Спосіб одержання етанолу з ксилози

Реферат: Винахід належить до способу одержання паливного етанолу з поновлювальної рослинної сировини за допомогою рекомбінантних штамів дріжджів Hansenula polymorpha, в яких поліпшена алкогольна ферментація ксилози шляхом заміни нативних промоторів генів DAS1 та UA 104365 C2 (12) UA 104365 C2 TAL2, на сильний дегідрогенази). конститутивний промотор гена GAPDII (гліцеральдегід-3-фосфат UA 104365 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузі біотехнології і є способом отримання паливного етанолу з ксилози, другого за кількістю цукру у складі лігноцелюлози, за допомогою рекомбінантних штамів дріжджів Hansenula polymorpha. Алкогольна ферментація (спиртове бродіння) є промислово важливим біотехнологічним процесом, що здійснюється дріжджами. Одержання паливного етанолу з лігноцелюлози має важливе значення для розвитку вітчизняної і світової енергетики та охорони і збереження довкілля внаслідок зменшення парникового ефекту, що викликається спалюванням палива, отримуваного з поновлюваної рослинної сировини. Однією з причин нерентабельності виробництва етанолу з лігноцелюлози є низький вихід етанолу внаслідок неефективної мікробної ферментації цукрів-пентоз, головним чином, ксилози. Перспективним для створення активних ферментаторів рослинної сировини є застосування метаболічної інженерії, що базується па використанні методів генетичного клонування для маніпуляції існуючими метаболічними шляхами та конструювання нових або модифікації існуючих шляхів метаболізму. Такі підходи є важливими для оптимізації метаболізму і ферментації ксилози, вміст якої в лігноцелюлозі становить до 30 % від загального вмісту цукрів [1]. Роботи, спрямовані на конструювання мікроорганізмів, здатних ефективно зброджувати цукри лігноцелюлози до етанолу, зосереджені, в основному, на декількох видах: бактеріях Escherichia coli та Zymomonas mobilis, а також на дріжджах Saccharomyces cerevisiae [2] та Pichia stipitis [3]. Однак, існує низка видів неконвенційних дріжджів, серед яких особливе місце займає вид Hansenula polymorpha, які можуть бути перспективними для створення на їх основі активних алкогольних ферментаторів цукрів лігноцелюлози. H. polymorpha є термотолерантним видом, що ферментує ксилозу до етанолу при високій температурі (48-50° С) [4]. Це є важливим для розробки технології одночасної сахарифікації і ферментації (SSF-технологія), яка на сьогодні вважається найефективнішою для конверсії лігноцелюлози до етанолу. Однак практичне використання рекомбінантних штамів дріжджів H. polymorpha для отримання паливного етанолу гальмується у зв'язку з відсутністю високопродуктивних штамів. Відомі способи підвищення ефективності перетворення ксилози до етанолу за рахунок використання рекомбінантних штамів дріжджів H. polymorpha з посиленою експресією гена бактерійної ксилозоізомерази, модифікованої форми ксилозоредуктази, ксилітолдегідрогенази, ксилулокінази та піруватдекарбоксилази [5, 6, 7]. Найбільш близьким до запропонованого є спосіб отримання етанолу за допомогою рекомбінантних штамів дріжджів H. polymorpha з посиленою експресією ферментів, залучених па перших етапах катаболізму ксилози [8]. Однак ефективність ферментації ксилози до етилового спирту цих рекомбінантних штамів дріжджів H. polymorpha є недостатньою для економічно вигідного виробництва паливного етанолу з лігноцелюлози і необхідним є подальше суттєве покращення основних параметрів процесу (вихід етанолу та продуктивність ферментації). В основу винаходу поставлена задача покращити вихід етанолу з ксилози за допомогою сконструйованих рекомбінантних штамів дріжджів H. polymorpha з підвищеною експресією пероксисомних ферментів. Поставлена задача вирішується тим, що у способі одержання етанолу з ксилози за допомогою дріжджів H. polymorpha, згідно з винаходом, ферментація ксилози здійснюється рекомбінантними штамами H. polymorpha, в геном яких вводять додаткові копії генів дигідроксіацетонсинтази (DAS1) та трансальдолази (TAL2) під контролем сильного конститутивного промотору гена GAPDH (гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогенази), що забезпечує більш ефективне перетворення цукру до етанолу. Метилотрофні дріжджі H. polymorpha містять унікальний пероксисомний фермент дигідроксіацетонсинтазу (кодується геном DASI), який каталізує перенесення на формальдегід 2-вуглецевого залишку з ксилозо-5-фосфату з утворенням гліцеральдегід-3-фосфату (інтермедіат гліколізу) та дигідроксіацетону, який після фосфорилювання дигідроксіацетонкіназою також перетворюється до інтермедіату гліколізу. Головним ферментом неокислювальної лапки пентозофосфатного шляху, який каталізує утворення седогептулозо-7фосфату та гліцеральдегід-3-фосфату з фруктозо-6-фосфату і еритрозо-4-фосфату, є пероксисомна трансальдолаза (кодується геном TAL2). Суть винаходу полягає у введенні в геном дріжджів фрагментів ДНК, які несуть генетичну інформацію про синтез пероксисомних ферментів дигідроксіацетонсинтази та трансальдолази під контролем сильного конститутивного промотору, що забезпечує високий рівень експресії генів DAS1 та TAL2 і більш ефективну конверсію ксилози до етанолу. У запропонованому способі використовуються методи: полімеразна ланцюгова реакція (ПЛP), конструювання рекомбінантних плазмід, виділення плазмід з Escherichia coli, рестрикційний аналіз, електрофорез в агарозному гелі, трансформація Е. coli методом 1 UA 104365 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 електропорації, описані в [9]. Трансформацію //. polymorpha проводять, як описано в |10|. Виділення сумарної ДНК з трансформантів II. polymorpha проводиться як для S. cerevisiae [9]. Спосіб одержання етанолу з ксилози за допомогою рекомбінантних штамів дріжджів / H. polymorpha з поліпшеною алкогольною ферментацією ілюструється графічними матеріалами: На Фіг. 1 зображено лінійні схеми плазмід a) pDAS1, б) pTAL2, в) pDAS1-TAL2, де промотор гена GAPDH позначено чорною смугою; фрагменти ДНК H. polymorpha, що несуть ВРТ генів DAS1 та TAL2 позначені чорно-білими вертикальними смужками та клітинками відповідно, ген стійкості до генетицину білий відрізок; ген LEU2 H. polymorpha - сіра смуга; послідовність pGLG61 топка чорна лінія. Скорочення сайтів рестрикції: В, ВатНІ; В1, Bglll; K, Kpnl; SI, Sail; II, Hindlll. На Фіг. 2 зображено ріст рекомбінантних штамів, що містять плазміди pDAS1, pTAL2 та pDAS1-TAL2, на мінімальному середовищі YNB з глюкозою та ксилозою, а також на багатому середовищі YPD з додаванням генетицину (G418) в концентрації 0, 3 г/л та 0,5 г/л порівняно з реципієнтним штамом H. polymorpha NCYC495 Ieul-1. На Фіг. 3. зображено питому активність ферментів дигідроксіацетонсинтази (DHAS) та трансальдолази (TAL) отриманих рекомбінантних штамів у порівнянні з штамом дикого типу (WT). На Фіг. 4. зображено кількість утвореного етанолу під час алкогольної ферментації ксилози рекомбінантними штамами з посиленою експресією генів TAL2 (А) та DASI (Б) у порівнянні з штамом дикого типу (WT). Ферментацію проводили протягом 5 днів при температурі 37 °C в умовах обмеженої аерації (140 об/хв). На Фіг. 5. зображено кількість утвореного етанолу під час алкогольної ферментації ксилози отриманими трансформантами з посиленою експресією гена DAS1 у порівнянні з вихідним штамом 2 EtOH XYLlm XYL2. Ферментацію проводили протягом 5 днів при температурі 37 °C та 45 °C в умовах обмеженої аерації (140 об/хв). Спосіб одержання етанолу з ксилози за допомогою рекомбінантних штамів дріжджів H. polymorpha з поліпшеною алкогольною ферментацією здійснюють кількома етапами: Етап 1. Конструювання плазмід для посиленої експресії генів DAS1 та TAL2, що кодують пероксисомні ферменти дигідроксіацетонсинтазу та трансальдолазу. За допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛP) з геномної ДНК H. polymorpha отримують гени DAS1 та TAL2. Нативні промотори даних генів замінюють сильним конститутивним промотором гена гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (HpGAP). На першому етапі HpGAP промотор та відкриту рамку трансляції (ВРТ) гена DAS1 з нативним термінатором ампліфікують з геномної ДНК H. polymorpha за допомогою ПЛР, використовуючи відповідні пари праймерів Ко277/Ко278 та Ко279/Ко280 (Табл.). Отримані фрагменти з'єднують за допомогою overlap-1 ПЛP з використанням пари праймерів Ко277 та Ко280. Ампліфікований фрагмент, розміром 2,9 т.п.н., обробляють ендонуклеазою рестрикції ВаmHI (сайт впізнавання відповідної рестриктази підкреслено в послідовності нуклеотидів праймерів) і клонують у BamHI-лінеаризований дріжджовий вектор pGLG61. Цей вектор як селективний маркер містить ген стійкості до антибіотика генетицину (G418). Дану конструкцію вводять в штам Е. соlі DH5ά методом електропорації. У результаті генетичних маніпуляцій отримують рекомбінантну плазміду pDAS 1 (Фіг. 1). 2 UA 104365 C2 Таблиця Перелік праймерів, які використовують на 1 етапі способу Назва Послідовність нуклеотидів 5'-3' праймера 5 10 15 20 25 30 35 40 Для конструювання плазміди pTAL2 промотор HpGAP та ВРТ гена TAL2 з нативним термінатором ампліфікують з геномної ДНК H. polymorpha за допомогою ПЛР, використовуючи відповідні пари праймерів Ко405/Ко411 та Ко412/Ко414. Ампліфіковані фрагменти з'єднують за допомогою overlap-ПЛР з використанням пари праймерів Ко405 та Ко414. Отриманий фрагмент, розміром 1,8 т.п.н., обробляють ендонуклеазами рестрикції ВаmHI та Bg1ІI і клонують у BamHI/Bg1II-лінеаризований дріжджовий вектор pGLG61. Фрагмент ДНК, що містить геп DASJ під контролем промотору HpGAP отримують за допомогою ендонуклеази рестрикції ВаmHІ з попередньо сконструйованої плазміди pDAS1, Даний фрагмент клонують в ВаmHI-лінеаризовану рекомбінантну плазміду pTAL2. У результаті генетичних маніпуляцій отримують рекомбінантну плазміду pDAS1-TAL2 (Фіг. 1). Етап 2. Отримання та аналіз рекомбінантних штамів дріжджів H. роlуmоrрha з посиленою експресією генів DAS1 та TAL2 Отримані рекомбінантні плазміди вводять у клітини реципієнтного штаму Н. polymorpha NCYC495 Ієні-І за допомогою методу електропорації. Селекцію трансформантів проводять на багатому поживному середовищі YPD з додаванням генетицину (500 мг/л). На п'яту добу культивування відбирають низку трансформантів. Для отримання стабільних рекомбінантних штамів трансформанти культивують в неселективних умовах з подальшим відбором клонів, які зберігають здатність рости на середовищі з антибіотиком. Такі штами також перевіряють па здатність рости па мінімальному середовищі з глюкозою та ксилозою без додавання лейцину, порівнюючи з реципієнтним штамом Н. polymorpha NCYC495 leu1-1, що є ауксотрофом за даною амінокислотою (Фіг. 2). За допомогою ПЛР у цих трансформантів підтверджують наявність в геномі генів DAS1 та TAL2 під контролем промотору HpGAP, використовуючи праймери Ко277/Ко280 та Ко4()5/Ко414. Отримані стабільні рекомбінантні штами відбираючі, для дослідження активності ферментів дигідроксіацетонсинтази та трансальдолази, а також продуктивності утворення етанолу під час алкогольної ферментації ксилози. Трансформанти з посиленою експресією гена TAL2 характеризуються в 1,5 раза вищою активністю трансальдолази, а штами з посиленою експресією гена DAS1 в 4 рази вищою активністю дигідроксіацетонсинтази у порівнянні з штамом дикого типу (Фіг. 3). Для дослідження алкогольної ферментації трансформанти вирощують протягом 5 діб у середовищі YNI3 з 12 % ксилозою в умовах обмеженої аерації (140 об/хв, 37 °C). Отримані рекомбінантні штами синтезують від 1,5 до 1,7 раза більше етанолу з ксилози па 4 день ферментації, порівняно з штамом дикого типу (Фіг. 4). Етап 3. Отримання ефективних продуцентів етанолу з підвищеною експресією пероксисомних ферментів па основі кращих з наявних рекомбінантних штамів дріжджів H. polymorpha. На наступному етапі плазміду для посиленої експресії гена DAS1 за допомогою методу електропорації вводять в клітини отриманого рекомбінантного штаму H. polymorpha 2 EtOH" XYI1m XYL2 з посиленою експресією генів XYL1m (кодує модифіковану ксилозоредуктазу 3 UA 104365 C2 5 10 15 20 25 із зниженою спорідненістю до NADPII) та XYL2 (кодує ксилітолдегідрогепазу) [4]. Селекцію трансформантів проводять па багатому поживному середовищі YPD з додаванням генетицину (500 мг/л). На п'яту добу культивування відбирають низку трансформантів. Для отримання стабільних рекомбінантних штамів трансформанти культивуючі, в неселективних умовах з подальшим відбором клопів, які зберігають здатність рости на середовищі з антибіотиком. За допомогою ПЛР у цих трансформантів підтверджують наявність в геномі гена DAS1 під контролем промотору HpGAP, використовуючи праймери Ко277/Ко280. Отримані стабільні рекомбінантні штами відбирають для дослідження продуктивності і утворення етанолу під час алкогольної ферментації ксилози. Трансформанти вирощують протягом 5 діб у середовищі YNB з 12 % ксилозою в умовах обмеженої аерації (140 об/хв, ), Отримані рекомбінантні штами синтезують в 1,5 раза більше етанолу і ксилози на 4 добу ферментації при 37 °C та 45 °C, порівняно і реципієнтним штамом. Джерела інформації: 1. Сибірний АА. Вісник НАН України. - 2006. - 3: 32-48. 2. Johansson В, Hahn-Hagerdal В. FEMS Yeast Res.-2002.-2:277-282. 3. Shi NQ, Davis B, Sherman F, Cruz J, Jeffries TW. Yeast.-1999.-15(11):1021-1030. 4. Ryabova O.B. et al. FEMS Yeast Res.-2003.-4(2):157-164. 5. Dmytruk OV et. al. Microbial Cell Factories.-2008.-7:21. 6. Ishchuk O. P. ct al. FEMS Yeast Res.-2008.-8(7):1167-1174. 7. Voronovsky A.Y. FEMS Yeast Res.-2005.-5:1055-1062. 8. Дмитрук O.B. і співавт. Цитологія і генетика. - 2008. - 2: 70-84. 9. Маниатис Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. - М.: Мир. - 1984. - 480 с. 10. Faber К. N. et al. Curr Genet.-1994.-25:305-310. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 30 Спосіб одержання етанолу з ксилози за допомогою рекомбінантних штамів термолерантних дріжджів Hansenula Polymorpha, який відрізняється тим, що ферментацію ксилози здійснюють за допомогою рекомбінантних штамів H. polymorpha, в геном яких вводять додаткові копії генів пероксисомних ферментів дигідроксіацетонсинтази (DAS1) та трансальдолази (TAL2) під контролем сильного конститутивного промотору гена GAPDH (гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогенази). 4 UA 104365 C2 Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5