому було можливе і переважно активізоване бактерійне зростання. Вказаний спосіб можна здійснювати в умовах аеробіозу, анаеробіозу або в умовах мікроаеробіозу, в залежності від субстрату і бактерії. Перевага даного винаходу стосується здатності бактерій за даним винаходом бути стійкими по відношенню до стресових умов, включаючи присутність етанолу в культуральному середовищі. Спосіб за даним винаходом, таким чином, можна переважно здійснювати при температурі, яка дорівнює приблизно 40ºC або 6 UA 104467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 вище, зокрема, при температурі в діапазоні між 40ºC і 70ºC; в умовах кислого pH і/або в присутності етанолу. Інші аспекти і переваги даного винаходу будуть розкриті в наступних прикладах, які потрібно розглядати як ілюстративні і які не обмежують об'єм даної заявки. ПРИКЛАДИ Матеріали і методи Бактерійні штами і умови зростання Використовували штами Escherichia coli (Е. coli) SCS110, JM109 або DH5α, для того щоб розмножати плазміди. Їх культивували при 37ºC і 200 об./хв. в середовищі Лурія-Бертані (LB) (на літр: триптон 10 г, дріжджовий екстракт 5 г, хлорид натрію 10 г). Тверді середовища отримували шляхом додавання 1,5 % агару. Deinococcus radiodurans R1 (D. radiodurans) вирощували при 30ºC і 200 об./хв. в TGY або PGY. Середовище TGY має наступний склад, на літр: триптон (5 г), дріжджовий екстракт (1,5 г) і глюкоза (1 г). Склад твердих середовищ, на літр: триптон (5 г), дріжджовий екстракт (2,5 г), глюкоза (1 г) і агар (15 г). Середовище PGY має наступний склад, на літр: пептон (10 г), дріжджовий екстракт (5 г) і глюкоза (1 г). Склад твердих середовищ на літр: пептон (10 г), дріжджовий екстракт (5 г), глюкоза (1 г) і агар (15 г). Середовища LB або TGY доповнювали, при необхідності, відповідними антибіотиками (хлорамфеніколом в кінцевій концентрації 3 мкг/мл для трансформантів D. radiodurans і ампіциліном 100 мкг/мл для трансформантів Е. coli). Трансформація Трансформацію E. coli здійснювали за допомогою комерційних компетентних клітин SCS110 від Stratagene або JM109 від Promega. Для отримання компетентних клітин D. radiodurans свіжу культуру в стаціонарній фазі розбавляли в 100 разів в 50 мл TGY. Клітини вирощували до ранньої експонентної фази (OD600нм=0,3); осад ресуспендували у відповідному об'ємі охолодженої до нуля суміші 2×TGY/10 % об./об. гліцерину/30 мМ CaCl2. Для трансформації додавали необхідну кількість плазмідної ДНК до 100 мкл клітин. Суміш інкубували 30 хвилин на льоду до того, як пробірки переносили в 30ºC. Після 90 хвилин інкубування при 30ºC до клітин додавали 900 мкл заздалегідь нагрітої 2×TGY. Трансформанти струшували при 200 об./хв. і 30ºC протягом 20 годин. Їх послідовно розводили і наносили на відповідні планшети з неселективною або селективною TGY. Маніпуляція з ДНК LITMUS28i отримали від New England Biolabs. Плазмідні мініпрепарати з клітин Е. coli виготовили за допомогою набору WizardоPlus SV minipreps ДНК purification system від Promega, а мідіпрепарати виготовили за допомогою набору для очищення плазмідної ДНК NucleoBond® Xtra Midi Plus EF від Macherey-Nagel. Вказані препарати виготовили з 3-100 мл культури Е. coli в стаціонарній фазі. Для отримання плазмід з D. radiodurans 50 мл клітин в стаціонарній фазі ресуспендували в 0,5 M ЕДТА і бутанолі, насиченому 0,5 M ЕДТА. Після 15 хвилин інкубації при кімнатній температурі осад ресуспендували в 0,5 M ЕДТА і клітини залишали при 70ºC протягом 30 хвилин. Осад промивали двічі в лізоцимовому буфері (10 мМ тріс-HCl, 5 мМ ЕДТА, 0,5 M NaCl) перед додаванням лізоциму при 5 мг/мл (в лізоцимовому буфері). Зразок інкубували протягом 30 хвилин при 37ºC перед додаванням РНКази і протеїнази K. Суміш інкубували протягом 1 години при 56ºC. Потім додавали 200 мМ NaOH до зразка, який декілька разів перевертали, для того щоб перемісити; додавали 3 M ацетат калію до зразка, який перевертали, для того щоб перемісити; суміш інкубували протягом 10 хвилин на льоду перед тим як додали етанол до супернатанту; дану суміш інкубували протягом 10 хвилин на льоду і осад промивали 70 % етанолом. Висушений осад ДНК ресуспендували у воді. Екстракцію геномної ДНК з D. radiodurans здійснювали, використовуючи комерційний набір DNeasy® Blood and Tissue від Qiagen. Вказані препарати виготовили з 5 мл культур в стаціонарній фазі. Олігонуклеотиди синтезовані Eurogentec. Полімеразами, використаними для ПЛРампліфікації, були DyNAzyme EXT ДНК-полімераза від Finnzymes або Extensor Hi-Fidelity PCR Enzyme від Thermo Scientific. Фрагменти ПЛР очищали, використовуючи набір Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System від Promega. Для лігування ДНК застосовували T4 ДНК-лігазу (New England Biolabs). Плазмідну ДНК або продукти ПЛР розщеплювали за допомогою рестрикційних ферментів, отриманих від New England Biolabs. 7 UA 104467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Генетичний матеріал (продукти ПЛР або розщеплення) розділяли за допомогою агарозного гель-електрофорезу. Кількість ДНК визначали за допомогою біофотометра від Eppendorf. Вставки ДНК були синтезовані Genecust Europe і клоновані у відповідний вектор. Перевірка активності алкогольдегідрогенази 4 мл парарозаніліну (Sigma) при 2,5 мг/мл в абсолютному етанолі додавали до 200 мл LB агару, що містить 50 мг бісульфіту натрію (Conway et al, 1987b). Клітини D. radiodurans дводенного віку, вирощені в планшетах з агаром TGY (доповнених при необхідності відповідним антибіотиком), висівали на індикаторні планшети і інкубували при 37ºC протягом 2-3 годин. Отримання метаболітів Даний спосіб дозволяє оцінити здатність генетично модифікованих мікроорганізмів виробляти метаболіти, які представляють інтерес, з біомаси або похідних біомаси. Випробування проводять при 30ºC. З прекультур (в стаціонарній фазі), отриманих в комплексному середовищі з глюкозою, висівали 6 мл збагаченого середовища (посів при 1 % об./об.). Були протестовані збагачені культуральні середовища, такі як комплексне середовище з глюкозою, середовище певного складу з сахарозою, середовище певного складу з крохмалем. Комплексне середовище з глюкозою містить: пептон 2 г/л, дріжджовий екстракт 5 г/л і глюкозу 10 г/л в осмотичній воді: розчин стерилізований за допомогою автоклавування (15 хвилин при 120ºC). До даного розчину додані наступні розчини: буферний розчин MOPS (10×) pH 7 [кислота MOPS 400 мМ, NH4Cl 200 мМ, NaOH 100 мМ, KOH 100 мМ, CaCl2 5 мкМ, Na2SO4 2,76 мМ, MgCl2 5,28 мМ]; поживні мікроелементи (10000×) [(NH4)6(Mo7)24 300 мМ, H3BO3 4 мМ, CoCl2 0,3 мМ, CuSO4 0,1 мМ, MnCl2 2,5 мМ, ZnSO4 0,1 мМ]; FeCl3 (100×) 2 мМ в C6H5Na3O7 20 мМ; K2HPO4 1 г/л: розчини стерилізовані за допомогою фільтрації (0,2 мкм). Середовище певного складу містить: джерело вуглецю 10 г/л в осмотичній воді: розчин стерилізований за допомогою автоклавування (15 хвилин при 120ºC). До даного розчину додані наступні розчини: буферний розчин MOPS (10×) pH 7 [кислота MOPS 400 мМ, NH 4Cl 200 мМ, NaOH 100 мМ, KOH 100 мМ, CaCl2 5 мкМ, Na2SO4 2,76 мМ, MgCl2 5,28 мМ]; поживні мікроелементи (10000×) [(NH4)6(Mo7)24 300 мМ, H3BO3 4 мМ, CoCl2 0,3 мМ, CuSO4 0,1 мМ, MnCl2 2,5 мМ, ZnSO4 0,1 мМ]; FeCl3 (100×) 2 мМ в C6H5Na3O7 20 мМ; K2HPO4 1 г/л: розчини стерилізовані за допомогою фільтрації (0,2 мкм). До вказаних культуральних середовищ, за винятком призначених для штамів дикого типу, додавали перед посівом хлорамфенікол: 3 мкг/мл культурального середовища. З культурами працювали як в умовах аеробіозу, так і анаеробіозу (Biomerieux, Genbag). Культури в умовах аеробіозу залишали в інкубаторі при 30ºC при струшуванні протягом 7 днів. Потім культури центрифугували протягом 10 хвилин при 4000 об./хв. Супернатанти фільтрували (0,2 мкм), переливали в інші пробірки і залишали при -80ºC. Культури в умовах анаеробіозу залишали в інкубаторі при 30ºC протягом 4 тижнів. Потім культури центрифугували протягом 10 хвилин при 4000 об./хв.. Супернатанти фільтрували (0,2 мкм), переливали в інші пробірки і залишали при -80ºC. Для кількісного визначення спиртів застосовували аналіз за допомогою газової хроматографії з ПІД (колонка Varian CP-WAX 57 CB 25 м×0,32 мм). Кількість органічних кислот визначали за допомогою капілярного електрофорезу (5 мМ 2,6-піридиндикарбонова кислота 0,5 мМ цетилтриметиламонійбромід; буфери з 5,6 pH/капіляр Agilent довжиною 61 см, діаметром 50 мкм). Кількість залишкової глюкози визначали за допомогою ВЕРХ, з'єднаної з рефрактометрією (колонка Phenomenex LUNA 3 мкм NH2 100 А 150×4,6 мм, рухома фаза ацетонітрил/H2O 85:15). Приклад 1 Делеція L-лактатдегідрогенази (LDH) у Deinococcus radiodurans R1 LDH-мутанти Deinococcus radiodurans R1 (D. radiodurans) дикого типу отримували таким чином. a. Конструкція для делеції LDH (pDR-LDHdel) Автори створили нову конструкцію, названу pDR-LDHdel, для часткової делеції гена LDH (DR_2364) в D. radiodurans дикого типу (дивіться фіг. 1). Для цього автори використали основу LITMUS28i, реплікативну в Е. coli, але не в D. radiodurans. Синтезовану вставку ДНК клонували R в LITMUS28i; вказану вставку виготували з касети стійкості до хлорамфеніколу (Cam ) (1344 нуклеотиди) і з 5'- і 3'-фланкуючих гомологічних областей (537 нуклеотидів і 615 нуклеотидів), розташованих відповідно вище і нижче по ходу транскрипції відносно вказаної касети (фіг. 2). Конструкцію pDR-LDHdel створили так, щоб замінити 589 нуклеотидів гена LDH (причому деякі з R 589 нуклеотидів кодують залишки, що беруть участь в каталізі) касетою Cam . b. Створення мутантів, позбавлених LDH 8 UA 104467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 D. radiodurans дикого типу трансформували за допомогою pDR-LDHdel, слідуючи способу, описаному в розділі "Матеріали і методи", для того щоб створити нокаутні мутанти. Трансформанти відбирали на середовищі TGY, доповненому хлорамфеніколом. Заміщення частини гена LDH касетою стійкості до хлорамфеніколу (фіг. 3) контролювали за допомогою ПЛР, застосовуючи відпал відповідних праймерів на хлорамфенікольній касеті. Для аналізу метаболітів відібрали два клони, отриманих інтеграцією за допомогою подвійного кроссинговера, з назвами 03-04/8-1 і 03-04/11-2 (таблиця 1). Після гомологічної рекомбінації отримана бактерія містить делецію 589 нуклеотидів, які R заміщені касетою Cam . Геномні області 03-04/8-1 і 03-04/11-2, в яких частина гена LDH R заміщена касетою Cam , були частково секвеновані. Приклад 2 Отримання піруватдекарбоксилази і алкогольдегідрогенази в D. radiodurans Штами D. radiodurans, які продукують піруватдекарбоксилазу (ZmPDC) і алкогольдегідрогеназу (ZmADH), з Zymomonas mobilis отримували таким чином. a. Створення конструкцій, які несуть гени для отримання етанолу Для того щоб отримувати етанол в клітинах D. radiodurans, було створено чотири конструкції (дивіться фіг. 2). Для першої конструкції, яка називається pI3-DR-P-PDC-ADH, ген піруватдекарбоксилази (ZmPDC, ZMO1360) і ген алкогольдегідрогенази II (ZmADH, ZMO1596) з Zymomonas mobilis subsp. Mobilis ZM4 (фіг. 4) вміщували в оперон і клонували в BamHI і SalI реплікативною в D. radiodurans плазміди pI3 (Masters and Minton, 1992) (дивіться фіг. 5). Вектор pI3 додає D. radiodurans стійкості до хлорамфеніколу. Область з 432 пар основ, яка розташована вище відносно стартового кодона трансляції фактора елонгації TU tufA (DR_0309) і містить активність промотору (Lecointe et al, 2004), поміщали до оперона ZmPDC-ADH. Між генами ZmPDC і ZmADH присутній спейсер з послідовністю зв'язування рибосом (RBS) з оперона groESL D. radiodurans (Meima et al, 2001), поміщеної перед ініціюючим кодоном трансляції ZmADH. Термінатор транскрипції D. radiodurans Term116 (Lecointe et al, 2004) вміщували вище відносно гена ZmADH. Була створена друга конструкція, яка походить від pI3-DR-P-PDC-ADH, і названа pI3-DR-P-PDCtag-ADHtag. У даній конструкції his-мітку (6 гістидинів) поміщали в С-кінець ZmPDC і c-myc-мітку (EQKLISEEDL) поміщали в С-кінець ZmADH (фіг. 5). Для конструкції pI3-DR-P-PDC-P-ADH область, що містить передбачуваний термінатор транскрипції, який називається Term85, вміщували вище по ходу транскрипції відносно гена ZmPDC, і 234 нуклеотиди, розташованих нижче по ходу транскрипції відносно стартового кодона трансляції фактора елонгації TU tufB (DR_2050) (який відповідає області промотору tufB, Lecointe et al, 2004), вміщували між Term85 і геном ZmADH (фіг. 5). Остання конструкція є похідною від pI3-P-PDC-P-ADH і називається pI3-DR-P-PDCtag-P-ADHtag; в даному векторі hisмітку (6 гістидинів) вміщували в С-кінець гена ZmPDC і c-myc-мітку (EQKLISEEDL) вміщували в С-кінець гена ZmADH (фіг. 5). b. Створення штамів D. radiodurans, які продукують ZmPDC і ZmADH Компетентні клітини D. radiodurans трансформували за допомогою різних конструкцій, які несуть гени ZmPDC і ZmADH. Трансформанти відбирали на основі стійкості до хлорамфеніколу. Наявність плазміди контролювали за допомогою ПЛР-ампліфікації зі специфічними праймерами або ферментативного розщеплення конструкцій, екстрагованих з клонів D. radiodurans. Для кожної з 4 конструкцій два клони використовували для метаболічного дослідження (таблиця 1). Приклад 3 Створення інтергативних LDH-мутантів Deinococcus radiodurans, які продукують ZmPDC і ZmADH 589 нуклеотидів гена LDH (DR_2364) D. radiodurans дикого типу замінювали касетою стійкості до хлорамфеніколу з наступними генами ZmPDC і ZmADH відповідно під керуванням промоторів PtufA і PtufB. Для того щоб створити даний PDC+ADH+LDH-мутант, ампліфікували за допомогою ПЛР 3 наступні нуклеотидні послідовності: - 5'-фланкуючу гомологічну область, за якою йде касета стійкості до хлорамфеніколу, ампліфікували з праймерами EG31F і EG32R (дивіться список нижче), використовуючи pDRLDHdel як матрицю, - послідовність P-PDC-P-ADH ампліфікували з праймерами EG33F і EG34R (дивіться список нижче), використовуючи pI3-P-PDC-P-ADH як матрицю, - 3'-фланкуючу гомологічну область ампліфікували з праймерами EG35F і EG36R (дивіться список нижче), використовуючи pDR-LDHdel як матрицю. Список праймерів: 9 UA 104467 C2 EG31F EG32R EG33F EG34R EG35F EG36R 5 10 15 20 25 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10 5'- TTCCCCGCCTGGGTATCACGTC-3' 5'- CTCGGATCCTTCACAGTTCTCCGCCCCCTCC-3' 5'- GAGGGATCCGTCGGGTGTCGAGCATCGTGATC-3' 5'- CCTCCTGCAGTTGTTTTTGCAATAAACAAAAACAAAAAAACCCCC-3' 5'- GAGACTGCAGTGGAACGAGCAGGTGCGCGCC-3' 5'- ACGCGTGAGCAAAGGGCGGCG-3' Продукт лігування вказаних 3 ампліконів використовували для трансформації D. radiodurans, для того щоб отримати мутант PDC+ADH+LDH- (фіг. 8). Трансформанти відбирали на основі стійкості до хлорамфеніколу. Часткову делецію гена LDH, геномну вставку хлорамфеніколстійкого гена і генів ZmPDC і ZmADH контролювали за допомогою ПЛР, використовуючи відповідні праймери. Два клони, отримані інтеграцією за допомогою подвійного кроссинговера, з назвами 18-06/1-1 і 18-06/1-3 відібрали для аналізу метаболітів (таблиці 1 і 4). Приклад 4 Рекомбінанти Deinococcus radiodurans R1: активність алкогольдегідрогенази Автори визначили виробництво альдегіду і активність ADH за допомогою колориметричного аналізу відповідно до Conway і співробітників (1987b) в різних рекомбінантах, трансформованих плазмідами з генами ZmPDC і ZmADH. Даний аналіз оснований на утворенні фіолетової основи Шиффа, що утворюється після взаємодії ацетальдегіду, що виробляється ADH з етанолу, і лейкобарвника. Як показано на фіг. 6, рекомбінанти за даним винаходом забарвлюються в фіолетовий після 2-3 годин інкубації при 37ºC на планшетах з LB агаром, доповнених етанолом, парарозаніліном і бісульфітом натрію. Дане фарбування вказує на ADH активність в кожному клоні рекомбінантів, трансформованих плазмідою pI3-DR-P-PDC-P-ADH або pI3-DR-P-PDCtagP-ADHtag. У вказаних рекомбинантах транскрипцію гена ZmADH контролювали за допомогою промотору tufB. Приклад 5 Рекомбінанти Deinococcus radiodurans R1: отримання метаболітів Аналізували метаболіти, отримані за допомогою рекомбінантів за даним винаходом. Автори могли детектувати зміну в метаболітах, які продукуються рекомбінантами за даним винаходом (наприклад, клонами 24-03/4-2, 03-04/4-1, 03-04/4-2), в порівнянні з дикого типу або контрольним рекомбінантом, трансформованим контрольною векторною основою pI3 (дивіться таблиці 2-5). Зокрема, було детектоване отримання етанолу в різних умовах культивування, в той час як батьківський штам не продукує етанол. Таблиця 1 Назва рекомбінантів Реплікативна або інтегративна конструкція Трансформований штам D. radiodurans R1 Немає конструкції D. radiodurans R1 pDR-LDHdel D. radiodurans R1 pI3 D. radiodurans R1 pI3-DR-P-PDCtag-ADHtag D. radiodurans R1 pI3-DR-P-PDC-ADH D. radiodurans R1 pI3-DR-P-PDCtag-P-ADHtag D. radiodurans R1 pI3-DR-P-PDC-P-ADH D. radiodurans R1 Продукти ПЛР 30 10 Назва клонів 24-03/1-2 03-04/1-1 20-04/1-2 03-04/8-1 03-04/11-2 24-03/2-2 03-04/2-1 20-04/3-1 24-03/4-2 24-03/5-2 20-04/4-3 20-04/5-4 03-04/5-1 03-04/6-1 03-04/4-1 03-04/4-2 18-06/1-1 18-06/1-3 UA 104467 C2 Таблиця 2 Рекомбінанти Deinococcus radiodurans R1: отримання метаболітів в комплексному середовищі з глюкозою ("CM") при культивуванні в умовах аеробіозу Штам Клон Виробництво кислоти (г/л) Сукцинат Drad R1 дикого типу Drad R1 pI3 Drad R1 pI3 DR-P-PDCtagADHtag Drad R1 дикого типу Drad R1 pI3 Drad R1 pI3 DR-P-PDC-P-ADH Drad R1 pI3 DR-P-PDC-P-ADH Drad R1 pI3 DR-P-PDCtag-PADHtag Drad R1 pI3 DR-P-PDCtag-PADHtag Drad R1 pDR-LDHdel Drad R1 pDR-LDHdel Ацетат Лактат Етанол (%)* 24-03/1-2 24-03/2-2 0,43 0,43 0,21 0,23 0 0 0 0 Витрата глюкози (г/л) 0 0,6 24-03/4-2 0,31 0,17 0 0,005 1,2 03-04/1-1 03-04/2-1 03-04/4-1 03-04/4-2 0,42 0,37 0,25 0,27 0,2 0,2 0,14 0,14 0 0 0 0,02 0 0 0,016 0,016 0 0,9 0,2 0,2 03-04/5-1 0,29 0,11 0 0,006 0,4 03-04/6-1 0,33 0,14 0 0,006 0,3 0,28 0,33 0,18 0,39 0 0 0 0 0,4 0 * % етанолу означає г етанолу на г культурального середовища (тобто звичайно 1 % етанолу = 1 г етанолу/100 г середовища = 10 г етанолу/л). Для кожного клону з культурами працювали в трьох повторах. Таблиця 3 Рекомбінанти Deinococcus radiodurans R1: отримання метаболітів в комплексному середовищі з глюкозою ("CM") при культивуванні в умовах аеробіозу Виробництво кислоти (г/л) Сукцинат Drad R1 дикого типа Drad R1 pI3 (пуста плазміда) Drad R1 pI3 DR-P-PDC-ADH Drad R1 pI3 DR-P-PDC-ADH 5 Ацетат Лактат Етанол (%)* 0,66 0,53 0,46 0,49 0,64 0,41 0,51 0,5 0 0 0 0 0 0 0,005 0,006 Витрата глюкози (г/л) 3,13 1,77 1,8 1,85 Для кожного клону з культурами працювали в трьох повторах. Таблиця 4 Інтегративні рекомбінанти Deinococcus radiodurans R1: отримання метаболітів в комплексному середовищі з глюкозою ("CM") при культивуванні в умовах аеробіозу Виробництво кислоти (г/л) Сукцинат Drad R1 дикого типа R Drad R1 Cam PDC+ADH+LDHR Drad R1 Cam PDC+ADH+LDH Ацетат Лактат Етанол (%)* 0,44 0,46 0,4 0,53 0,55 0,4 0,32 0 0 0 0,026 0,026 11 Витрата глюкози (г/л) 0,55 0,6 1,08 UA 104467 C2 Для кожного клону з культурами працювали в трьох повторах. Таблиця 5 Рекомбінанти Deinococcus radiodurans R1: отримання метаболітів в середовищі певного складу з сахарозою ("DM") при культивуванні в умовах аеробіозу Виробництво кислоти (г/л) Сукцинат Drad R1 дикого типа Drad R1 pI3 Drad R1 pI3 DR-P-PDC-ADH Drad R1 pI3 DR-P-PDC-ADH Drad R1 pI3 DR-P-PDCtag-P-ADHtag Drad R1 pI3 DR-P-PDCtag-P-ADHtag 5 10 15 20 25 30 35 40 Ацетат Лактат Етанол (%)* 0,02 0,02 0 0,02 0,01 0 0,11 0,11 0 0,13 0,17 0,05 0,03 0,03 0 0 0,07 0 0,04 0,04 0 0 0 0 Витрата глюкози (г/л) 0 0 0,009 0,012 0,007 0,007 Вказані результати, таким чином, демонструють, що продукцію етанолу можна індукувати або посилити в стресостійких бактеріях за допомогою інженерії нових метаболічних шляхів. Результати, крім того, показують, що LDH-дефектні штами є життєздатними, і що інактивація даного гена ще більш посилює продукцію етанолу в бактеріях за даним винаходом. Також результати показують, що штами можуть використовувати різні типи субстратів і рости на різних типах культуральних середовищ, для того щоб виробляти етанол. Рекомбінантні штами за даним винаходом, таким чином, обз'єднують в собі переваги стресостійкости, умов культивування, прийняття субстрату і виробництва метаболітів. Джерела інформації: Anderson AW, Nordon HC, Cain RF, Parrish G, Duggan D (1956) Studies on а radio-resistant micrococcus. I. Isolation, morphology, cultural characteristics, and resistance to gamma radiation. Food Technol. 10, 575-578 Brau В and Sahm Н (1986) Cloning and expression of the structural gene for pyruvate decarboxylase of Zymomonas mobilis in Escherichia coli. Arch Microbiol. 144, 296-301 Chandra Raj K, Ingram LO, Maupin-Furlow JA. (2001) Pyruvate decarboxylase: а key enzyme for the oxidative metabolism of lactic acid by Acetobacter pasteurianus. Arch Microbiol. 176,443-451 Conway Т, Osman YA, Konnan JI, Hoffmann EM, Ingram LO (1987a) Promoter and nucleotide sequences of the Zymomonas mobilis pyruvate decarboxylase. J Bacteriol 169, 949-954 Conway Т, Sewell GW, Osman YA, Ingram LO (1987b) Cloning and sequencing of the alcohol dehydrogenase II gene from Zymomonas mobilis. J Bacteriol. 169, 2591-2597 Coquelle N, Fioravanti Е, Weik M, Vellieux F, Madern D (2007) Activity, stability and structural studies of lactate dehydrogenases adapted to extreme thermal environments. J Mol Biol 374, 547-562 Daly MJ, Ouyang L, Fuchs Р, Minton KW (1994) In vivo damage and recA-dependent repair of plasmid and chromosomal DNA in the radiation-resistant bacterium Deinococcus radiodurans. J Bacteriol. 176, 3508-3517 Ingram LO, Conway Т, Clark DP, Sewell GW, Preston JF (1987) Genetic engineering of ethanol production in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 53, 2420-2425 Lecointe F, Coste G, Sommer S, Bailone А (2004) Vectors for regulated gene expression in the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans. Gene 336,25-35 Liu S, Dien BS, Nichols NN, Bischoff KM, Hughes SR, Cotta MA. (2007) Coexpression of pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase genes in Lactobacillus brevis. FEMS Microbiol Lett.274, 291-297 Lowe SE and Zeikus JG (1992) Purification and characterization of pyruvate decarboxylase from Sarcina ventriculi. J Gen Microbiol. 138, 803-807 Masters CI and Minton KW (1992) Promoter probe and shuttle plasmids for Deinococcus radiodurans. Plasmid 28, 258-261Meima R and Lidstrom ME (2000) Characterization of the minimal replicon of а cryptic Deinococcus radiodurans SARK plasmid and development of versatile Escherichia coli-D. radiodurans shuttle vectors. Appl Environ Microbiol. 66, 3856-3867 Meima R, Rothfuss HM, Gewin L, Lidstrom ME (2001) Promoter cloning in the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans. J Bacteriol.183, 3169-3175 12 UA 104467 C2 5 Narumi I and Watanabe Н (1996) Sequence analysis of the L-lactate dehydrogenase-encoding gene of Deinococcus radiodurans, а suitable mesophilic counterpart for Thermus. Gene 172, 117-119 Neale AD, Scopes RK, Wettenhall RE, Hoogenraad NJ. (1987) Nucleotide sequence of the pyruvate decarboxylase gene from Zymomonas mobilis. Nucleic Acids Res. 15, 1753-1761 Raj KC, Talarico LA, Ingram LO, Maupin-Furlow JA. (2002) Cloning and characterization of the Zymobacter palmae pyruvate decarboxylase gene (pdc) and comparison to bacterial homologues. Appl Environ Microbiol. 68, 2869-2876 Talarico LA, Gil MA, Yomano LP, Ingram LO, Maupin-Furlow JA. (2005) Construction and expression of an ethanol production operon in Gram-positive bacteria. Microbiol. 151, 4023-4031. 10 13 UA 104467 C2 14 UA 104467 C2 15 UA 104467 C2 16 UA 104467 C2 17 UA 104467 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 35 1. Рекомбінантна бактерія Deinococcus, причому вказана бактерія містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту, яка кодує як піруватдекарбоксилазу (PDC), так і алкогольдегідрогеназу (ADH), в якій нуклеїнові кислоти PDC і ADH розміщені в опероні в одній і тій же конструкції під контролем єдиного промотору, і в якій вказана молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти інтегрована в геном бактерії. 2. Бактерія за п. 1, в якій нуклеїнові кислоти PDC і ADH отримані з Zymomonas. 3. Бактерія за п. 1 або 2, де вказана бактерія має модифікований геном, який містить інактивований ген лактатдегідрогенази (LDH). 4. Бактерія за п. 3, в якій ген LDH видалений, повністю або частково, і не кодує функціональний білок. 5. Бактерія за п. 3 або 4, в якій ген LDH інактивований у вказаній бактерії або її предку за допомогою гомологічної рекомбінації, заміщення гена або направленого мутагенезу. 6. Бактерія за будь-яким з попередніх пунктів, де в геномі вказаної бактерії відсутні щонайменше 589 послідовних нуклеотидів гена LDH. 7. Бактерія за будь-яким з попередніх пунктів, яка вибрана з D. radiodurans, D. geothermalis, D. murrayi, D. cellulosilyticus або D. deserti, більш переважно термофільної бактерії Deinococcus. 8. Спосіб одержання біопалива, зокрема етанолу, що включає культивування бактерії за будьяким з пп. 1-7 в присутності прийнятного субстрату і збір біопалива. 9. Спосіб за п. 8, в якому культивування здійснюють при температурі приблизно 40 °С або вище, в умовах кислого рН і/або в присутності етанолу. 10. Застосування бактерії за будь-яким з пп. 1-7 для отримання етанолу, переважно при температурі приблизно 40 °С або вище, або в умовах культивування при кислому рН. 11. Спосіб одержання рекомбінантної бактерії за будь-яким з пп. 1-7, що включає: - одержання бактерії Deinococcus; - введення молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує PDC і ADH, у вказану відібрану бактерію, в якій послідовності, що кодують PDC і ADH, розміщені в опероні в одній і тій же молекулі рекомбінантної нуклеїнової кислоти, і в якій вказана молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти інтегрована в геном бактерії; - необов'язково додаткову обробку бактерії з метою інактивації гена LDH і відбір бактерії з інактивованим геном LDH. 12. Плазмідна конструкція, причому вказана плазміда реплікується в бактерії Deinococcus і вибрана з pI3-DR-P-PDC-ADH, pI3-P-PDC-P-ADH і pI3-DR-P-PDCtag-P-ADHtag. 18 UA 104467 C2 19 UA 104467 C2 20 UA 104467 C2 21 UA 104467 C2 22 UA 104467 C2 23 UA 104467 C2 24 UA 104467 C2 25 UA 104467 C2 Комп’ютерна верстка С. Чулій Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 26