Пептид rumc, що має антимікробну активність

Реферат: Винахід належить до пептиду RumC, що має антимікробну активність, а також до генів, що кодують цей пептид. Пептид RumC виділений з мікроорганізму Ruminococcus gnavus, який депонований в CNCM під номером CNCM І-3705. Також винахід розкриває застосування пептиду RumC, що має антимікробну активність для виготовлення лікарського засобу, харчової добавки або корму для тварин. UA 101158 C2 (12) UA 101158 C2 UA 101158 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід відноситься до пептидів RumC1, RumC2 і RumC3, що мають антимікробну активність, а також до генів, що кодують ці пептиди і виділених з Ruminococcus gnavus E1. Деякі бактерійні штами можуть виділяти речовини, що мають бактеріостатичну або бактерицидну дію відносно своїх конкурентів. Ці антимікробні речовини можуть мати органічну природу, наприклад, органічні кислоти або перекис водню [Ross et al., Int. J. Food Microbiol. 79, 3-16, 2002], або пептидну природу. Також розрізняють ферментативні синтезовані антимікробні пептиди, які утворюють клас антибіотиків [Mootz et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1, 543-551, 1997; Keating etal., Curr. Opin. Chem. Biol. 3, 598-606, 1999], і продуковані в рибосомах пептиди, які утворюють клас бактеріоцинів [Jacob et al., Ann. Inst. Pasteur (Paris) 84, 222-224, 1953]. Відносно бактеріоцинів існує зростаючий інтерес в дослідницькій і промисловій області; вони можуть бути альтернативою застосуванню антибіотиків, особливо, в тваринництві [Luchansky, Antonie Van Leeuwenhoek 76, 335, 1999; O'Sullivan et al., Biochimie 84, 593-604, 2002]. За останні роки розроблено безліч гетерологічних систем експресії цих бактеріоцинів. Зокрема, Morriset et al. [Morisset et al., Appl. Environ. Microbiol., 70, 4672-4680, 2004] проводили експресію варіантів мезентрицину Y105, що є бактеріоцин класу IIа, продукований Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides Y105, в Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum DSM20484. Аналогічно, Flynn et al. (Microbiol., 148, 973-984, 2002) здійснювали експресію АВР118, бактеріоцин класу IIb, що є, початково продукований Lactobacillus salivarius subsp. salivarius UCC118, в господарях Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis і Bacillus cereus. Додатково здійснювали декілька тестів експресії бактеріоцинів в бактерії Escherichia coli [McCormick et al., Appl. Environ. Microbiol., 64, 4757-4766, 1998; Garneau et al., Appl. Environ. Microbiol., 69, 1352-1358, 2003; Bietetal., Microbiol., 144, 2845-2854, 1998; Miller et al., Appl. Environ. Microbiol., 64, 14-20, 1998; Richard et al., J. Bacteriol., 186, 4276-4284, 2004; Kloche et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 67:532-538, 2005], дріжджах Saccharomyces cerevisiae [Schoeman et al., Yeast, 15, 647-656, 1999; Van Reenen et al., Int. J. Food Microbiol., 81, 29-40, 2003] і в молочнокислих бактеріях [Rodriguez et al., Int. J. Food Microbiol., 80, 101-116, 2003]. Таким чином, здійснили безліч досліджень з метою ідентифікації нових бактеріоцинів і продукції цих бактеріоцинів. Травна екосистема утворена поширеною і дуже складною мікрофлорою, що включає комбінацію бактерій, дріжджів і архей. Ці мікроорганізми є по суті анаеробними, і в основному серед них виявляють бактерії роду Bacteroides, Eubacterium, Clostridium, Ruminococcus, Bifidobacterium і Fusobactehum [Suau et al., Appl. Environ. Microbiol. 65, 4799-4807, 1999]. Мікрофлора робить значний вплив на здоров'я господаря. Вона залучена в токсифікацію і детоксикацію метаболічних сполук, що надходять з їжею [Hughes and Rowland Microbial Ecology Health Disease 2, 179-185, 2000]. Вона також здатна модулювати експресію функцій ентероцитів [Bry et al., Science 273, 1380-1383, 1996; Hooper et al., Science 291, 881-884, 2001]. Нарешті, вона грає фундаментальну роль в захисті господаря від інвазії потенційно патогенних екзогенних бактерій [Ducluzeau et al., Microbial Ecology and Intestinal Infections, 1988; Fons et al., Microbial Ecology in Health and Disease 2, 240-246, 2000]. До відомих кишкових патогенів відноситься Clostridium perfringens, що є строго анаеробною грампозитивною бактерією, яка здатна утворювати спори, і яка широко поширена в навколишньому середовищі. Цей патоген може надходити з їжі, але також може бути представлений в низькій концентрації в кишечнику, і може починати проліферувати і секретувати токсини під дією стресу. Штами Clostridium perfringens класифікуються на п'ять токсинотипів залежно від токсинів, які вони продукують [Petit et al., Trends Microbiol. 7, 104-110, 1999]. Штами С. perfringens типу А і відповідальні за шлунково-кишкові захворювання у людини. У 1997 році в Сполучених Штатах Америки зареєстровано більше ніж 245000 випадків інфікування С. perfringens. Це привело до госпіталізації 41 людини, сім з яких померли [Mead et al., Emerg. Infect. Dis. 5, 607-625, 1999]. Штами C. perfringens типу А і С можуть бути, відповідно, причиною некротичного ентериту у свиней і свійської птиці. У свійської птиці некротичний ентерит є гострою патологією, що швидко розвивається, смертність від якої досягає 1 %-2 % в добу. Окрім її впливу на самопочуття тварин, ця патологія може, таким чином, надавати відчутну економічну дію. До 1999 року це захворювання контролювали шляхом застосування антибіотиків як фактору росту. Проте, Євросоюз заборонив їх використання в кормі для тварин унаслідок появи резистентних бактерій, слідством чого з'явилося зменшення ефективності антибіотиків у людини. В результаті цієї заборони некротичний ентерит, викликаний Clostridium perfringens у свиней і свійської птиці, більше не контролюється в Європі. Кількість випадків, про які повідомляють в Reseau National d'Observations Epidemiologiques en Aviculture (RNOEA) (AFSSA Ploufragan), значно збільшилася в 1999 і 2000 роках [Valancony, Bulletin des GTV 12, 912, 2001]. 1 UA 101158 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Таким чином, в даний час пошук альтернативних рішень для контролю і лікування цього захворювання набуває першорядної ваги. Ruminococcus gnavus є строго анаеробною бактерією, що відноситься до сімейства Lachnospiraceae в порядку Clostridiales. Dabard et al. [Appl. Environ. Microbiol., 67, 4111-4118, 2001] продемонстрували, що штам Ruminococcus gnavus E1, виділений з домінуючої флори у людини, здатний продукувати антимікробну речовину, відому як румінококцин А або RUMA, яка накопичується в культуральному супернатанті. Він є бактеріоцин, що відноситься до сімейства лантибіотиків, що мають активність проти різних штамів патогенного Clostridium sp. Gomez et al. [J. Bacteriol., 184, 18-28, 2002] продемонстрував, що експресія генів, залучених в біосинтез румінококцину А, індукується у присутності тріпсину. Ті ж самі автори також продемонстрували, що деякі травні ферменти можуть інгібувати індукцію продукції RUMA. Таким чином, автори винаходу зацікавилися іншими бактеріоцинами. Даний винахід відноситься до пептидів RumC1, RumC2 і RumC3, що має антибактеріальну активність проти Clostridium perfringens, і також до генів, що кодують ці пептиди. Опис послідовностей SEQ ID No. 1: Консервативна пептидна послідовність пептидів RumC Ruminococcus gnavus E1 SEQ ID No. 2: Пептидна послідовність пептидів RumC Ruminococcus gnavus E1, експериментально визначена за допомогою способу деградації за Едманом. SEQ ID No. 3: Пептидна послідовність пептидів RumC Ruminococcus gnavus E1, експериментально визначена за допомогою способу деградації за Едманом. SEQ ID No. 4: Пептидна послідовність пептиду RumC1 Ruminococcus gnavus E1, виведена з SEQ ID No. 7 SEQ ID No. 5: Пептидна послідовність пептиду RumC2 Ruminococcus gnavus E1, виведена з SEQ ID-No. 8 SEQ ID No. 6: Пептидна послідовність пептиду RumC3 Ruminococcus gnavus E1, виведена з SEQ ID No. 9 SEQ ID No. 7: Нуклеотидна послідовність гена RumC1 Ruminococcus gnavus E1 SEQ ID No. 8: Нуклеотидна послідовність гена RumC2 Ruminococcus gnavus E1 SEQ ID No. 9: Нуклеотидна послідовність гена RumC3 Ruminococcus gnavus E1 SEQ ID No, 10, 11 і 12: Експериментальні певні пептидні послідовності Опис винаходу Даний винахід відноситься до пептиду, що має антимікробну активність, відрізняється тим, що він включає пептид вибраний з наступних пептидів: пептид, що має послідовність SEQ ID No. 1, пептид, що включає пептид, що має щонайменше 80 % ідентичність з поліпептидом SEQ ID No. 1, пептид, що має послідовність SEQ ID No. 2, і пептид, що включає пептид, що має щонайменше 80 % ідентичність з поліпептидом SEQ ID No. 2. Відповідно до одного з втілень даного винаходу, цей пептид також включає пептидну послідовність SEQ ID No. 3. Відповідно до ще одного втілення даного винаходу, цей пептид включає пептид, вибраний з пептидів, що мають послідовність SEQ ID No. 4, 5 або 6. Даний винахід також відноситься до полінуклеотиду, що кодує антимікробну активність, відрізняється тим, що він включає полінуклеотид, вибраний з будь-якого полінуклеотиду, що має послідовності SEQ ID No. 7, 8 або 9, до полінуклеотиду, який гібридизується з будь-яким полінуклеотидом, що має послідовності SEQ ID No. 7, 8 або 9, і до полінуклеотиду, що кодує поліпептид, визначений вище. Даний винахід також відноситься до експресійної касети, що відрізняється тим, що вона включає у напрямку транскрипції промотор, який є функціональним в організмі господаря, полінуклеотид, визначений вище, і термінаторну послідовність в тому ж самому організмі господаря. Даний винахід також відноситься до вектора, що містить полінуклеотид, визначений вище, і/або експресійну касету, визначену вище. Даний винахід також відноситься до організму-господаря, трансформованого полінуклеотидом, визначеним вище, експресійною касетою, визначеною вище, і/або вектором, визначеним вище. Даний винахід відноситься до штаму Ruminococcus gnavus, депонованого в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F75015 Paris) 19 грудня 2006 року під номером CNCM I-3705, а також до не модифікованого генетично бактерійного штаму у виділеній формі, який продукує пептид, визначений вище. Даний винахід відноситься до білкової суміші або сусла ферментації, яка може бути одержане за допомогою організму господаря або штаму, визначеного вище. 2 UA 101158 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід також відноситься до композиції, що містить пептид, визначений вище, організм господаря, визначений вище, штам, визначений вище, сусло ферментації організму господаря, визначене вище, або сусло ферментації штаму, визначене вище. Відповідно до одного з втілень даного винаходу композиція знаходиться в рідкій формі або порошкоподібній формі. Даний винахід також відноситься до харчової добавки, що містить визначений вище пептид організму.господаря, визначеного вище, штаму, визначеного вище, сусла ферментації організму господаря, визначеного вище, або сусла ферментації, визначеного вище. Відповідно до одного з втілень даного винаходу добавка знаходиться в рідкій формі або порошкоподібній формі. Даний винахід також відноситься до корму для тварин, що відрізняється тим, що він включає харчову основу для тварин і харчову добавку, визначену вище. Даний винахід також відноситься до застосування визначеного вище пептиду, визначеного вище організму господаря, визначеного вище штаму, визначеного вище сусла ферментації організму господаря або визначеного вище сусла ферментації штаму для приготування лікарського засобу, харчової добавки або корму для тварин. Відповідно до одного з втілень даного винаходу це лікарський засіб або його харчова добавка призначені для профілактики або лікування некротичного ентериту у свійської птиці або свиней. Відповідно до ще одного втілення даного винаходу даний лікарський засіб або ця харчова добавка призначені для профілактики або лікування шлунково-кишкових захворювань у людини. Нарешті, даний винахід також відноситься до нетерапевтичного застосування визначеного вище пептиду для лікування тварин. Відповідно до одного з втілень даного винаходу пептид одержують з штаму, ендогенного для тварини, або з штаму, екзогенного для тварини. Відповідно до ще одного втілення даного винаходу пептид одержують з штаму, ендогенного для тварини, і стимулюють продукцію пептиду вказаним ендогенним штамом. Відповідно до ще одного втілення даного винаходу пептид одержують з штаму, ендогенного для тварини, і стимулюють зростання вказаного ендогенного штаму. Пептиди. Таким чином, даний винахід відноситься до пептидів, що мають антимікробну активність. Переважно, ці пептиди виділяють з Ruminococcus gnavus, наприклад, з штаму мутанта Ruminococcus gnavus. Як приклад, ці пептиди можуть виділяти з штаму Ruminococcus gnavus, депонованого в CNCM [Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris] 19 грудня 2006 року під номером CNCM I-3705, тобто штаму LEM 9-17. Термін "антимікробна активність" означає здатність інгібувати зростання або розвиток бактерій-мішеней або здатність вбивати бактерії-мішені. Способи вимірювання антимікробної активності відомі фахівцям в даній області техніки. Антимікробна активність продемонстрована в даному винаході шляхом тестування активності відносно штаму Clostridium perfringens CPA, що вирощується на агаровому середовищі. Зразок, що містить один з пептидів згідно винаходу, поміщають в лунки, сформовані в агаровому середовищі. Антимікробна активність показана, коли навколо лунки утворюється ореол інгібування. Пептидні послідовності пептидів RumC1, RumC2 і RumC3 Ruminococcus gnavus E1 представлені, відповідно, послідовностями SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 і SEQ ID No. 6. Ці послідовності виникають, відповідно, від нуклеотидних послідовностей генів RumC1, RumC2 і RumC3, представлених, відповідно, послідовностями SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8 і SEQ ID No. 9. Винахід також відноситься до фрагментів цих пептидів RumC1, RumC2 і RumC3 Ruminococcus gnavus E1, що має антимікробну активність. Термін "пептидний фрагмент" означає пептид, що містить частину, а не весь пептид, від якого він походить. Таким чином, винахід відноситься до пептидів, що мають послідовності SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 і SEQ ID No. 3. Ці фрагменти зберігають свою антимікробну активність. Таким чином, винахід відноситься до біологічно активних фрагментів. Термін "біологічно активний фрагмент" означає фрагмент поліпептиду, який зберігає функцію поліпептиду, від якого він походить. Винахід також відноситься до пептидів, що мають антимікробну активність, які мають, щонайменше, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % і переважно, щонайменше, 99 % ідентичних амінокислот з будь-якими пептидами, що мають послідовності SEQ ID No. 1, 2 або 3. Способи одержання пептидів послідовностей SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 і SEQ ID No. З відомі фахівцям в даній області техніки. Пептиди RumC секретуються (або вивільняються) бактеріями в позаклітинне середовище. Можливо, щоб будь-які з пептидів, що мають послідовності SEQ ID No. 4, 5 і/або 6, включали сигнальний пептид із заданою кількістю амінокислот. В цьому випадку винахід також 3 UA 101158 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відноситься до зрілого пептиду, одержаного після відщеплення сигнального пептиду. Відповідно до одного з втілень даного винаходу винахід відноситься до пептидів, послідовності яких розташовуються між позицією 20 і позицією 63 в послідовностях SEQ ID No. 4, 5 і 6. У ще одному втіленні потенційний сигнальний пептид у складі пептиду SEQ ID No. 4, 5 або 6 може бути заміщений гетерологічним сигнальним пептидом для здійснення експресії і секреції цього пептиду гетерологічним організмом-господарем. Об'єктом винаходу також є пептид, що має антимікробну активність, який має, щонайменше, 80 % ідентичність з SEQ ID No. 4, 5 або 6. Відповідно до одного з втілень даного винаходу цей пептид виділяють з штаму Ruminococcus gnavus. Відповідно до ще одного втілення даного винаходу цей пептид виділяють з інших штамів Ruminococcus або інших бактерій. Альтернативно, цей пептид можуть одержувати шляхом хімічного синтезу. Одним з об'єктів винаходу є пептид, в якому меншій мірі, 90 %, 95 %, 98 % і, переважно, щонайменше 99 % амінокислот ідентичні будь-якому з пептидів, що мають послідовності SEQ ID No. 4, 5 або 6. Термін "ідентичні амінокислоти" означає амінокислоти, які є постійними або незмінними для двох послідовностей. Ці пептиди можуть мати делецію, вставку або заміну, щонайменше, однієї амінокислоти в порівнянні з пептидами, представленими послідовностями SEQ ID No. 4, 5 або 6. Амінокислоти, модифіковані після транскрипції, наприклад шляхом дегідратації, утворення моносульфідних містків, лантіонін і так далі розглядають як амінокислоти, які є незмінними в двох послідовностях. Об'єктом винаходу також є пептиди, що мають, щонайменше, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % і, переважно, щонайменше, 99 % схожості з будь-якими пептидами, що мають послідовності SEQ ID No. 4, 5 або 6. Термін "схожість" означає ступінь схожості між білковими послідовностями або послідовностями нуклеїнових кислот. Ці пептиди можуть мати делецію, вставку або заміну, щонайменше, однієї амінокислоти в порівнянні з пептидами, представленими послідовностями SEQ ID No. 4, 5 або 6. Кількісно оцінюваний ступінь схожості між двома послідовностями заснований на відсотку ідентичності і/або консервативних замін в послідовності. Способи вимірювання і ідентифікації ступеня ідентичності і ступеня близькості між поліпептидами відомі фахівцям в даній області техніки. Здійснюють поєднання послідовностей, наприклад, за допомогою Vector NTi 9.1.0, що є програмою для поєднання ALIGNX (алгоритм Clustal W) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com) або з використанням засобу CLUSTAW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Пептиди згідно винаходу можуть виділяти або очищати зі свого природного середовища. Пептиди можуть одержувати за допомогою різних способів. Ці способи є переважно очищенням з природних джерел, таких як бактерії, які в природі експресують ці пептиди, продукцію рекомбінантних пептидів відповідними клітинами господарями і їх подальше очищення, продукцію за допомогою хімічного синтезу або, нарешті, комбінацію цих різних підходів. Таким чином, пептиди, що мають послідовності SEQ ID No. 1-6 згідно даного винаходу, можуть виділяти з штаму Ruminococcus gnavus, депонованого в CNCM 19 грудня 2006 року під номером CNCM I-3705. У ще одному втіленні пептиди згідно даного винаходу виділяють з рекомбінантних організмів господарів, експресуючий пептид RUMC згідно винаходу або фрагмент пептиду RUMC, що має антимікробну активність. Об'єктом винаходу також є злиті білки, рекомбінантні білки або химерні білки, що включають пептиди згідно винаходу. Пептиди за винаходом можуть виділяти із сліпокишкового вмісту моноксенних щурів, що несуть штам Ruminococcus gnavus E1, і з штаму мутанта Ruminococcus gnavus, конкретніше, штаму Ruminococcus gnavus, депонованого в CNCM 19 грудня 2006 року під номером CNCM I3705. Ці пептиди мають антимікробну активність, продемонстровану за допомогою тесту активності відносно Clostridium perfringens. Mac-спектрометрія дає можливість визначити приблизну молекулярну масу пептиду RumC згідно винаходу. Молекулярна маса складає від 4000 до 4600 Да, і конкретніше, від 4100 до 4500 Да. Відповідно до одного з втілень даного винаходу пептид підходить для харчового або фармацевтичного застосування, наприклад для застосування в годуванні тварин. Термін "пептид, відповідний для харчового або фармацевтичного застосування" означає пептид, характеристики якого є такими, що він підходить для годування або фармацевтичного застосування. Характеристиками, важливими для харчового або фармацевтичного застосування, зокрема, є рН, який може витримувати пептид. Зокрема, рН травної системи людини і тварини є кислим, і, таким чином важливо, щоб пептид був стійкий до цього значення 4 UA 101158 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 рН. Ще одна важлива для харчового застосування характеристика є температура, при якій антимікробна речовина є активною. Зокрема, переробка антимікробної речовини в лікарський засіб, харчову добавку або корм для тварин, наприклад, включає обробку при температурі вище за кімнатну температуру. Активність використовуваних антимікробних речовин, таким чином, має бути стабільна за умов способу, особливо, за температурних умов. Відповідно до одного з втілень даного винаходу, пептид або суміш пептидів за винаходом має антимікробну активність при нейтральному значенні рН і зберігає свою антимікробну активність при кислому рН, наприклад, нижче 7, і, переважно, нижче 4,4. Відповідно до одного з втілень даного винаходу пептид або суміш пептидів згідно винаходу має антимікробну активність при 37 °C і зберігає цю активність при температурах нижче і вище за кімнатну температуру, наприклад вище 50 °C. Винахід також відноситься до пептиду, що має антимікробну активність, виділеного з вмісту сліпої кишки моноксенних щурів або з штаму мутанта Ruminococcus gnavus, що має активність проти штамів Clostridium perfringens, що має молекулярну масу від 4000 до 4600 Да, що визначають за допомогою мас-спектрометрії, і стійкого до рН менше ніж або рівного 7. Відповідно до одного з втілень, пептид включає послідовність SEQ ID No. 1 і/або послідовність SEQ ID No. 2. Відповідно до ще одного аспекту винаходу він також включає пептид, що має послідовність SEQ ID No. 3. Переважно, пептид включає пептид, вибраний з будь-якого з пептидів, що мають послідовність SEQ ID No. 4, 5 або 6. Винахід також відноситься до пептиду, що має антимікробну активність, який може бути одержаний з штаму мутанта Ruminococcus gnavus, наприклад штаму Ruminococcus gnavus, депонованого в CNCM 19 грудня 2006 року під номером CNCM I-3705. Відповідно до одного з втілень пептид має антимікробну активність відносно штамів Clostridium perfringens. Відповідно до ще одного аспекту пептид має молекулярну масу від 4000 до 4600 Да і переважно від 4100 до 4500 Да, що визначають за допомогою мас-спектрометрії. Відповідно до ще одного аспекту пептид має антимікробну активність при нейтральному рН, і зберігає свою антимікробну активність при кислому рН, наприклад менше 7, і переважно нижче 4,4. Відповідно до одного з втілень пептид включає послідовність SEQ ID No. 1 і/або послідовність SEQ ID No. 2. Відповідно до ще одного аспекту винаходу він також включає пептид, що має послідовність SEQ ID No. 3. Переважно, пептид включає пептид, вибраний з будь-якого з пептидів, що мають послідовності SEQ ID No. 4, 5 або 6. Винахід також відноситься до пептиду, що має антимікробний потенціал, виділеного з вмісту сліпої кишки моноксенних щурів, відповідної хроматограми на Фіг. 4А, одержаної при 214 нм за допомогою зворотньо-фазової ВЕРХ (високоефективної рідинної хроматографії), що має активність відносно різних штамів Clostridium perfringens, зокрема, типу токсину А. Полінуклеотиди. Винахід також відноситься до полінуклеотидів, що кодують антимікробну активність. Переважно, ці полінуклеотиди кодують антимікробну активність відносно Ruminococcus. Відповідно до даного винаходу термін "полінуклеотид" означає одноланцюговий полінуклеотидний ланцюг або його комплементарний ланцюг, який може бути ланцюгом ДНК або РНК, або дволанцюговий нуклеотидний ланцюг, який може бути комплементарним або геномом ДНК. Переважно, полінуклеотиди згідно винаходу є ДНК, зокрема, дволанцюгові ДНК. Термін "полінуклеотид" також позначає модифіковані полінуклеотиди. Полінуклеотиди згідно даного винаходу можуть виділяти або очищати з природного середовища. Полінуклеотиди згідно даного винаходу також можуть одержувати шляхом хімічного синтезу або за допомогою стандартних способів молекулярної біології, описаних Sambrook, Fristsch і Maniatis в їх книзі, під назвою "Molecular cloning: a laboratory manual", видання: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Винахід відноситься до полінуклеотиду, що відповідає будь-якій з послідовностей SEQ ID № 7, 8 або 9. Винахід також відноситься до полінуклеотиду, який гібридизується з полінуклеотидом, що відповідає будь-якій з послідовностей SEQ ID № 7, 8 або 9. Винахід також відноситься до полінуклеотиду, що кодує пептид, що має визначену вище антимікробну активність. Винахід також відноситься до полінуклеотиду, який має, щонайменше, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % і переважно, щонайменше, 99 % ідентичність з полінуклеотидом, що відповідає будь-якій з послідовностей SEQ ID № 7, 8 або 9. Цей полінуклеотид кодує антимікробну активність. Відповідно до одного з втілень, полінуклеотид кодує антимікробну активність відносно штамів Clostridium perfringens. 5 UA 101158 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "ідентичні нуклеотиди" означає нуклеотиди, які є постійними або незмінними між двома послідовностями. Цей полінуклеотид може мати делецію, вставку або заміну, щонайменше, одного нуклеотида в порівнянні з референсним полінуклеотидом. Винахід також відноситься до полінуклеотиду, який має, щонайменше 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, і, переважно, щонайменше 99 % схожість з полінуклеотидом відповідно до будь-якої з послідовностей SEQ ID № 7, 8 або 9. Цей полінуклеотид кодує антимікробну активність. Відповідно до одного з втілень полінуклеотид кодує антимікробну активність відносно штамів Clostridium perfringens. Термін "схожість" означає міру близькості між білковими послідовностями або послідовностями нуклеїнової кислоти. Цей полінуклеотид може мати делецію, вставку або заміну, щонайменше, одного нуклеотида в порівнянні з референсним полінуклеотидом. Ступінь схожості між двома послідовностями, що оцінюється за шкалою, заснованою на відсотку ідентичності і/або консервативних замін в послідовності. Способи вимірювання та ідентифікації ступеню ідентичності і ступеню схожості між послідовностями нуклеїнової кислоти відомі фахівцям в даній області техніки. Здійснюють поєднання послідовностей, наприклад, за допомогою Vector NTi 9.1.0, програми поєднання ALIGNX (алгоритм Clustal W) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com) або з використанням засобу CLUSTAW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Винахід також відноситься до полінуклеотидів, здатних вибірково гібридизуватися з полінуклеотидом відповідно до будь-якої з послідовностей SEQ ID № 7, 8 або 9. Переважно, селективну гібридизацію здійснюють в помірно тяжких умовах, і, переважно, в дуже тяжких умовах. Відповідно до винаходу термін "послідовність, здатна селективно гібридизуватися" означає послідовності, які гібридизуються з референсною послідовністю в ступені, що значно перевищує фоновий рівень. Рівень сигналу, сформований шляхом взаємодії між послідовністю, здатною вибірково гібридизуватися, і референсними послідовностями, як правило, в 10 разів, і, переважно, в 100 разів сильніший в порівнянні з взаємодією з іншими послідовностями ДНК, яка формує фоновий рівень. Умови суворої гібридизації, які дають можливість для виборчої гібридизації, відомі фахівцям в даній області техніки. Як правило, температура гібридизації і промивки, щонайменше, на 5 °C нижче Тm (температура плавлення) референсної послідовності при даному рН і для заданої іонної сили. Як правило, температура гібридизації складає, щонайменше, 30 °C для полінуклеотиду з 15-50 нуклеотидів, і, щонайменше, 60 °C для полінуклеотиду із понад 50 нуклеотидів. Як приклад, гібридизацію здійснюють в наступному буфері: 6Х SSC (хлорид натрію + цитрат натрію), 50 мМ TRIS-HCI (рН 7,5), 1 мМ EDTA (етилендіамінтетраоцтова кислота), 0,02 % PVP (полівінілпіролідон), 0,02 % Ficoll, 0,02 % BSA (бичачий сироватковий Альбумін), 500 мкг/мл денатурованої ДНК сперми лосося. Промивку здійснювали, наприклад, послідовно при низькій жорсткості в 2Х SSC, 0,1 % буфері SDS (додецилсульфат натрію), при помірній жорсткості в 0,5Х SSC, 0,1 % буфері SDS, і при високій жорсткості в 0,1Х SSC, 0,1 % буфері SDS. Безумовно, гібридизацію можна здійснювати відповідно до інших загальних способів, відомих фахівцям в області техніки (див., зокрема Sambrook, Fristsch і Maniatis в їх книзі, під назвою "Molecular cloning: a laboratory manual", edition: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Переважно, полінуклеотиди, які вибірково гібридизуються з референсним полінуклеотидом, зберігають функцію референсної послідовності. В даному випадку полінуклеотиди, які вибірково гібридизуються з полінуклеотидом відповідно до будь-якої з послідовностей SEQ ID № 7, 8 або 9, кодують антимікробну активність. Винахід відноситься, загалом, до полінуклеотидів, що кодують пептиди згідно винаходу. Враховуючи виродженість генетичного коду, різні полінуклеотиди можуть кодувати один і той же поліпептид. Експресійні касети. Відповідно до одного з втілень винаходу, полінуклеотид, що кодує пептид згідно винаходу, вбудовують в експресійну касету з використанням способів клонування, добре відомих фахівцям в даній області техніки. Дана експресійна касета включає елементи, необхідні для транскрипції і трансляції кодуючих послідовностей для поліпептидів згідно винаходу. Переважно, ця експресійна касета включає як елементи, потрібні для продукції пептиду в клітині-господареві, так і елементи, необхідні для регуляції цієї експресії. Ці експресійні касети включають у напрямі транскрипції: - промотор, який є функціональним в організмі господаря; - полінуклеотид згідно винаходу; - термінаторну послідовність, яка є функціональною в тому ж самому організмі господаря. 6 UA 101158 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В експресійних касетах згідно винаходу можуть використовувати будь-який тип промоторної послідовності. Вибір промотора залежить, особливо, від організму господаря, вибраного для експресії відповідного гена. Деякі промотори дають можливість конститутивної експресії, тоді як інші промотори, з іншого боку, є індукованими. Серед функціональних промоторів в грибах необхідно згадати гліцеральдегід-3фосфатдегідрогеназу Aspergillus nidulans (Roberts et al., Current Genet. 15, 177-180, 1989). Серед функціональних промоторів в бактеріях слід згадати, особливо, промотори РНК полімерази бактеріофага Т7 (Studieret al., Methods in Enzymology, 185, 60-89, 1990). Серед функціональних промоторів дріжджів слід згадати промотор гена GAL1 (Elledge et al., Proc. Natl Acad. Sciences, USA. 88, 1731-1735, 1991) або промотори Gal4 і ADH S. cerevisiae. Всі ці промотори описані в літературі і добре відомі фахівцям в даній області техніки. Для експресії в РепісіІІіит funiculosum вибирають, наприклад експресійні касети, що включають промотор гістона Н4В, промотор протеази аспарагінової кислоти або промотор csl13 (WO 00/68401). Для експресії в дріжджах Pichia pastoris вибирають, наприклад експресійні касети, що містять індукований метанолом промотор АОХ1 (Tschopp et al., Biotechnology, 5, 1305-1308, 1987) або сильний конститутивний промотор GAP (Waterham et al., Gene 186, 37-44, 1997). Для експресії в Schizosaccharomyces pombe вибирають, наприклад експресійні касети, що містять регулюючий промотор Nmt1, репресований тіаміном, і активований у відсутності тіаміну (Maundrell, J. Biol. Chem. 265, 10857-10864, 1989). Експресійні касети згідно даного винаходу також можуть включати будь-яку іншу послідовність, необхідну для експресії поліпептидів або полінуклеотидів, наприклад регуляторні елементи або сигнальні послідовності, що дають можливість секреції поліпептидів, що продукуються організмом господаря. Зокрема можна застосовувати будь-яку регуляторну послідовність, яка дає можливість збільшення рівня експресії кодуючої послідовності, вбудованої в експресійну касету. Відповідно до винаходу, її, зокрема, можна використовувати в комбінації з промоторною регулюючою послідовністю або іншими регулюючими послідовностями, які розташовані між промотором і кодуючою послідовністю, такою як активатори транскрипції ("енхансери"). Додатково, експресійні касети згідно даного винаходу можуть включати будь-яку іншу послідовність, необхідну для секреції поліпептидів, що продукуються організмом господаря, таку як сигнальна послідовність. Для секреції в Pichia pastoris можна, наприклад, використовувати послідовність а чинника як сигнал секреції. В експресійних касетах згідно винаходу може бути застосована широка різноманітність термінаторних послідовностей, причому ці послідовності дають можливість термінації транскрипції і поліаденілювання мРНК. Може бути використана будь-яка термінаторна послідовність, функціональна у вибраному організмі господаря. Для експресії в Penicillium funiculosum вибирають, наприклад експресійні касети, що містять термінатор гістона Н4.В, термінатор протеази аспарагінової кислоти або термінатор csl13 (WO 00/68401). Об'єктом даного винаходу також є полінуклеотид, що містить експресійну касету згідно винаходу; переважно, експресійні касети згідно даного винаходу вбудовані у вектор. Вектори. Даний винахід також відноситься до клонуючих або експресійних векторів для трансформації організму господаря, що містять, щонайменше, один полінуклеотид або експресійну касету згідно даного винаходу. Цей вектор може, зокрема, відповідати плазміді, косміді, бактеріофагу або вірусу, куди вбудований полінуклеотид або експресійна касета за винаходом. Способи конструювання цих векторів і вбудовування полінуклеотиду згідно винаходу в ці вектори відомі фахівцям в даній області техніки. Загалом, може бути використаний будь-який вектор, здатний до самопідтримки або до самореплікації, або розповсюдження в клітині-господарі для того, щоб особливо викликати експресію полінуклеотиду або пептиду. Фахівець в даній області техніки вибирає відповідні вектори залежно від трансформованого організму господаря і залежно від використовуваного способу трансформації. Вектори згідно даного винаходу використовуються, зокрема, для трансформації організмугосподаря з метою реплікації вектора і/або експресії пептиду за винаходом в організмігосподарі. Винахід також відноситься до способу одержання пептиду за винаходом, що включає наступні стадії: 7 UA 101158 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - організм господаря трансформують експресійним вектором, що містить експресійну касету за винаходом і/або полінуклеотид за винаходом - виділяють пептиди, що продукуються організмом-господарем. Організми-господарі. Об'єктом даного винаходу також є спосіб трансформації організму господаря шляхом інтеграції у вказаний організм-господар, щонайменше, одного полінуклеотиду, щонайменше, однієї експресійної касети або, щонайменше, одного вектора згідно винаходу. Полінуклеотид може бути інтегрований в геном організму-господаря або може стабільно репліцуватися в організмі-господарі. Способи трансформації організмів-господарів відомі фахівцям в даній області техніки і широко описані в літературі. Даний винахід також відноситься до організму-господаря, трансформованого полінуклеотидом, експресійною касетою або вектором згідно винаходу. Відповідно до винаходу, термін "організм-господар", зокрема, означає будь-який вищий або нижчий одноклітинний або багатоклітинний організм, вибраний, зокрема, з бактерій, дріжджів і грибів. Зокрема, термін "організм-господар" означає нелюдський організм. Переважно, дріжджі вибирають, наприклад з Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica і Schwanniomyces occidentalis. Гриби вибирають, наприклад з Aspergillus, Trichoderma і Penicilliums, переважно з Penicillium funiculosum, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus kawachii і Trichoderma koningii. У одному з втілень винаходу організмгосподар є штамом Penicillium funiculosum, в якому має місце експресія або надекспресія пептиду згідно винаходу. У ще одному втіленні організм господар є штамом Debaromyces castellii, в якому має місце експресія або надекспресія пептиду згідно винаходу. У ще одному втіленні організм-господар є штамом Ruminococcus gnavus, в якому має місце експресія або надекспресія пептиду за винаходом. Способи конструювання векторів для трансформації організмів-господарів і для експресії гетерологічних білків в цих організмах широко описані в літературі, особливо, Sambrook, Fristsch і Maniatis в книзі, під назвою "Molecular cloning: a laboratory manual", видання: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 або Ausubel et al. у книзі, під назвою "Current Protocols in Molecular Biology", видання: Greene Publishing Associates, Inc., і John Wiley and Sons, NY, 1992. Штами. Новий штам Ruminococcus gnavus депонований в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris) 19 грудня 2006 року під номером CNCM I-3705. CNCM є міжнародним компетентним органом по депонуванню, відповідно до ст. 7 Будапештського договору. Новий штам одержаний шляхом випадкового мутагенезу штаму R. gnavus L14. Цим штамом є спонтанний мутант R. gnavus E1, який втратив здатність продукувати RumA in vitro, але який все ще синтезує RumC in vivo. Для мутагенезу використовували сильний алкілюючий агент Nметил-N'-нітро-N-нітрозогуанідін (NG). При використанні рекомбінантних способів з використанням ДНК або РНК іншого походження не досягали генетичної модифікації. Культуральне середовище штаму LEM 9-17 переважно є ВНІ, доповнене дріжджовим екстрактом і геміном (BHI-YH). Білкова суміш, сусло Ферментації. Винахід також відноситься до способу одержання пептиду, що має антимікробну активність, винаходу, де вказаний спосіб включає наступні стадії: а) вирощування штаму Ruminococcus gnavus або трансформованого організму-господаря згідно винаходу в умовах, які викликають експресію пептиду, і б) виділення культурального супернатанту, що містить пептид. Відділення пептиду від культурального супернатанта можуть здійснювати за допомогою заряду, розміру і/або гідрофобної природи. Фахівцю в даній області відомі різні способи розділення залежно від заряду, розміру і/або гідрофобної природи різних складових середовища. Цей культуральний супернатант або сусло ферментації потім можуть концентрувати або ліофілізувати для формування харчової добавки або корму для тварин. Цей спосіб може включати додаткові стадії очищення антимікробної речовини від культурального супернатанту. Якщо організм-господар не секретує антимікробну речовину в культуральне середовище, може бути необхідна додаткова стадія клітинного лізису і очищення клітинного лізату. Пептиди згідно винаходу також можуть бути одержані з вмісту сліпої кишки моноксенних щурів. Композиція. 8 UA 101158 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Композиції згідно винаходу містять пептид згідно винаходу, організм-господар згідно винаходу, штам згідно винаходу, сусло ферментації організму-господаря згідно винаходу або сусло ферментації штаму згідно винаходу. Композиції знаходяться в рідкій формі або порошкоподібній формі. Ці композиції містять різні інгредієнти. Рідкі композиції можуть містити, наприклад, ще один антимікробний агент, наприклад сорбінову кислоту або сіль сорбінової кислоти, бензойну кислоту або сіль бензойної кислоти, або фумарову кислоту або сіль фумарової кислоти. Композиції згідно винаходу також можуть містити сорбіт. Сорбітом є стабілізатор і агент, використовуваний у виготовленні препарату. Композиції за винаходом також можуть містити антифризи, наприклад етилгліколь, гліцерин, пропіленгліколь і 1,2-пропандіол. Композиції в порошкоподібній формі містять носій. Цей носій може бути вибраний з пшеничної муки, крохмалю, мальтодекстрину, сірчанокислого кальцію і серцевин кукурудзяного качана. Композиції згідно винаходу мають антимікробну активність. Вони є альтернативою застосуванню антибіотиків. Вони можуть бути використані, наприклад, при розведенні тварин або як лікарські засоби для людини. Композиції згідно даного винаходу містять, щонайменше, один пептид за винаходом, але вони також можуть містити інші речовини, наприклад вітаміни, інші активні речовини, амінокислоти або неорганічні солі. Композиції згідно винаходу забезпечують можливість, наприклад, профілактики або лікування некротичного ентериту у свиней або свійської птиці, і профілактики або лікування шлунково-кишкових захворювань у людини. Композиції згідно винаходу, наприклад, додають в корм для тварин або, наприклад, комбінують з харчовою основою. Таким чином, даний винахід також відноситься до корму для тварин, що містить композицію згідно винаходу. Цей корм зазвичай знаходиться у формі муки або гранул, в які включені композиції, що мають антимікробну активність. Об'єктом даного винаходу також є корм для тварин, що містить пептид згідно винаходу, організм-господар згідно винаходу або ферментацію сусло/культуральний супернатант організму-господаря згідно винаходу. Термін "корм" означає що-небудь, що може служити як корм для тварин. Термін "харчова основа" означає що-небудь, що складає істотну частку харчового раціону тварини, складену, наприклад, шляхом змішування зернових, білків і жирів тваринного і/або рослинного походження. Зазвичай, такі харчові основи включають, наприклад кукурудзу, пшеницю, горох і сою. Ці харчові основи адаптовані для потреб різних видів тварин, для яких вони призначені. Вони можуть являти собою, наприклад свійську птицю (кури-несучки, бройлерні курчата, індички і качки) або свиней (зростаючі і свині в завершальній стадії відгодівлі або поросята). Застосування пептидів. Даний винахід також відноситься до застосування пептиду згідно винаходу, організмугосподаря згідно винаходу, штаму згідно винаходу, сусла ферментації організму-господаря згідно винаходу або сусла ферментації штаму згідно винаходу для виготовлення лікарського засобу. Даний винахід також відноситься до застосування пептиду згідно винаходу, організмугосподаря згідно винаходу, штаму згідно винаходу, сусла ферментації організму-господаря згідно винаходу або сусла ферментації штаму згідно винаходу як харчової добавки або, в комбінації з іншими сполуками, як корм для тварин. Відповідно до одного з втілень даного винаходу це лікарський засіб або ця харчова добавка призначена для профілактики або лікування некротичного ентериту у свиней або свійської птиці. Відповідно до одного з втілень даного винаходу це лікарський засіб або ця харчова добавка призначені для профілактики або лікування шлунково-кишкових захворювань у людини. Опис графічних матеріалів Фіг. 1: хроматограма, одержана шляхом молекулярного скринінгу на Sephadex G-75 розчинній фракції, що міститься в 10 грамах вмісту сліпої кишки моноксенних щурів, що несуть штам R. gnavus E1; на осі х позначений об'єм, що елююється, в мл; на осі у позначена абсорбція при 280 нм; затінена площа відповідає фракціям, активним відносно С. perfringens (фракції з 325 по 358). Фіг. 2А: хроматограма, одержана шляхом молекулярного скринінгу стандартних білків на Sephadex G-75; на осі х позначений об'єм, що елююється, в мл; на осі у позначена абсорбція при 280 нм; а: Альбумін 67 кДа; b: овальбумін 43 кДа; с: хімотрипсін 25 кДа; d: рибонклеаза А 13,7 кДа. 9 UA 101158 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фіг. 2В: калібрувальна логарифмічна крива (MM) = f(Ve), одержана з хроматограм на фіг. 2А; на осі х позначений об'єм, що елююється, в мл; на осі у позначений логарифм молекулярної маси. Фіг. 3: хроматограма, одержана за допомогою ВЕРХ на катіонообмінній колонці активної фракції GF; на осі у, ліва сторона, позначена абсорбція при 214 нм; на осі у, права сторона, позначена концентрація NaCI в М; на осі х позначений час в хвилинах. Фіг. 4А: хроматограма, одержана за допомогою зворотньо-фазової ВЕРХ активної фракції CM; на осі у, ліва сторона, позначена абсорбція при 214 нм; на осі у, права сторона, позначений відсоток ацетонітрильного елюєнта; на осі х позначений час в хвилинах. Фіг. 4В і 4С: мас-спектр фракцій, одержаних в результаті зворотньо-фазової ВЕРХ; на осі х позначено відношення маса/заряд; на осі у позначена інтенсивність сигналу. Фіг. 5: схема протоколу очищення RumC з вмісту сліпої кишки моноксенних щурів, з штамом R. gnavus E1. Фіг. 6: хроматограма, одержана за допомогою РХШД (рідинній хроматографії швидкого дозволу) на катіонообмінній смолі знесоленої фракції SN 9-17; на осі х позначений час в хвилинах; на осі у позначена абсорбція при 214 нм а: абсорбція при 214 нм b: концентрація NaCI з: провідність d: швидкість потоку в мл/хв. Фіг. 7: мас-спектри різних фракцій під час очищення RumC; на осі х позначено відношення маса/заряд; на осі у позначена інтенсивність сигналу. Фіг. 7A:SN 9-17. Фіг. 7В: активна фракція CM. Фіг. 7С: R 10 кДа. Фіг. 8: мас-спектр фракції GF 47-50; на осі х позначено відношення маса/заряд; на осі у позначена інтенсивність сигналу. Фіг. 9: схема протоколу очищення RumC з штаму мутанта LEM 9-17. Приклади Матеріали і методи 1. Бактерійні штами і культуральні середовища. Штам Ruminococcus gnavus E1, який продукує RumC, виділяли з домінуючої фекальної мікробіоти здорової дорослої людини (Dabard et al., Appl. Environ. Microbiol., 67, 4111-4118, 2001). Штам R. gnavus L14 є спонтанний мутант R. gnavus E1, що втратив здатність продукувати RumA in vitro, але що зберіг здатність синтезувати RumC in vivo. Штам Ruminococcus gnavus, депонований в CNCM 19 грудня 2006 року під номером CNCM I-3705, одержаний в результаті випадкового мутагенезу штаму L14. Він здатний продукувати RumC in vitro в доповненому трипсіном агаровому середовищі (500 мкг/мл; але не в рідкому середовищі). Він є штамом LEM 9-17. Штам, що застосовується, як мішень для тестів активності, є штамом Clostridium perfringens CPA (Dabard et al., Appl. Environ. Microbiol., 67, 4111-4118, 2001). Ці чотири штами вирощують анаеробно в камері типу "Freter" в контрольованій атмосфері (85 % N2, 10 % Н2, 5 % СО2). їх інкубують при 37 °C в середовищі ВНІ, доповненому дріжджовим екстрактом і геміном (BHI-YH). Рідкий BHI-YH: 37 г/л ВНІ (Brain Heart Infusion, Difco Laboratories) 5 г/л дріжджового екстракту (Yeast Extract, Fluka) 5 мг/л геміну (Hemin, Sigma) агар BHI-YH: теж + 15 г/л агару (ВАСТО™ агар, Difco Laboratories). 2. Тести на антимікробну активність з використанням рідкого зразка. 4 Для здійснення тесту на антимікробну активність з використанням рідкого зразка від 10 до 5 10 клітин С. perfringens CpA висівають в агаровому середовищі. Через 30 хвилин при кімнатній температурі в агарі з використанням пастерівської піпетки роблять лунки діаметром 6 мм. Зразки об'ємом менше 100 мкл потім поміщають в лунки, і чашки інкубують протягом 16-24 годин при 37 °C. Якщо зразок містить антимікробну речовину, направлену проти С. perfringens CPA, зростання бактерій інгібується, що призводить до утворення "ореолу інгібування" навколо лунки. Тести на активність також можуть здійснювати шляхом безпосереднього розміщення 10 мкл тестованого зразка на агар, що заздалегідь інкубується з С. perfringens. 3. Тест на антимікробну активність з використанням колоній, які ростуть в агаровому середовищі. 10 UA 101158 C2 5 10 15 20 Після вирощування протягом 24 годин в агаровому середовищі, доповненої або що іншим чином містить 50 мкг/мл трипсину, штам, що потенційно продукує антимікробну речовину, покривають "м'яким" агаровим середовищем (що містить 7,5 г агар/л), що містить штам-мішень. Цей м'який агар готують шляхом негайного змішування 5 мл переохолодженого агарового 4 5 середовища з 5 мл рідкого середовища, що містить від 10 до 10 клітин штаму-мішені. Чашки Петрі потім повторно інкубують протягом 16-24 годин при 37 °C. Ореол інгібування виявлений навколо колоній, що продукують антимікробну речовину. 4. Видалення клітинного дебрису і харчових залишків з вмісту сліпої кишки. 10 г вмісту сліпої кишки розводять в 30 мл PBS (NaCI 137 мМ, КСІ 2,68 мМ, Na2HPO4 8,1 мМ, КН2РО4 1,47 мМ, рН 7,4) і потім центрифугують при 10000g і при 4 °C протягом 15 хвилин. Осад, що містить клітинний дебрис і харчові залишки, видаляють. 5. Модулі для фільтрування шляхом центрифугування. Вони є фільтрувальними мембранами для розділення білків на дві фракції залежно від їх молекулярної маси після центрифугування. Ці системи також можуть бути використані для концентрації або знесолювання зразків. Продукти цього типу пропонують декілька виробників. В більшості випадків мембрани готують з регенерованої целюлози, але вони також можуть бути зроблені з поліефірсульфону. Вибір системи здійснюють залежно від об'єму зразків, які обробляють, і порогу відсікання мембран (Таблиця 1). Дані фільтруючі модулі, використовували відповідно до вказівок, наведених виробником для вибору типу ротора і швидкості центрифугування. Проте час центрифугування змінювали залежно від в'язкості зразка. Таблиця 1 Характеристики фільтруючих використовуваних в процесі тестів очищення RumC модулів Назва Amicon®Ultra-15PL-5* Microcon®YM-10* Microcon® YM-3* Vivaspin 500-5000MWCO** Vivaspin 500-3000MWCO** Тип мембрани Регенерована целюлоза Регенерована целюлоза Регенерована целюлоза Поліефірсульфон Поліефірсульфон Поріг відсічення 5 кДа 10 кДа 3 кДа 5 кДа 3 кДа Максимальний об'єм 20 мл 0,5 мл 0,5 мл 0,6 мл 0,6 мл * продукт під товарним знаком МіІІіроге; ** продукт під товарним знаком Sartorius. 25 30 35 40 45 6. Молекулярний скринінг на Sephadex G-75. Молекулярний скринінг супернатанту вмісту сліпої кишки здійснюють на колонці Sephadex G-75 (2,4×187 см). Зразок (об'єм якого складає приблизно 2 % від об'єму колонки) наносили на колонку, елюювання здійснювали при 4 °C при швидкості потоку 1 мл/хвилину з використанням PBS, і збирали 600 2-мл фракцій. Хроматограму одержували шляхом прочитування абсорбції при 280 нм для кожної фракції. 7. Молекулярний скринінг за допомогою РХШД. Молекулярний скринінг активної фракції CM здійснюють за допомогою системи РХШД. Зразок наносять на колонку HiLoad 26/60 Superdex ЗО pg (GE Healthcare). Елюювання здійснюють при швидкості потоку 2,5 мл/хв за допомогою PBS. Білковий матеріал, що елююється, виявляють шляхом вимірювання варіації в абсорбції при 280 нм. Фракції, що відповідають 2 хвилинам елюювання, збирають автоматично. 8. ВЕРХ на катіонообмінній колонці CM. Катіонообмінні ВЕРХ здійснюють на Waters 600S Controller, обладнаному помповим інжектором Waters 616. Зразок (0,5 мл) наносять на напівпрепаративну колонку CM-3SW Spherogel від TSK. Елюювання здійснюють при рН 5 в 20 мМ буфері з ацетатом натрію при швидкості потоку 0,8 мл/хв, з використанням градієнта концентрації NaCI від 0 до 1М. Протягом перших 20 хвилин елюювання здійснюють в ізократичному режимі без NaCI, і потім з лінійним градієнтом концентрації NaCI від 0 до 0,5 М протягом 30 хвилин. Елюювання потім продовжують протягом 5 хвилин в ізократичних умовах, потім здійснюють різкий перехід на концентрацію NaCI 1 М протягом 1 хвилини, а потім продовжують протягом 15 хвилин в ізократичних умовах і, нарешті, повертаються до початкових умов. Білковий матеріал, що елююється, виявляють шляхом вимірювання поглинання при 280 або 214 нм з використанням перемикаючого 11 UA 101158 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 детектора абсорбції Waters 486. Фракції збирають автоматично і потім знесолюють з використанням системи Amicon® Ultra PL-5. 9. РХШД на катіонообмінній колонці. Катіонообмінну хроматографію здійснюють на РХШД. Зразок наносять на колонку Ні-Ргер 16/10 CM FF (GE Healthcare). Елюювання здійснюють при рН 5 в 20 -мМ буфері з ацетатом натрію з використанням градієнта концентрації NaCI від 0 до 0,4 М. Елюювання здійснюють протягом 50 хвилин в ізократичному режимі без NaCI при швидкості потоку 2 мл/хв. Елюювання потім продовжують при швидкості потоку 5 мл/хв з лінійним градієнтом концентрації NaCI від 0 до 0,4 М протягом 40 хвилин. Білковий матеріал, що елююється, виявляють шляхом вимірювання зміни абсорбції при 280 нм. 1 мл фракції збирають автоматично і потім знесолюють на картриджах Sep-Pak® С18. 10. Зворотньо-Фазова ВЕРХ. Зворотньо-фазову ВЕРХ здійснюють в модулі Alliance Waters 1690 Separations Module. Зразок (100 мкл), що заздалегідь підкисляється 0,1 % трифтороцтовою кислотою (TFA), наносять на аналітичну колонку Vydac 218ТР52 250 × 2. Елюювання здійснюють при постійній швидкості потоку (0,5 мл/хв). Після елюювання протягом 10 хвилин в ізократичному режимі з 15 % ацетонітрилом, застосовують лінійний градієнт від 15 % до 30 % ацетонітрилу протягом 60 хвилин. Потім здійснюють різкий перехід на 70 % ацетонітрил протягом 1 хвилини, і елюювання продовжують протягом 19 хвилин в ізократичних умовах, а потім повертають на початкові умови. Білковий матеріал, що елююється, виявляють шляхом вимірювання зміни абсорбції при 214 нм з використанням детектора на основі фотодіодної матриці Waters 996. Автоматично збирають фракції 0,5 мл. Ацетонітрил випаровують з використанням концентратора Speed Vac Concentrator (Savant). 11. Масова спектрометрія. Аналізи шляхом мас-спектрометрії здійснюють в Timone proteomic plateau (School of Pharmacy, Marseilles, France). Мас-спектри типу MALDI (мас-спектри, одержані при спектрометрії з лазерною іонізацією і десорбцією з матриці) одержані на спектрометрі Ettan Maldi-Tof Pro (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) в лінійному режимі позитивних іонів з відкладеною екстракцією. Зразки піддають співкристалізації з 5 мг/мл розчином -ціано-4-гідроксикоричної кислоти на підкладці для МАЛДІ за допомогою методу висушування краплі. Спектри реєструють з підсилювальним потенціалом 20 кВ і потужністю лазера, встановленою на мінімальний рівень для досягнення хорошого сигналу. Калібрування спектрів здійснюють в зовнішньому режимі шляхом реєстрації для стандартної суміші пептидів з відомими масами (Pepmix4, Laserbiolabs, Nice, France). Для деяких зразків, які складно кристалізуються, здійснюють співкристалізацію з використанням розчину 2,5-дигідроксибензойної кислоти. 12. Секвенування за Едманом. Цей спосіб заснований на реакції вільної кінцевої аміногрупи білка з фенілізотіоціанатом (C6H5N=C=S). Дана циклічна сполука здійснює нуклеофільну атаку в основному середовищі на перший амінокислотний залишок білка. Фенілтіокарбамільну (РТС) похідну пептиду потім відщеплюють шляхом гідролізу. Одержують анілінотіазолінон (ATZ) першої амінокислоти і білок без цієї першої амінокислоти. ATZ-амінокислоту потім перетворюють на фенілтіогідантоін(РТН) амінокислоту. Послідовно одержувані РТН-амінокислоти розділяють і ідентифікують за допомогою ОФВЕРХ шляхом вимірювання абсорбції при 280 нм і зіставлення часу елюювання. Цикл реакцій можуть повторювати, що приводить до одержання білкової послідовності. 13. Випадковий мутагенез. Культуру 14 мл штаму L14, що інкубується протягом 24 годин при 37 °C, розділяють на сім 2 мл пробірок, і пробірки потім центрифугують при 5800g протягом 10 хвилин. Клітинні осідання двічі промивають 2 мл 0,1 М циторатного буфера (лимона кислота 21 мг/мл, NAOH 8,8 мг/мл, рН 5,5) і потім суспендують в цитратному буфері, що містить збільшуючу концентрації N-метилN’-нітро-N-нітрозогуанідину (NG), що є сильним мутагеном. Таблиця 2 Об'єми розчинів, що застосовуються при знесолювані на Sep-Pak Пробірки [NG] кінцева в мкг/мл 1(Т0) 0 2 25 12 3 50 4 100 5 200 6 400 7 1000 UA 101158 C2 5 10 15 Пробірки потім інкубують протягом 30 хвилин при 37 °C, а потім центрифугують протягом 10 хвилин при 5800g. Осад промивають 0,1 М фосфатним буфером (КН2РО4 13,6 мг/мл, NAOH 2,32 мг/мл, рН 7) і потім суспендують в рідкому середовищі BHI-YH. 14. Знесолювання на картріджах Sep-Pak® C18 (Waters). Залежно від моделі ці колонки знаходяться у формі шприців, в яких введена фаза, або мініколонок, фіксованих на кінці шприца. Потік буферів забезпечується перистальтичним насосом. На першій стадії колонку врівноважують шляхом пропускання Н 2О і потім CH3CN, і, нарешті, Н2О, що містить 0,05 % TFA (трифтороцтова кислота). Потім наносять зразок, що заздалегідь підкислений 0,05 % TFA. Елюювання здійснюють в три стадії шляхом послідовного додавання Н2О - 0,05 % TFA, 40 % CH3CN-0,05 % TFA і CH3CN-0,05 % TFA. Таким чином, збирають три фракції: фракцію, відповідну білку, що не утримується в колонці, і солям (фракція NR), фракцію, що містить білок, розведений 40 % CH3CN (фракція 40 % ACN), і фракцію, що містить білок, розведений 100 % CH3CN (фракція 100 % ACN). Розчинник випаровують з використанням концентратора Speed Vac або роторного випарника залежно від об'єму. В Таблиці 3 вказано об'єми кожного розчину, що застосовується для знесолювання фракцій, одержаних після очищення RumC (дивися Результати і обговорення). Ці об'єми залежать від об'єму фази Sep-Pak. Таблиця 3 Об'єми розчинів, що застосовуються для Sep-Pak залежно від додатків Об'єм: Елюювання SN 9-17 12 мл 20 мл 20 мл 30 мл 30-35 мл 30-35 мл 20 мл 20 мл Фаза Н2О CH3CN Н20-0,05 % TFA Зразок Н2О - 0,05 % TFA 40 % CH3CN-0,05 % TFA CH3CN-0,05 % TFA Знесолення Активна фракція CM 1 мл 5 мл 5 мл 5 мл 50 мл 15 мл 6 мл 4 мл 20 25 30 35 40 45 15. Тест температурної стійкості. Аліквоти фракції, що міститьІЧитС, нагрівають, кожен до різної температури, з використанням нагріваючого блоку протягом 5 або 15 хвилин, і потім зберігають при 4 °C. їх потім піддають тестуванню на антимікробну активність. 16. Тест стійкості до рН. Аліквоти фракції, що містить RumC, розбавляють приблизно вдесятеро в бажаному буфері. Після 10 хвилин при кімнатній температурі кожен розчин наносять в фільтруючий модуль Vivaspin, 500 3 кДа і потім центрифугують відповідно до рекомендацій виробника. Буфер додають до фракції, що утримується Vivaspin 500, і фільтруючий модуль, потім повторно центрифугують. Об'єм кожної фракції, що утримується Vivaspin 500 3 кДа, тобто, що містить RumC, доводять буфером до відповідного початкового об'єму. Різні фракції потім зберігають при 4 °C, а потім піддають тестуванню на антимікробну активність. Фільтри Vivaspin 500 3 кДа не витримують значення рН більше 9. Таким чином, тестували тільки буфери з кислим або нейтральним рН. Склад є наступним: буфер рН 2: 50 мМ КСІ -13 мМ НСІ буфер рН 4,4:0,2 М рН 4,4 розчин ацетату натрію буфер рН 7: 50 мМ КН2РО4-39 мМ NAOH. Результати і обговорення 1. Очищення RumC з вмісту сліпої кишки Хоча штам Ruminococcus gnavus E1 можна культивувати, продукції RumC in vitro в тестованих культуральних умовах не відбувається. Для очищення RumC, таким чином, необхідно працювати, використовуючи вміст сліпої кишки моноксенних щурів з штамом Е1, або створювати штам мутанта R. gnavus, що здатний продукувати RumC in vitro (див. розділ 2). 1.1. Розведення вмісту сліпої кишки моноксенних щурів. Перша стадія, складається з розведення вмісту сліпої кишки PBS (фізіологічним розчином, забуференним фосфатом). 13 UA 101158 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1.2. Видалення клітинного дебрису. Під час другої стадії очищення бактерії, клітинний дебрис і харчові залишки видаляють шляхом центрифугування вмісту сліпої кишки. 1.3. Концентрація. Розчин потім концентрують на системі Amicon® Ultra-15 PL-5, а потім наносять на колонку для молекулярного скринінгу. 1.4. Тест на антимікробну активність. Всі одержані фракції тестували на штамі С. perfringens CPA, що підтвердило присутність речовини, що має активність проти С. perfringens, у вмісті сліпої кишки моноксенних щурів. Негативний контроль виконували на вмісті сліпої кишки аксенних щурів (без мікроорганізмів). Не виявлено ніякої активності проти С. perfringens. Речовина проти С. perfringens представлена у вмісті сліпої кишки моноксенних щурів, і, таким чином, дійсно є специфічною відносно R. gnavus E1. Потім, за кожним тестом очищення слідували тести на активність проти С. perfringens. На першій стадії досліджували тільки присутність або відсутність активності, слідкуючи за тим, щоб негативні результати не були пов'язані з порогом чутливості способу. Кількісні тести здійснювали на другій стадії, коли утвердили певний протокол визначення. 1.5. Молекулярний скринінг на колонці Sephadex G-75. Молекулярний скринінг здійснювали на колонці Sephadex G-75 (2,4×187 см). Елюювання контролювали шляхом прочитування абсорбції при 280 нм для кожної з 600 зібраних 2-мл фракцій. Тести на антимікробну активність здійснювали на фракціях, заздалегідь концентрованих з використанням Microcon® YM-3. Фракції 325-358 виявилися активними проти С. perfringens, і їх об'єднували з утворенням нової активної фракції GF (затемнена площа на Фіг. 1). Контроль, що проводиться на вмісті сліпої кишки аксенних щурів, привів до профілю елюювання, порівнянного з профілем, ожержаним на вмісті сліпої кишки моноксенних щурів, але ніякої активності проти С. perfringens не виявили. 1.6. Оцінка розміру RumC. Для оцінки розміру RumC, присутнього в активній фракції GF, стандартні білки з відомими молекулярними масами наносили на ту ж саму колонку Sephadex G-75, і вимірювали відповідні об'єми, що елюювалися (Фіг. 2А). Потім будували калібрувальну криву, що визначає пропорційність між логарифмом молекулярної маси (log (MM)) речовини і об'ємом, що елююється (Ve) (Фіг. 2В). При середньому об'ємі, що елююється 683 мл, антимікробна речовина не потрапляє в діапазон вибраних стандартних білків, але екстраполяція його молекулярної маси може складати за оцінками приблизно 5200 Да. 1.7. Хроматографія на катіонообмінній смолі. З використанням активної фракції GF здійснювали катіонообмінну хроматографію на колонці з карбоксиметилом (CM) - Spherogel™ за допомогою системи ВЕРХ. Елюювання здійснювали в градієнті концентрації NaCI при рН 5, і контролювали при 214 нм (Фіг. 3). Активність виявлена між 32 і 38 хвилинами (активна в CM фракція), що відповідає концентрації NaCI від 0,2 до 0,3 М. Цей спосіб дає можливість усунення з фракції домішок, що не утримуються, особливо всіх жовтих пігментів. Аналіз активної фракції CM шляхом мас-спектрометрії продемонстрував, що вона містить єдиний пептид з масою приблизно 4200 Да (результат не представлений). Дану фракцію піддавали N-кінцевому секвенуванню. Таким чином, визначили перші 11 амінокислот: AGVIX(N/S) GTXAV (SEQ ID No. 10). Ця послідовність не демонструє яку-небудь значну гомологію з відомими білками. Секвенування також виявило дві мінорні послідовності. Зворотньо-фазова ВЕРХ. Одержані різні піки абсорбції при 214 нм. Активність виявлена в двох фракціях, позначених як а (або "подвійний пік") і b (або "одиничний пік") (Фіг. 4А). Аналіз цих двох фракцій шляхом мас-спектрометрії виявив присутність трьох основних пептидів, відповідні молекулярні маси яких складають від 4230 до 4460 Да (Фіг. 4В і 4С). Очищення RumC з вмісту сліпої кишки знов здійснювали з використанням трьох хроматографій, тобто молекулярного скринінгу, катіонообмінної хроматографії і зворотньофазової хроматографії. Одержані профілі елюювання порівнянні з профілями для перших тестів. Таким чином, спосіб очищення RumC є відтворним і, отже, може застосовуватися. Схема, узагальнювальна очищення RumC з вмісту сліпої кишки, представлена на Фіг. 5. 1.9. Виходи і коефіцієнти очищення. 14 UA 101158 C2 5 10 Як прийнято, кількість умовних одиниць активності (УОА), присутніх в розчині, визначають як зворотну величину від останнього активного розведення. Таким чином, тест на активність проти С. perfringens здійснювали на серійних розведеннях (двократних) кожної активної фракції, одержаної після очищення. Коефіцієнт очищення визначають шляхом порівняння питомої активності, вираженої як УОА/мг білка для кожної фракції. Оцінку кількості білка в різних фракціях проводили шляхом 0,1 % вимірювання їх абсорбції при 280 нм з використанням коефіцієнта масової екстинкції Е , рівного 1,8. У Таблиці 4 приведені виходи активності і коефіцієнти очищення для стадій протоколу очищення RumC з вмісту сліпої кишки моноксенних щурів. Таблиця 4 Виходи активності і коефіцієнти очищення в процесі отримання RumC in vivo з 10 г вмісту сліпої кишки моноксенних щурів. Фракція Гомогенат SN Концентрований SN Активна в GF Активна в CM Подвійний пік Одиничний пік 15 20 25 30 35 40 45 V(мл) 39 32 14 66 1-1,5 1-1,5 1-1,5 анти-СрА А. (УОА) 780 375 350 205 170 50 50 m білка (мг) SA (УОА/мг) Вихід F очищ. н.в. 375 270 20 0,135 н.в. н.в. 100 % 48 % 45 % 26 % 22 % 13 % 1 1.3 10 1200 1 1,3 10,3 1260 н.в. = не визначали V: загальний об'єм фракції в мл анти-СрА А.: активність проти С. perfringens, тобто загальна кількість одиниць активності, що міститься у фракції m білка: маса білка у фракції, виражена в мг SA: питома активність проти С. perfringens в УОА/мг SA = анти-СрА А./m білка Вихід: вихід активності для очищення Вихід = 100  анти -СрА А. тестуюча фракція/анти-СрА А.гомогенат F очищт.: коефіцієнт очищення F очищ. = SAтестуюча фракція/SASN 1.10. Визначення пептидної послідовності Хоча молекулярні маси продуктів, представлені у фракціях "подвійний пік" і "одиничний пік" різні, секвенування за Едманом дає можливість виявити одну основну N-кінцеву послідовність: AGXIXSGSVAV (SEQ ID No. 3). У двох розглянутих фракціях також виявлена мінорна послідовність з 17 залишків: AGPAYXVGYXGNNGAVT (SEQ ID No. 2). 2. Створення штаму мутанта шляхом випадкового мутагенезу. Спосіб, що застосовується являв собою продукт випадкового мутагенезу штаму R. gnavus L14. Даний штамом є спонтанний мутант R. gnavus E1, який втратив здатність продукувати RumA in vitro, але зберіг здатність продукувати RumC in vivo. Цей штам піддавали дії могутнього алкілюючого агента, що є N-метил-N'-нітро-N-нітрозогуанідин (NG). Таким чином, аліквоти тієї ж самої культури штаму L14 піддавали дії зростаючих концентрацій NG (від 0 до 1000 мкг/мл). Після обробки різні клітинні суспензії розбавляли і потім наносили на чашки Петрі. Підрахунок колоній після вирощування дає можливість оцінити концентрацію живих клітин в різних суспензіях. Шляхом порівняння з концентрацією в контролі (пробірка 1, без обробки NG) може бути визначений рівень смертності у разі кожної обробки. З'ясувалося, що обробка NG була ефективною: рівень смертності складає від 50 % до 99 % і збільшуються з концентрацією. Для того, щоб виявити відповідний(і) мутант(и), майже 860 колоній, випадково відібраних з клонів, які виживали після різних обробок, переклонували на доповнене трипсином агарове середовище і потім піддавали випробуваню на активність проти С. perfringens. Виявлено, що 83 клони є потенційними продуцентами речовини, активної проти С. perfhngens, в агаровому середовищі у присутності трипсину. Серед них для ретельнішої характеристики відібрані 20. 15 UA 101158 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На першій стадії мутації, вражані клони, за допомогою ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції) перевіряли для того, щоб переконатися в тому, що вони не відновлюють хромосомну організацію в rumА. 20 Відібраних клонів потім піддавали випробуванням на активність проти Clostridium perfringens в агаровому середовищі і в рідкому середовищі, в присутності або у відсутність трипсину. На доповненому трипсином агаровому середовищі ореоли інгібування присутні приблизно навколо семи з двадцяти тестованих клонів. При цьому на агаровому середовищі без трипсину жоден з клонів не продукував яку-небудь речовину, активну проти С. perfringens: таким чином, трипсин завжди є важливим для синтезу бактериоцину. Жодна з речовин, що має активність проти С. perfringens, не продукується клонами, вирощеними в рідкому середовищі, навіть у присутності трипсину. 3. Очищення з використанням штаму мутанта. Тести продукції і очищення здійснювали на одному з семи продукуючих клонів, мутант 9-17. Тести здійснювали на м'якому агарі з різними концентраціями клітин і трипсину. Після вирощування мутанта агар розтирали і потім центрифугували для одержання супернатанту (SN 9-17). Даний супернатант потім тестували на активність проти С. perfringens і виявили, що він є активним. Аналіз шляхом мас-спектрометрії здійснювали на цьому активному супернатанті (Фіг. 7А). 3.1. Хроматографія на катіонообмінній смолі з використанням системи РХШД. Перед здійсненням іонообмінної хроматографії зразок потребує знесолювання. Перші випробування продемонстрували, що знесолювання SN 9-17 на Amicon є не достатнім. Таким чином, знесолювання зразка на Sep-Pak слід розглядати, як попередню стадію очищення. Елюювання білків з Sep-Pak здійснюють за допомогою 40 % розчину ацетонітрилу. Після випаровування на роторному випарнику розчин врівноважують при значенні рН 5 шляхом його розведення в 20 мМ буфера ацетату натрію з рН 5. З 65 мл SN 9-17 одержують 50 мл знесолених SN 9-17, урівноважених при значенні рН 5, і наносять на карбоксиметилсефарозну катіонообмінну колонку. Здійснюють прогін з градієнтом концентрації від 0 до 0,4 М NaCI протягом 40 хвилин. Активність проти С. perfringens виявляють у фракціях, що елююються з 0,2-0,3 М NaCI, хоча в цих фракціях представлено дуже мало білкового матеріалу, якщо керуватися зміною абсорбції при 280 нм (Фіг. 6). Це вже виявляли під час очищення RumC з вмісту сліпої кишки. Активні фракції об'єднували і потім знесолювали і концентрували на Sep-Pak. Аналіз даної фракції за допомогою мас-спектрометрії ("активна фракція CM") підтверджує значне поліпшення очищення, що забезпечується катіонообмінною хроматографією, і демонструє, що всі домішки мають молекулярну масу менше ніж 2500 Да (Фіг. 7В). 3.2. Молекулярний скринінг фракції CM. Молкулярний скринінг активної фракції CM здійснювали за допомогою системи РХШД на колонці, що дає можливість розділення пептидів, що мають масу менше ніж 10 кДа. Елюювання контролюють шляхом прочитування зміни абсорбції при 280 нм; кількість білкового матеріалу є невеликою, і розділення виявилося незадовільним (не представлено). Проте, зібрані фракції тестували на активність проти С. perfringens. Після скринінгу було виявлено тільки 5 % активності. Таким чином, цей спосіб не підходить для очищення. З іншого боку, активну фракцію ("GF 47-50") аналізували за допомогою мас-спектрометрії, і виявилось, що вона є по суті чистим пептидом з масою 4235 Да (Фіг. 8). 3.3. Фільтрування фракції CM. Ще одну спробу видалити домішки з активної фракції CM зробили з використанням фільтруючих модулів. Оскільки RumC затримується фільтрами 5 кДа (не дивлячись на те, що вони мають дещо меншу молекулярну масу), перший тест здійснили за допомогою фільтрування з використанням модуля Vivaspin 500, що фільтрував, поріг відсікання для якого складає 5 кДа. На жаль, домішки також утримуються фільтром, хоча їх молекулярні маси складають менше 2,5 кДа. Конкретно, аналіз за допомогою мас-спектрометрії не виявив будьякого поліпшення очищення (результати не представлені). Таким чином, зробили другий тест з використанням фільтруючого модуля Microcon, поріг відсікання якого складає 10 кДа. А саме, раніше було виявлено, що Rum, не дивлячись на свою молекулярну масу, , може бути затриманий фільтрами 10 кДа ("R фракція 10 кДа"). Аналіз за допомогою мас-спектрометрії підтвердив попередні результати і дав можливість продемонструвати, що значна частка домішок в неутримуючій фракції, віддалялася (Фіг. 7С). 3.4. Зворотньо-фазова хроматографія фракції R 10 кДа в системі ВЕРХ. 16 UA 101158 C2 5 10 Фракцію R 10 кДа, що містить три піки RumC (4235 Да, 4324 Да і 4456 Да) потім піддавали зворотньо-фазовими ВЕРХ. Швидкість потоку і умови градієнта ідентичні умовам, розробленим для очищення of RumC з вмісту сліпої кишки, і одержаний результат є зіставним: дві різні фракції, являють собою фракцію "подвійного піку" і фракцію "одиничного піку", проявляють активність проти С. perfringens. 3.5. Виходи і коефіцієнт очищення. Для оцінки протоколу очищення здійснювали кількісні тести на активність з використанням двократних серійних розведень кожної активної фракції. Потім розраховували кількість умовних одиниць активності (УОА), що містяться в кожній фракції, і встановлювали вихід очищення (Таблиця 5). Значну втрату активної речовини виявляли на стадіях знесолювання культурального супернатанту, катіонообмінної хроматографії, а потім ще одного знесолювання. Мабуть, що втрата відбувається на стадії катіонообмінної хроматографії, але це не ставить під сумнів придатність протоколу. Таблиця 5 Виходи для очищення RumC з культурального супернатанту мутанта 9-17 Фракція SN9-17 Активна CM Подвійний пік Одиничний пік V(мл) 125 ~3 0,42 0,42 анти-СрА А. (УОА) 1453 300 140 140 Вихід 100 % 21 %  19 % 15 20 25 30 35 40 45 V: загальний об'єм фракції в мл анти-СрА А. (активність проти С. perfringens): загальна кількість одиниць активності, що містяться у фракції, в УОА Вихід = 100анти-СрА А.тестуючафракція/анти-СрА A.SN9-17; виражені в % Інший важливий критерій для оцінки протоколу очищення є демонстрація поліпшення очищення, що забезпечується на кожній стадії. Коефіцієнт очищення визначають шляхом порівняння питомих активностей (УОА/мг білка) на кожній стадії, але для здійснення цього, маса білка, що міститься в кожній фракції, має бути виміряна. Контроль очищення здійснювали за допомогою мас-спектрометрії зважаючи на чутливість цього способу, уникають "споживання" дуже великої кількості біологічного матеріалу. Хоча цей спосіб не є кількісним, поліпшення очищення продемонстроване вельми очевидно. 3.6. Мас-спектрометрія. Фракції "подвійний пік" і "одиничний пік" аналізували за допомогою мас-спектрометрії. Одержані результати ідентичні одержаним для фракцій в результаті очищення з використанням вмісту сліпої кишки: фракція "подвійний пік" містить пептиди 4324 Да і 4456 Да, тоді як фракція "одиничний пік" містить пептид 4235 Да. 3.7. Секвенування. Далі ці фракції секвенували. Для фракції "одиничний пік" одержана послідовність ідентична вже певній послідовності: AGXIXSGSVAV (SEQ ID No. 3). На п'ятому циклі з'являється мінорна послідовність: AGPAY (SEQ ID No. 11). Для фракції "подвійний пік" були виявлені невеликі відмінності: AGXVXSGSTAV (SEQ ID No. 12). Мінорна послідовність ідентична: AGPAY (SEQ ID No. 11). Схема, узагальнення очищення RumC з штаму мутанта, представлена на Фіг. 9. Одержання очищеного RumC в значній мірі спрощене. 4. Характеристика пептидів RumC. 4.1. Антимікробна активність відносно різних штамів. Антимікробну активність RumC тестували відносно різних грам+ і грам- патогенних штамів з використанням на першій стадії концентрованого супернатанту вмісту сліпої кишки моноксенних щурів для штаму R. gnavus E1 (SN CCE1). Потім здійснювали інші тести з двома очищеними фракціями проти штамів, чутливих до SN CCE1. Результати представлені в Таблиці 6. 17 UA 101158 C2 Таблиця 6 Результати тестів активності RumC проти різних патогенних штамів Фракція Штам, що тестується Clostridium perfringens CpA Clostridium perfringens S40 Clostridium sporogenes CIP 79-3 Clostridium acetobutylicum BL75-41 Грам Bacillus cereus TZ 415 + Bacillus cereus K 1231 Bacillus cereus Z 421 Listeria monocytogenes EGDE Listeria monocytogenes Scott A Listeria inocula CIP 80-12 Грам Salmonella enteridis CIP 82-17 Campylobacter jejuni 5 10 15 20 25 30 Антимікробна активність (розмір ореола інгібування) Подвійний Одиничніий SN CCE1 пік пік + (2 мм) + (1 мм) + (1 мм) + (2 мм) + (1 мм) + (1 мм) H.B. H.B. H.B. H.B. + (2 мм) + (5 мм) + (3 мм) H.B. H.B. H.B. H.B. + (1 мм) + (1 мм) + (1 мм) H.B. H.B. + (1 мм) + (5 мм) H.B. H.B. Всі тестовані штами Clostridium perfringens чутливі до пептиду RumC. 4.2. Антимікробна ефективність відносно С. Perfringens Антимікробну ефективність RumC також визначали шляхом оцінки мінімальної інгібуючої концентрації для кожної очищеної фракції RumC "In vivo" і порівняння її з концентрацією метронідазолу, що є референсним антибіотиком, що застосовується проти С. perfringens. Для виконання цього готували подвійні серійні розведення фракцій "подвійний пік" і "одиничний пік" (розведення до 1/512). Тести активності проти С. perfringens проводили з використанням цих різних розчинів і також розчинів метронидазолу з різними концентраціями (результати не представлені). В результаті даного тесту мінімальна концентрація, що інгібірує, для метронідазолу склала 25 мкг/мл. Цей результат узгоджується з результатами, раніше одержаних Dabard et al. (Dabard et al., Appl. Environ. Microbiol., 67, 4111-4118, 2001). Відносно фракцій "подвійний пік" і "одиничний пік" активні тільки концентровані розчини (розведення 1). Хоча концентрація цих розчинів точно не відома, за допомогою секвенування за Едманом можна оцінити, що вона знаходиться на рівні приблизного 40 мкг/мл. Таким чином, антимікробна ефективність RumC відносно С. perfringens порівнянна з ефективністю відносно метронідазола. 4.3. Стійкість до температури. Перші попередні тести стійкості Rum до нагрівання здійснювали шляхом інкубації однієї і тієї ж кількості пептиду протягом 15 хвилин при різних температурах. Обробка протягом 15 хвилин при 75 °C не впливала на активність двох фракцій RumC "in vivo" (фракції "подвійний пік" і "одиничний пік"). Проте, при 100 °C пептид повністю інактивувався протягом 15 хвилин. Повністю дані випробівання здійснювали з використанням зразків RumC, очищених з культурального супернатанту штаму 9-17. Час інкубації при різних температурах складав 5 хвилин. Час інкубації при 100 °C складав 15 хвилин. Перша тестована темпратура складала 80 °C. Перше випробування проводили з активною фракцією CM, що є заздалегідь очищеною фракцією, що містить три пептиди. На відміну від фракцій "подвійний пік" і "одиничний пік" активна фракція CM витримує обробку протягом 15 хвилин при 100 °C. Потім тестували фракцію GF 47-50. Дана чиста фракція, що містить тільки пептид 4235 Да, чутлива до обробки протягом 15 хвилин при 100 °C. Вона також чутлива до обробки протягом 5 хвилин при 90 °C (Таблиця 7). 18 UA 101158 C2 Таблиця 7 Звідна таблиця тестів стійкості до температури Умови інкубіції “in vivo” RumC Температура Час 50 °C 75 °C 80 °C 85 °C 90 °C 95 °C 100 °C 15 хв 15 хв 5хв 5 хв 5хв 5хв 15 хв "in vitro" RumC Активна Подвійний пік Одиничний пік GF 47-50 фракція CM C С / / С С / / / / С / / / C / / / C ч / / C / ч ч C Ч C = стійкий; ч = чутливий; / = не тестували 5 4.4. Стійкість до рН. Стійкість до рН пептидів, представлених в активній фракції CM, також тестували при рН 2, рН 4,4 і рН 7. Виявлену прирН 2 активність порівнювали з активність, виявленою при рН 7. Після інкубації протягом 24 годин при 4 °C при рН 2 не виявили ніякої втрати активності. Таким чином, пептиди згідно даного винаходу стійкі до кислого рН і переважно підходять для застосування в годуванні тварин або в області лікарських засобів. 19 UA 101158 C2 20 UA 101158 C2 21 UA 101158 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 35 1. Пептид, що має антимікробну активність, який відрізняється тим, що включає пептид, вибраний з наступних пептидів: - пептид, що має послідовність SEQ ID No. 1, - пептид, що має послідовність SEQ ID No. 2. 2. Пептид за п. 1, який відрізняється тим, що додатково включає пептид, що має послідовність SEQ ID No. 3. 3. Пептид за п. 1, який відрізняється тим, що включає пептид, вибраний з пептидів, що мають послідовність SEQ ID No. 4, 5 або 6. 4. Пептид за будь-яким з пп. 1-3, який відрізняється тим, що має молекулярну масу від 4000 до 4600 Да, що визначається за допомогою мас-спектрометрії. 5. Пептид за будь-яким з пп. 1-4, який відрізняється тим, що виділений з штаму мутанта Ruminococcus gnavus. 6. Пептид за п. 5, який відрізняється тим, що виділений з штаму Ruminococcus gnavus, депонованого в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) CNCM I-3705. 7. Полінуклеотид, що кодує пептид, який має антимікробну активність, який відрізняється тим, що він включає полінуклеотид, вибраний з: полінуклеотиду, що відповідає будь-якій з послідовностей SEQ ID No. 7, 8 або 9, полінуклеотиду, який гібридизується з полінуклеотидом, що відповідає будь-якій з послідовностей SEQ ID No. 7, 8 або 9, полінуклеотиду, який кодує поліпептид за будь-яким з пп. 1-6, де селективна гібридизація здійснюється в помірно жорстких, і переважно, у дуже жорстких умовах. 8. Експресійна касета, яка відрізняється тим, що вона включає у напрямку транскрипції: промотор, який є функціональним в організмі-хазяїні, полінуклеотид за п. 7, і термінаторну послідовність, яка є функціональною в тому ж самому організмі-хазяїні. 9. Вектор, що включає полінуклеотид за п. 7 і/або експресійну касету за п. 8. 10. Організм-хазяїн, що є будь-яким вищим або нижчим одноклітинним або багатоклітинним організмом, вибраним зокрема з бактерій, дріжджів і грибів, і трансформований полінуклеотидом за п. 7, експресійною касетою за п. 8 і/або вектором за п. 9. 11. Штам Ruminococcus gnavus, депонований в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) під номером CNCM I-3705, який продукує пептид за будь-яким з пп.1-6. 12. Білкова суміш або сусло ферментації, які можуть бути одержані за допомогою організмухазяїна за п. 10 або штаму за п. 11. 22 UA 101158 C2 5 10 15 20 13. Композиція, що містить пептид за будь-яким з пп. 1-6, організм-хазяїн за п. 10, штам за п. 11, сусло ферментації організму-хазяїна за п. 10 або сусло ферментації штаму за п. 11. 14. Композиція за п. 13, яка знаходиться в рідкій формі або порошкоподібній формі. 15. Харчова добавка, що містить пептид за будь-яким з пп. 1-6, організм-хазяїн за п. 10, штам за п. 11, сусло ферментації організму господаря за п. 10 або сусло ферментації штаму за п. 11. 16. Харчова добавка за п. 15, яка знаходиться в рідкій формі або порошкоподібній формі. 17. Корм для тварин, який відрізняється тим, що він включає харчову основу для тварин і харчову добавку за п. 15 або 16. 18. Застосування пептиду за будь-яким з пп. 1-6, організму-хазяїна за п. 10, штаму за п. 11, сусла ферментації організму-хазяїна за п. 10 або сусла ферментації штаму за п. 11, для виготовлення лікарського засобу. 19. Застосування пептиду за будь-яким з пп. 1-6, організму-хазяїна за п. 10, штаму за п. 11, сусла ферментації організму-хазяїна за п. 10 або сусла ферментації штаму за п. 11, для виготовлення харчової добавки. 20. Застосування пептиду за будь-яким з пп. 1-6, організму-хазяїна за п. 10, штаму за п. 11, сусла ферментації організму-хазяїна за п. 10 або сусла ферментації штаму за п. 11, для виготовлення корму для тварин. 21. Застосування за п. 18 для виготовлення лікарського засобу або харчової добавки для профілактики або лікування некротичного ентериту у свиней або свійської птиці. 22. Застосування за п. 18 для виготовлення лікарського засобу або харчової добавки для профілактики або лікування шлунково-кишкових захворювань у людини. 23 UA 101158 C2 24 UA 101158 C2 25 UA 101158 C2 26 UA 101158 C2 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 27