Комбіновані композиції ад’ювантів

1. Антигенна композиція, яка містить вибраний антиген з патогенних вірусу, бактерії, гриба або паразита, або з ракової клітини, або пухлинної клітини, або з алергену, або з аутологічної молекули і ефективну ад'ювантну (імуностимулюючу) кількість комбінації (1) аміноалкілглюкозамінфосфатної сполуки (AGP) або її по хідного, або аналога і (2) цитокіну або лімфокіну або агоніста зазначеного цитокіну або лімфокіну, де ця комбінація ад'ювантів підсилює імунну реакцію у хребетного хазяїна на зазначений антиген. 2. Антигенна композиція за п. 1, де вибраний антиген є поліпептидом, пептидом або фрагментом, виробленим з білка. 3. Антигенна композиція за п. 1, де AGP використовують у формі стабільної емульсії типу "масло у воді". 4. Ан тигенна композиція за п. 1, де цитокін або лімфокін вибраний із групи, що складається з гранулоцитарно-макрофагального колонієстимулюючого фактора та інтерлейкіну-12. 2 (19) 1 3 79426 4 30. Спосіб збільшення здатності антигенної композиції, яка містить вибраний антиген з патогенних вірусу, бактерії, гриба або паразита, індукувати імунну реакцію хребетного хазяїна, що передбачає введення зазначеному хазяїну антигенної композиції за п. 9. 31. Спосіб збільшення здатності антигенної композиції, яка містить антиген ВІЛ, індукувати імунну реакцію хребетного хазяїна, що передбачає введення зазначеному хазяїну антигенної композиції 15. Антигенна композиція за п. 14, де пептид ВІЛ є за п. 12. пептидом, що має амінокислотну послідовність: 32. Спосіб збільшення здатності антигенної композиції, яка містить антиген ВІЛ, індукувати імунну реакцію хребетного хазяїна, що передбачає введення зазначеному хазяїну антигенної композиції 16. Антигенна композиція за п. 14, де пептид ВІЛ є за п. 26. пептидом, що має амінокислотну послідовність: 33. Спосіб за п. 32, де вибрані антигени є пептидами ВІЛ, вибраними з групи, яка складається з пептидів, що мають амінокислотну послідовність: 17. Антигенна композиція за п. 14, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: 18. Антигенна композиція за п. 14, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: 19. Антигенна композиція за п. 14, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: 20. Антигенна композиція за п. 12, де AGP використовують у формі стабільної емульсії типу "масло у воді". 21. Антигенна композиція за п. 12, де цитокін або лімфокін вибраний з групи, яка складається з гранулоцитарно-макрофагального колонієстимулюючого фактора та інтерлейкіну-12. 22. Антигенна композиція за п. 21, де цитокін або лімфокін є гранулоцитарно-макрофагальним колонієстимулюючим фактором. 23. Антигенна композиція за п. 22, де AGP використовують у формі стабільної емульсії типу "масло у воді". 24. Антигенна композиція за п. 21, де цитокін або лімфокін є інтерлейкіном-12. 25. Антигенна композиція за п. 24, де AGP використовують у формі стабільної емульсії типу "масло у воді". 26. Антигенна композиція за п. 12, яка додатково містить розріджувач або носій. 27. Антигенна композиція за п. 26, де AGP використовують у формі стабільної емульсії типу "масло у воді". 28. Антигенна композиція за п. 12, де AGP є 529. 29. Спосіб збільшення здатності антигенної композиції, яка містить вибраний антиген з патогенних вірусу, бактерії, гриба або паразита, індукувати імунну реакцію хребетного хазяїна, що передбачає введення зазначеному хазяїну антигенної композиції за п. 1. 34. Спосіб за п. 33, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: 35. Спосіб за п. 33, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: 36. Спосіб за п. 33, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: 37. Спосіб за п. 33, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: 38. Спосіб за п. 33, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: 39. Спосіб збільшення здатності антигенної композиції, яка містить вибраний антиген з патогенних вірусу, бактерії, гриба або паразита, індукувати цитотоксичні Т-лімфоцити у хребетному хазяїні, 5 79426 6 що передбачає введення зазначеному хазяїну клітини, індукувати терапевтичний або профілакантигенної композиції за п. 1. тичний антираковий ефект у хребетного хазяїна, 40. Спосіб збільшення здатності антигенної компощо передбачає введення зазначеному хазяїну зиції, яка містить вибраний антиген з патогенних антигенної композиції, яка містить зазначений равірусу, бактерії, гриба або паразита, індукувати ковий антиген або зв'язаний з пухлиною антиген з цитотоксичні Т-лімфоцити у хребетному хазяїні, ракової клітини або пухлинної клітини, і ефективну що передбачає введення зазначеному хазяїну ад'ювантну (імуностимулюючу) кількість комбінації антигенної композиції за п. 9. (1) AGP, або її похідного, або аналога і (2) цитокіну 41. Спосіб збільшення здатності антигенної компоабо лімфокіну, або агоніста зазначеного цитокіну зиції, яка містить антиген ВІЛ, індукувати цитотокабо лімфокіну. сичні Т-лімфоцити у хребетному хазяїні, що пе50. Спосіб збільшення здатності антигенної компоредбачає введення зазначеному хазяїну зиції, яка містить вибраний алерген, пом'якшува ти антигенної композиції за п. 12. алергійну реакцію у хребетному хазяїні, що перед42. Спосіб збільшення здатності антигенної компобачає введення зазначеному хазяїну антигенної зиції, яка містить антиген ВІЛ, індукувати цитотоккомпозиції, яка містить зазначений алерген і ефексичні Т-лімфоцити у хребетному хазяїні, що петивну ад'ювантн у (імуностимулюючу) кількість редбачає введення зазначеному хазяїну комбінації (1) AGP, або її похідного, або аналога і антигенної композиції за п. 26. (2) цитокіну або лімфокіну, або агоніста зазначено43. Спосіб за п. 42, де вибрані антигени є пептиго цитокіну або лімфокіну. дами ВІЛ, вибраними з групи, яка складається з 51. Антигенна композиція, яка містить вибраний пептидів, що мають амінокислотну послідовність: антиген з молекули або її частини, що представляє молекулу або її частину, яка продукується хазяїном небажаним чином, у небажаній кількості або місці розташування, щоб зменшува ти такий небажаний ефект за допомогою включення ефективної ад'ювантної (імуностимулюючої) кількості комбінації (1) AGP, або її похідного, або аналога і (2) цитокіну або лімфокіну, або агоніста зазначеного цитокіну або лімфокіну. 52. Антигенна композиція за п. 51, де вибраний антиген є поліпептидом, пептидом або фрагментом, виробленим з білка-попередника амілоїду або антитіла до нього. 53. Антигенна композиція за п. 52, де вибраний антиген є пептидом Ab , який є внутрішнім фрагментом з 39-43 амінокислот білка-попередника амілоїду, або фрагментом пептиду Ab . 44. Спосіб за п. 43, де пептид ВІЛ є пептидом, що 54. Антигенна композиція за п. 53, де вибраний має амінокислотну послідовність: антиген є пептидом Ab , що має амінокислотну послідовність: 45. Спосіб за п. 43, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: 46. Спосіб за п. 43, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: 47. Спосіб за п. 43, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: 48. Спосіб за п. 43, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: 49. Спосіб збільшення здатності антигенної композиції, що містить раковий антиген або зв'язаний з пухлиною антиген з ракової клітини або пухлинної 55. Антигенна композиція за п. 54, де AGP є 529. 56. Спосіб збільшення здатності антигенної композиції, яка містить вибраний антиген з молекули або її частини, що представляє молекулу або її частину, яка продукується хазяїном небажаним чином, у небажаній кількості або місці розташування, зменшувати такий небажаний ефект за допомогою включення ефективної ад'ювантної (імуностимулюючої) кількості комбінації (1) AGP, або її по хідного, або аналога і (2) цитокіну або лімфокіну, або агоніста зазначеного цитокіну або лімфокіну. 57. Спосіб збільшення здатності антигенної композиції запобігати або лікувати захворювання, що характеризується відкладенням амілоїду у хребетного хазяїна, що передбачає введення зазначеному хазяїну поліпептиду, пептиду або фрагмента, вироблених з білка-попередника амілоїду або антитіла до нього, і ад'ювантної (імуностимулюючої) кількості комбінації (1) AGP, або її похідного, або аналога і (2) цитокіну або лімфокіну, або агоніста зазначеного цитокіну або лімфокіну. 7 79426 8 58. Спосіб за п. 57, де вибраний антиген є пепти62. Ад'ювантна композиція за п. 61, де AGP використовують у формі стабільної емульсії типу "масдом Ab , який є внутрішнім фрагментом з 39-43 ло у воді". амінокислот білка-попередника амілоїду, або фра63. Ад'ювантна композиція за п. 61, де цитокін або гментом пептиду Ab . лімфокін вибрані з групи, що складається з грану59. Спосіб за п. 58, де вибраний антиген є пептилоцитарно-макрофагального колонієстимулюючодом Ab , що має амінокислотну послідовність: го фактора та інтерлейкіну-12. 60. Спосіб за п. 59, де AGP є 529. 61. Ад'ювантна композиція, яка містить комбінацію (1) аміноалкілглюкозамінфосфатної сполуки (AGP), або її похідного, або аналога і (2) цитокіну або лімфокіну, або агоніста зазначеного цитокіну або лімфокіну. Даний винахід відноситься до застосування аміноалкілглюкозамінфосфатної сполуки, або її похідного, або аналога у комбінації з цитокіном або лімфокіном, зокрема гранулоцитарномакрофагальним колонієстимулюючим фактором або інтерлейкіном-12, як форми (композиції) ад'юванту в антигенній або імуногенній композиції для посилення імунної реакції хребетного хазяїна на вибраний антиген. Імунна система використовує різні механізми для боротьби з патогенами. Однак не всі з цих механізмів обов'язково активуються після імунізації. Захисний імунітет, який індукується імунізацією, залежить від здатності імуногенної композиції індукувати придатну імунн у реакцію для протистояння патогену або елімінації патогену. В залежності від патогену це може вимагати клітинноопосередкованої та/або гуморальної імунної реакції. Існуючою парадигмою у відношенні ролі хелперних Т-клітин в імунній реакції є те, що Т-клітини можуть бути підрозділені на субпопуляції на основі цитокінів, які вони продукують, і що індивідуальний профіль цитокінів, який спостерігається у цих клітинах, визначає їх функцію. Ця модель Т-клітин містить у собі дві головні субпопуляції: ТН-1клітини, що продукують інтерлейкін-2 (IL-2), і гама інтерферон, що збільшують як клітинну, так і гуморальну (у вигляді антитіл) імунні реакції; і ТН-2клітини, що продукують інтерлейкін-4, інтерлейкін5 і інтерлейкін-10 (IL-4, IL-5 і IL-10, відповідно), які збільшують гуморальні імунні реакції [посилання 1 у бібліографії]. Часто є бажаним посилення імуногенної ефективності антигену для одержання більш сильної імунної реакції імунізованого організму і для посилення стійкості хазяїна до агента, що несе антиген. У деяких ситуаціях бажаний зсув імунної реакції від переважно гуморальної (ТН-2) реакції до більш збалансованої клітинної (ТН-1) і гуморальної (ТН-2) реакції. Клітинна реакція містить у собі генерування CD8+ CTL реакції (реакції CD8+цитотоксичних Тлімфоцитів). Така реакція є бажаною для розробки імуногенних композицій проти внутрішньоклітинних 64. Ад'ювантна композиція за п. 61, що додатково містить розріджувач або носій. 65. Ад'ювантна композиція за п. 61, де цитокін або лімфокін є гранулоцитарно-макрофагальним колонієстимулюючим фактором. 66. Ад'ювантна композиція за п. 61, де цитокін або лімфокін є інтерлейкіном-12. 67. Ад'ювантна композиція за п. 61, де AGP є 529. патогенів. Захист проти різних патогенів вимагає сильних мукозних реакцій, високих сироваткових титрів, індукції CTL і сильних клітинних реакцій. Ці реакції не забезпечувались більшістю антигенних препаратів, у тому числі загальноприйнятими субодиничними імуногенними композиціями. Серед таких патогенів знаходиться вірус імунодефіциту людини (ВІЛ). Таким чином, існує потреба у розробці форм антигенних композицій, які здатні генерувати як гуморальну, так і клітинну імунні реакції хребетного хазяїна. Таким чином, метою даного винаходу є використання комбінованих композицій (форм) ад'ювантів в антигенних композиціях, які містять аміноалкілглюкозамінфосфатну сполуку (AGP), або її похідне, або аналог, об'єднані з цитокіном або лімфокіном, зокрема гранулоцитарномакрофагальним колонієстимулюючим фактором (GM-CSF) або інтерлейкіном-12 (IL-12) або агоністом або антагоністом зазначених цитокіну або лімфокіну. Зокрема, AGP є 2-[(R)-3тeтpaдeкaнoїлoкcитeтpaдeкaнoїлaмiнo]eтил-2дeзoкcи-4-O-фocфoнo-3-O-[(R)-3тетрадеканоїлокситетрадеканоїл]-2-[(R)-3тетрадеканоїлокситетрадеканоїламіно]-b-Dглюкопіранозидом, який відомий як 529 (раніше відомий як RC529). Ад'ювант є речовиною, що підсилює імунну реакцію при введенні разом з імуногеном або антигеном. Композицію ад'юванта даного винаходу вводять разом з вибраним антигеном в антигенній або імуногенній композиції. Антигенні композиції даного винаходу підсилюють імунну реакцію хребетного хазяїна на цей вибраний антиген. Вибраний антиген може бути поліпептидом, пептидом або фрагментом, що походить [1] з патогенного вірусу, бактерії, гриба або паразита, або [2] з ракової клітини або пухлинної клітини, або [3] з алергену, так щоб він перешкоджав продукуванню IgE, щоб стримувати алергійні реакції на цей алерген, або [4] з білка-попередника амілоїду для запобігання або лікування захворювання, що характеризується відкладенням амілоїду у хребетного хазяїна. В одному варіанті даного винаходу вибраний 9 79426 10 антиген походить із ВІЛ. Вибраний антиген ВІЛ рма групами, описаними для Фігури 1. може бути білком ВІЛ, поліпептидом, пептидом Фігура 4 зображує амілоїдне навантаження або фрагментом, одержаним із зазначеного білка. лобової частини кори головного мозку у трансгенУ конкретному варіанті даного винаходу антиген них мишах, імунізованих чотирма групами, описаВІЛ є специфічним пептидом. В іншому варіанті ними для Фігури 1. Фігура 5 зображує нейритне навантаження лоданого винаходу вибраний антиген є b-амілоїдним бової частини кори головного мозку у трансгенних пептидом (також названим Αb-пептидом), який є мишах, імунізованих чотирма групами, описаними внутрішнім фрагментом білка-попередника амілоїдля Фігури 1. ду (АРР), що складається з 39-43 амінокислот, Фігура 6 зображує рівні ретроспленіального який утворюється процесінгом АРР ферментами bастроцитозу кори головного мозку у трансгенних і g-секретазами. мишах, імунізованих чотирма групами, описаними AGP може бути присутнім у вигляді водного для Фігури 1. розчину або у вигляді стабілізованої емульсії типу Фігура 7 зображує середні геометричні титри «масло у воді» (стабільної емульсії або SE). У антитіл C4(E9V)-V3 89.6p-пептид ВІЛ-специфічного кращому варіанті даного винаходу емульсія типу IgG у сироватці у двох гр упах собакоголових макак «масло у воді» містить сквален, гліцерин і фосфа(чотири тварини на групу). Тварин групи 1 імунізутидилхолін. У SE-формі AGP змішують з цитокіном вали інтраназально тільки C4(E9V)-V389.6pабо лімфокіном для одержання антигенної компопептидом. Тварин групи 2 імунізували внутрішньозиції перед введенням. Не потрібно, щоб цитокін м'язово C4(E9V)-V3 89.6p-пептидом, приготованим з або лімфокін входили в цю емульсію. У кращому 529 SE і GM-CSF. Стрілки вказують імунізації при варіанті даного винаходу AGP знаходиться у SEтижнях 0,4, 8, 18 і 23. формі. Антигенна композиція може додатково місФігура 8 зображує середні геометричні титри тити розріджувач або носій. Даний винахід відноантитіл у пробах шийково-піхвового лаважу тваситься також до способів для збільшення здатносрин, описаних для Фігури 7. ті антигенної композиції, що містить вибраний Фігура 9 зображує середні геометричні титри антиген [1] з патогенних вірусу, бактерії, гриба або антитіл у пробах назальних промивань тварин, паразита, щоб індукувати імунну реакцію хребетописаних для Фігури 7. ного хазяїна, або [2] з ракового антигену або пухАд'юванти, цитокіни і лімфокіни є імуномодулинної клітини, щоб індукувати терапевтичну або люючими сполуками, що мають здатність підсилюпрофілактичну антиракову дію у хребетному хазявати розвиток і керувати розвитком і профілем їні, або [3] з алергену, щоб запобігати продукуванімунних реакцій проти різних антигенів, які самі є ню IgE для стримування алергійних реакцій на цей слабоімуногенними. Придатний вибір ад'ювантів, алерген, або [4] з молекули або її частини, що цитокінів і лімфокінів можуть індукувати хороші представляє молекулу або її частину, яка продукугуморальні і клітинні імунні реакції, що не могли б ється хазяїном (аутологічну молекулу) небажаним розвинутись під час відсутності ад'юванта, цитокічином, у небажаній кількості або місці розташуну або лімфокіну. Зокрема, ад'юванти, цитокіни і вання, щоб зменшувати такий небажаний ефект, лімфокіни мають істотні дії у посиленні імунної за допомогою включення ефективної ад'ювантної реакції до субодиничних і пептидних антигенів в (імуностимулюючої) кількості комбінації цитокіну імуногенних композиціях. Їх стимуляторна активабо лімфокіну, зокрема AGP з GM-CSF або IL-12, ність є також корисною для розвитку антигенабо агоністу або антагоністу зазначених цитокіну специфічних імунних реакцій, спрямованих проти або лімфокіну. білкових антигенів. Для різних антигенів, що вимаДалі даний винахід відноситься до способів гають сильних мукозних реакцій, високих сироватзбільшення здатності антигенної композиції, що кових титрів, індукції CTL і сильних клітинних реамістить антиген, вибраний з патогенних вірусу, кцій, комбінації ад'юванта і цитокіну/лімфокіну бактерії, гриба або паразита, індукувати цитотокзабезпечують стимули, що не забезпечуються сичні Т-лімфоцити у хребетному хазяїні за рахунок більшістю препаратів антигенів. включення ефективної ад'ювантної (імуностимуУ численних дослідженнях проводили оцінку люючої) кількості комбінації цитокіну або лімфокірізних форм ад'ювантів у моделях тварин, але в ну, зокрема AGP з GM-CSF або IL-12, або агоністу наш час квасці (гідроксид алюмінію або фосфат або антагоністу зазначеного цитокіну або лімфоалюмінію) є єдиним ад'ювантом, ліцензованим для кіну. широкого застосування у людей. Іншим ад'юванФігура 1 зображує середні геометричні титри том є СтимулонÔ QS-21 (StimulonÔ QS-21) антитіл до Αb1-42-пептиду у трансгенних мишах, (Antigenics Inc., Framingham, ΜΑ [2]). Одна група імунізованих наступним чином: Група 1-Αb1-42ад'ювантів, стабільні емульсії, що складаються з пептид плюс PBS (не показаний); Група 2-Αb1-42різних комбінацій масла або масло-у-воді, приверпептид плюс MPLÔ SE (квадрати); Група 3-Αb1-42нула велику увагу внаслідок їх імунопотенціювапептид плюс MPLÔ SE і GM-CSF (трикутники) ; льної здатності. Ці форми звичайно складаються з Група 4-Αb1-42-пептид плюс 529 SE і GM-CSF (перізних комбінацій метаболізованих або інертних ревернені трикутники). масел, що стабілізують або депонують антиген у Фігура 2 зображує загальні кортикальні рівні місці інфекції. Одним з таких ад'ювантів є неповАР у трансгенних мишах, імунізованих чотирма ний ад'ювант Фрейнда (IFА), що містить у собі мігрупами, описаними для Фігури 1. неральне масло, воду і емульгуючий агент. ПоФігура 3 зображує кортикальні рівні Αb1-42вний ад'ювант Фрейнда (CFA) являє собою IFA пептиду у трансгенних мишах, імунізованих чотиплюс убиті нагріванням мікобактерії. Особливе 11 79426 12 занепокоєння у використанні цих типів ад'ювантів моноцитами. Це є критичним елементом в індукції викликало подразнення, пов'язане з місцем ін'єкції, ТН1-клітин з «ненавчених» (наївних) Т-клітин. Бущо часто є результатом інфільтрації мононуклеало показано, що продукування IL-12 або здатність рних клітин, які викликають гранулематозні пошковідповідати на нього є критичною у розвитку захидження. Таким чином, інші сполуки і форми дослісних ТН1-подібних реакцій, наприклад під час паджуються як потенційні ад'юванти. разитичних інфекцій, особливо лейшманіозу [8], а Однією групою таких сполук є аміноалкілглютакож посиленні клітинно-опосередкованої імунної козамінфосфатні сполуки (AGP), які описані у [Пареакції на антиген з патогенної бактерії або патотенті Сполучених Штатів №6113918], наприклад, генного вірусу [9] або з ракової клітини [10]. Ефекстовпець 2, рядок 14 - стовпець 3, рядок 38, що ти IL-12 опосередковані у значній частині інтерфевключений тут як посилання [3]. AGP мають аміроном-гама, який продукується клітинами-кілерами ноалкільну (аглікон) групу, які зв'язана глікозидним (NK) і Т-хелперними клітинами. Інтерферон-гама є критичним для індукції IgG2a-антитіл до залежних зв'язком з 2-дезокси-2-аміно-a-D-глюкопіранозою білкових антигенів [11] і IgG3-реакцій на Т(глюкозаміном) з утворенням основної структури. незалежні антигени [12]. IL-12, спочатку названий Додаткові замісники включають в себе фосфористимуляторним фактором природних клітинлювання вуглецю 4 або 6 у кільці глюкозаміну і кілерів, є гетеродимерним цитокіном [13]. Експретрьох 3-алканоїлоксіалканоїльних залишків. Один з таких AGP є сполукою, яка позначаєтьсія і виділення білка IL-12 у рекомбінантних клітинах-хазяїнах описані в опублікованій [Міжнародній ся як 529 (повною хімічною назвою якої є 2-[(R)-3патентній заявці WO 90/05147 [14]]. тeтpaдeкaнoїлoкcитeтρaдeкaнoїлaмiнo]eтил-2Іншим цитокіном, що має потенціал застосудeзoкcи-4-O-фосфоно-3-О-[(R)-3вання як ад'юванта, є GM-CSF. GM-CSF є особлитетрадеканоїлокситетрадеканоїл]-2-[(R)-3вим типом колонієстимулюючого фактора (CSF). тетрадеканоїлокситетрадеканоїламіно]-b-DФактори CSF представляють сімейство лімфокінів, глюкопіранозид), що виробляється Соrіха що індукують диференціювання клітин(Hamilton, MT). попередників, виявлених у кістковому мозку, у конСоrіха виготовила також метаболізовану форкретні типи зрілих клітин крові. Як описано у [Паму емульсії типу «масло у воді», що при об'єднанні тенті Сполучених Штатів №5078996 [15]] що вклюз 529 приводить до утворення стабілізованої емучений тут як посилання, GM-CSF активує льсії, названої 529 SE. Цю стабілізовану емульсію макрофаги або попередники моноцитів для опосеодержують мікрофлюїдизацією 529 з скваленовим редкування неспецифічної нищівної нухлинні клімаслом, гліцерином і фосфатидилхоліном. Існуютини активності. Була описана нуклеотидна посліча на даний час форма є мікрофлюїдизована емудовність, що кодує ген GM-CSF людини [15]. льсія GMP-якості. Емульсії, що містять 1% масла Плазміда, що містить кДНК GM-CSF, була транс(хоча можуть використовуватись й інші концентраформована в Е. соlі і була депонована в [Америції), описані в експериментах нижче. канську Колекцію Типових Культур (АТСС), 10801 529 SE приводила до нерозрізненої макроскоUniversity Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, під пічної патології тканини при введенні підшкірно номером 39900]. Як описано у [патенті США мишам Balb/c або Swiss-Webster. Одержували №5229496 [16]], який тим самим включений тут як також стабілізовану емульсію, що містить ті ж самі посилання, ген GM-CSF був також інсертований у компоненти, але без 529, для порівняльних цілей. дріжджову експресійну плазміду і депонований в Конкретно, підшкірна імунізація цистеїн[АТСС під номером 53157]. Крім того, як описано у делетованою версією з 39 амінокислот (-Cys) пеп[Патенті США № 5073627 [17]], який включений тиду ВІЛ з 40 амінокислот TISP10MN(A) (яка не тим самим як посилання, ДНК-послідовність, що має залишку цистеїну в положенні амінокислоти кодує GM-CSF, який має вилучені сайти глікози17 пептиду з 40 амінокислот (+Cys)) або Αb1-42 лювання, була депонована в [АТСС під номером (внутрішнім фрагментом з 42 амінокислот АРР), які 67231]. готували з комбінацією ад'ювантів 529 SE і GMБуло показано, що GM-CSF позитивно регуCSF, не приводила до помітного запалення, почелює білкові молекули на антигенпредставляючих рвоніння, набрякання або ущільнення. клітинах, що, як відомо, підсилюють імунні реакції В об'єм даного винаходу входять також похідні [18] і впливають на секрецію Ig в очищених сортіні аналоги 529 та інших AGP. Такі сполуки містять у гом мишачих В-клiтинах [19]. GM-CSF був описасобі, але не обмежуються ними, сполуки, описані у ний також як ад'ювант для імуногенних композицій [Патенті Сполучених Штатів №6113918 [3]]. [20]. Включення цитокінів і лімфокінів в імуногенні Було показано, що інші цитокіни або лімфокіни композиції показало перспективність у відношенні мають імуномоделюючу активність, у тому числі, розширення і посилення потенціалу імуногенних але не обмежуючи ними, інтерлейкін-1-альфа, 1композицій [4]. Було показано, що цитокін інтербета, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 і 18, інлейкін-12 (IL-12) індукує і підсилює клітиннотерферони-альфа, бета і гама, гранулоцитарний опосередкований імунітет через зсув у розширенні колонієстимулюючий фактор і фактори некрозу субпопуляції Т-хелперних клітин вбік профілю Тh1пухлин альфа і бета. цитокінів (тобто вбік IgG2-підкласу в мишачій моВажливими у зв'язку із системним введенням делі) [5-7]. Було показано, що у мишей рекомбінабудь-якого цитокіну або лімфокіну є біологічні наснтний мишачий IL-12 підсилює профіль Тh1лідки, пов'язані з активністю цитокінів або лімфокідомінуючих імунних реакцій [4]. нів. Крім того, дії цитокінів або лімфокінів, пов'язаIL-12 продукується різними антигенпредставних з розвитком антиген-специфічних імунних ляючими клітинами, в основному макрофагами і 13 79426 14 реакцій, повинні підсилюватись, якщо підтримутретину повної молекули gp120, містить у собі часються локальні концентрації цитокінів або лімфокітину білка оболонки, яка індукує утворення нейтнів. ралізуючих антитіл. Однак дослідження на шимПроводилась оцінка комбінацій 3-Опанзе показали, що ані інтактний gp120, ані РВ1 не деацильованого монофосфорилліпіду А або моздатні індукувати продукування високих титрів нофосфорилліпіду А з GM-CSF або IL-12; спостенейтралізуючих антитіл. рігали посилення різних параметрів імунної реакції Короткі пептиди синтезували загальноприйня[21]. тими способами, і ці пептиди відповідали антигенОписаний тут винахід демонструє, що за доним детермінантам gp120 і генерували реакцію у помогою комбінування антигену, вибраного цитоківигляді антитіл проти gp120, які нейтралізували ну або лімфокіну як ад'юванта і другого ад'юванта цей вірус та індукували Т-хелперні і CTL-реакції AGP (переважно у стабільній метаболізованій проти цього вірусу. емульсії), імунні реакції, специфічні для даного Одним таким пептидом є пептид ВІЛ-Imn, який антигену, підсилюються. містить С4-V3-мультиепітоп, названий Антигени, вибрані для включення в антигенні TISP10MN(A) (+Cys) і варіант із делетованим цискомпозиції даного винаходу, містять у собі пептиди теїном TISP10MN(A) (-Cys). Ці пептиди містять у або поліпептиди, одержані з білків, білки, а також собі Th, TCTL і В-епітопи, але не індукують антитіла, фрагменти будь-яких з наступних компонентів: що перешкоджають зв'язуванню CD4. Раніше було сахаридів, білків, полі- або олігосахаридів або інпродемонстровано, що ці C4/V3-пептиди ВІЛ є ших макромолекулярних компонентів. У застосубагатообіцяючими кандидатами у відношенні індуванні тут, «пептид» позначає ряд з, щонайменше, кції імунних реакцій при введенні з CFA або CFAтрьох амінокислот і містить, щонайменше, одну подібними ад'ювантами [29-34]. Ці пептиди містять антигенну детермінанту або епітоп, тоді як «поліепітопи, що, як було показано раніше, індукують пептид» позначає більш довгу молекулу, ніж пепCD4+Th-клітинні реакції як у мишей, так і у людей, тид, але не складає повнорозмірний білок. Такі і вони містять як головну нейтралізуючу детерміпептиди, поліпептиди або білки можуть бути кон'юнанту, так і сайт, який упізнається CD8+CTL як у говані з неспорідненим білком, таким як правцевий мишей Balb/c, так і у людей, які є HLA В7+. Нещотоксоїд або дифтерійний токсоїд. У застосуванні давно було показано, що пептид з 39 амінокислот тут, « фрагмент» містить частину, меншу, ніж весь має як імуногенність так і безпеку у ВІЛзазначений компонент, такий як сахарид, білок, інфікованих пацієнтах [28]. полі- або олігонуклеотид або інший макромолекуTISP10MN(A) (+Cys) має наступну послідовлярний компонент. У випадку ВІЛ, антигенні комність з 40 амінокислот: позиції даного винаходу додатково містять повнорозмірні білки ВІЛ. Даний винахід спочатку ілюструється на прикладі модельної системи з використанням пептидних антигенів, одержаних із ВІЛ. Ці пептиди описані у [Патентах Сполучених Штатів №5013548 [22] і TISP10MN(A) (-C ys) синтезували без цистеїну №5019387 [23]], що включені як посилання, або в положенні 17 і він має наступну послідовність з вироблені з описаних у них пептидів, і ці описи 39 амінокислот: підсумовуються далі. Ці пептиди містять амінокислотні послідовності, що відповідають району білка оболонки ВІЛ, проти якого одержують нейтралізуючі антитіла і Т-клітинні реакції. ВІЛ є ретровірусом людини, що є збудником синдрому набутого імунодефіциту (СНІДу). ВІЛ Цей залишок цистеїну локалізований зовні від інфікує Т-лімфоцити імунної системи приєднанням функціональних епітопів, які упізнаються Thглікопотеїну його зовнішньої оболонки до CD4 клітинами, CTL або В-клітинами. Інші пептиди ВІЛ (Т4)-молекули на поверхні Т-лімфоцитів, викорисз різних районів вірусного геному описані у [Патентовуючи, отже, цю молекулу CD4 (Т4) як рецептор ті США №5861243 [35], Патенті США №5932218 для входження в Т-клітини та інфікування їх. [36], Патенті США №5939074 [37], Патенті США Спроби індукції захисної імунної реакції, специфіч№5993819 [38], Патенті США №6037135 [39], Опуної для ВІЛ-інфекції, через імунізацію мали дуже блікованій Європейській заявці на патент обмежений успіх. В наш час ряд підходів викорис№671947 [40] і Патенті США №6024965 [41]], які товують у спробі визначення ефективної і захисної також включені як посилання. стратегії для розвитку імуногенних композицій. Використовували також пептидний кон'югат з Вони містять у собі атенуйовані і рекомбінантні 28 амінокислот, названий ST1/p11С. Цей кон'югат бактеріальні вектори, які експресують антигенні складається з SIV-env-похідного Т-хелперного пеепітопи з ВІЛ [24], рекомбінантний аденовірус [25] птиду з 16 амінокислот, названого ST-1, кон'югоабо вектори вірусу коров'ячої віспи [26], імунізацію ваного з Gag-пептидом SIV-mac 251 з 12 амінокиДНК і синтетичні пептиди, що містять різні Т- і Вслот (амінокислоти 179-190 Gag), названого р11С клітинні епітопи ВІЛ [28]. [42]. Пептид р11С у тетрамерній формі продемонБуло показано, що глікопротеїн gp120 зовнішстрував CTL-активність у інфікованих SIV-mac маньої оболонки ВІЛ здатний індукувати нейтралізукаках-резус Mamu-A*01 [43]. Пептидний кон'югат ючі антитіла в людях. Було показано, що рекомбіST1-p11С має наступну амінокислотну послідовнантний білок РВ1, що охоплює приблизно одну 15 79426 16 кує високі титри антиген-специфічних IgG-антитіл, у тому числі як IgG1, так і IgG2a підкласів, у зводі піхви імунізованих самок мишей. Імунізація мишей TISP10MN(A) (-Суs)-пептидом, приготованим з 529 SE і GM-CSF, індукувала сильну клітинну імунну реакцію, як визначено за посиленою антигенспецифічною клітинною проліферацією і секрецією Використовували також пептидний кон'югат з у культур у цитокінів, а також за індукцією пептид39 амінокислот, названий С4-V389.6p [44]. Район С4 специфічних CTL-реакцій. Подібні результати споцього пептидного кон'югату (16 амінокислот) виростерігали при імунізації мишей Αb1-42-пептидом з блений з четвертого константного району білка АРР із 529 SE і GM-CSF. оболонки ВІЛ-1 і представляє універсальний ТЗвичайно форма антиген/ад'ювант 529 або хелперний епітоп. Частина V3 цього пептиду (23 529 SE, об'єднана з GM-CSF або IL-12 і вибраним амінокислоти) вироблена з третього гіперваріабебілком і пептидом, індукує високі титри антигенльного району білка оболонки ВІЛ-1 і представляє специфічного і нейтралізуючого вірус антитіла, критичну нейтралізуючу детермінанту. Кон'югат істотне зрушення у співвідношенні підкласів IgG C4-V3 89.6p мaє наступну амінокислотну послідоввбік більшої частки комплемент-фіксуючих IgGність: антитіл (на користь IgG2a у мишах), підвищене продукування цитокінів і клітинну проліферацію з мононуклеарних клітин у відповідь на стимуляцію антигеном in vitro. Ці властивості не спостерігали з формами антигену і SE під час відсутності 529, ні з GM-CSF або IL-12, ні без GM-CSF або IL-12. Форми даного винаходу також індукують хороші клітинні реакції, як визначено за індукцією CTL. Антиген ВІЛ може бути білком, поліпептидом, Перевага 529 SE полягає в тому, що ця форма пептидом або фрагментом, одержаним із зазначене індукує гранулематозне нагромадження і запаного білка. Цей білок може бути глікопротеїном, лення у місці ін'єкції; такі реакції у місці ін'єкції звитаким як gp41, gp120 або gp1460. Альтернативно, чайно індукуються формами ад'ювантів типу «воцей білок може бути білком, кодованим такими да-у-маслі» або «масло-у-воді». генами, як gag, pol, vif, rev, vpr, tat, nef або env. Був проведений експеримент для порівняння Пептиди, вироблені з таких білків, будуть містити введення пептиду ВІЛ TISP10MN(A) (-Cys) тільки з щонайменше одну антигенну детермінанту (епі529 SE або з 529 SE плюс IL-12 або 529 SE плюс топ) довжиною щонайменше шість амінокислот. GM-CSF. Імунна реакція на пептид ВІЛ може бути посиУ цьому експерименті (таблиця 1, нижче) миші лена ковалентним зв'язуванням (кон'югацією) пепBalb/c, імунізовані підшкірно петидом ВІЛ тиду з молекулою фармацевтично прийнятного TISP10MN(A) (-Cys), приготованим з 529 SE, індуносія. Приклади придатних молекул-носіїв містять кували пептид-специфічні сироваткові титри IgG у собі правцевий токсоїд, дифтерійний токсоїд, після усього лише двох ін'єкцій. Індукувались тагемоціанін фісурели та інші пептиди, що відповікож титри підкласів IgG1 і IgG2a. Включення другодають Т-клітинним епітопам глікопротеїну gp120 го ад'юванта, або GM-CSF, або IL-12, підвищувало ВІЛ. загальні титри IgG, а також титри підкласу IgGl. В наш час передбачається, що успішна страДодавання IL-12 підвищувало ти три підкласу тегія для імунізації проти ВІЛ буде вимагати індуIgG2a; додавання GM-CSF не підвищувало титри кування мукозного імунітету до ВІЛ, а також хоропідкласу IgG2a. шої CTL-реакції. У нещодавньому дослідженні на В іншому експерименті як міру функціональномишах з використанням мультиепітопного пептиду го клітинно-опосередкованого імунітету оцінювали TISP10MN(A) і мукозного ад'юванта, холерного здатність клітин селезінки мишей, імунізованих токсину, було показано, що інтраназальна імуніза529 SE або 529 SE плюс IL-12 або 529 SE плюс ція індукувала нейтралізуючі сироваткові антитіла GM-CSF, приготованих разом з мультиепітопним IgG1 [45]. Наступне дослідження також з викориспептидом TISP10MN(A) (-C ys), генерувати ВІЛMNтанням пептидів петлі V3 ВІЛ показало індукуванcпецифічні CTL-реакції. ня синтезованого мукозального IgA-антитіла і сиЯк показано у таблиці 2, клітини селезінки мильні клітинно-опосередковані реакції, у тому числі шей, імунізованих кожним з ад'ювантів, показали пептид-специфічні CTL [46]. Функціональна роль низьку активність проти клітин-мішеней, які були високих титрів системних і нейтралізуючих антитіл або неміченими, або короткочасно міченими стоу попередженні ВІЛ або стабілізації ВІЛроннім CTL-епітопом lllВ. BIЛMN-специфічний CTLінфікованих індивідуумів є невідомою, хоча вважаопосередкований лізис клітин-мішеней помітно ється, що високі титри вірус-специфічного антитіла підсилювався при введенні 529 SE плюс IL-12 у важливі у запобіганні поширення вірусу. порівнянні з одним 529 SE, і все ще підсилювався У кращому варіанті даного винаходу готують додатково при введенні 529 SE плюс GM-CSF стабільну емульсію типу «масло у воді», що міс(таблиця 2). тить 529, яку потім змішують з цитокінами IL-12 Ще в одному варіанті макак-резус імунізували або GM-CSF. Дані, представлені нижче, показупептидами ST1-p11C або С4-V389.6P і IFA або 529 ють, що комбінація 529 плюс GM-CSF приводить SE плюс GM-CSF (груп, показаних у таблиці 15). до високих титрів ВІЛ-нейтралізуючих сироваткоРезультати цих аналізів показані у таблицях 16-22 вих антитіл. Комбінування 529 SE і GM-CSF індуність: 17 79426 18 і тепер підсумовуються. Бажані імуногенні композиції для попередженСама форма пептиду ST1-p11C, очевидно, ня або лікування захворювань, що характеризудобре переноситься у всі х випробуваних тваринах. ються відкладенням амілоїду (аутологічної молеОднак з ад'ювантом IFA були відзначені істотні кули) у хребетного хазяїна, які містять комбінації реактивності сайту ін'єкції. Крім того, можливі міад'ювантів даного винаходу, містять у собі компонорні несприятливі ефекти форми ад'юванта 529 зиції, що містять частини білка-попередника бетаSE/GM-CSF спостерігались відразу ж після кінцеамілоїду (АРР). Це захворювання називають пової імунізації. Форма пептиду ST1-p11C, що місрізному: хворобою Альцгеймера, амілоїдозом або тить IFА, була здатна індукувати сильну р11Самілоїдогенною хворобою, b-амілоїдний пептид специфічну клітинну імунну реакцію в одній з двох (також названий Αb-пептидом) є внутрішнім фрагвипробуваних Mamu-A*01-позитивних макак-резус. ментом АРР із 39-43 амінокислот, який утворюєтьФорма пептиду ST1-p11C, що містить 529 SE/GMся процесінгом АРР ферментами b- і gCSF, також була здатна індукувати р11Ссекретазами. Αb1-42-пептид має наступну посліспецифічну клітинну імунну реакцію в одній з двох довність: випробуваних Mamu-A*01-позитивних макак-резус. Форма пептиду C4-V389.6P, що містить IFА, була здатна генерувати максимальні титри антитіл ELISA у плазмі в діапазоні 1:25600-1:102400 і титри сироваткових нейтралізуючих антитіл проти SHIV89.6 і SHIV9.6P. Форма пептиду C4-V389.6P , що У деяких пацієнтів відкладення амілоїду примістить 529 SE/GM-CSF, була здатна генерувати ймає форму агрегованого Αb-пептиду. Несподівамаксимальні титри антитіл ELISA у плазмі в діапано було показано, що введення виділеного Αbзоні 1:6400-1:12800 і низькі рівні реакцій нейтраліпептиду індукує імунн у реакцію проти Αbзуючих антитіл проти SHIV89.6, але не проти пептидного компонента відкладення амілоїду у SHIV89.6P. хребетного хазяїна [47]. Таким чином, імуногенні При невеликому числі тварин на групу (дві) композиції даного винаходу містять у собі комбіважко зробити конкретні висновки. Однак рівень нації ад'юванта даного винаходу плюс Αb-пептид, імунної реакції, як гуморальної, так і клітинної, геа також фрагменти, похідні або модифікації Αbнерованої обома формами пептидів, що містять 529 SE/GM-CSF, був кількісно більш низьким, ніж пептиду і антитіла до Αb-пептиду або його фрагімунна реакція, що спостерігається у тварин, яким ментів, похідних або модифікацій. Один такий вводили IFA як ад'ьювант. Слід також відзначити, фрагмент Αb-пептиду є пептидом з 28 амінокисщо IFA не є схваленим компонентом у композиціях лот, що мають наступну послідовність [48]: для комерційного застосування для людей. Крім того, мається деякий обмежений доказ того, що функціональні властивості і фенотип (тобто профілі цитокінів) клітин-респондерів можуть розрізнятись у залежності від використовуваної форми ад'ьюванта. Інші фрагменти Αb-пептиду, які є цікавими, міЩе в одному експерименті тварин із другого стять у собі, але не обмежуються ними, амінокисвиду приматів, собакоголових макак, імунізували лоти 1-10, 1-7, 1-6, 1-5, 3-7, 1-3 і 1-4, які можуть пептидом C4-V389.6P , який був модифікований завводитись у некон'югованій формі або кон'юговаміною глутамінової кислоти при амінокислотному ними з стороннім білком. залишку 9 на валін. Одержаний пептидний кон'юРяд досліджень був проведений з Αb1-42гат, названий C4(E9V)-V389.6P, має наступну посліпептидом і різними ад'ювантами. Далі представдовність: лені узагальнені результати. У першому експерименті миші Swiss-Webster, імунізовані підшкірно у сідничну область Αb1-42пептидом, генерували титри пептид-специфічних антитіл IgG, IgG1 і IgG2a, демонструючи, що Αb142-пептид є життєздатним вакцинним антигеном. Додавання GM-CSF до 529 SE і Αb1-42-пептиду Тварин імунізували пептидом C4(E9V)-V3 89.6P , приводило до підвищених титрів антитіл IgG, IgG1 або без ад'ь юванта, або з комбінацією 529 SE і IgG2a у сироватці у порівнянні з реципієнтами плюс GM-CSF. 529 SE і Αb1-42-пептиду (див. таблиці 3-8). СироЦі результати вказують на те, що пептид ваткові антитіла у індивідуальних мишей, що одеC4(E9V)-V3 89.6P при введенні внутрішньом'язовою ржують комбінацію 529 SE плюс GM-CSF, підвиін'єкцією у комбінації з 529 SE/GM-CSF індукує щувались у більшому числі випадків і значимо більш високі титри пептид-специфічних підвищувались швидше, ніж у індивідуальних миIgG у сироватці, ніж та ж сама кількість пептиду шей, що одержують тільки 529 SE (дані не показаC4(E9V)-V3 89.6P, що вводиться інтраназально без ні). При повторенні цього першого експерименту з ад'юванта (Фігури 7-9). Результати цього експерибільш старими мишами Swiss-Webster (у віці 6-8 менту ясно демонструють, що пептидний імуноген місяців замість менше 3 місяців) спостерігали реВІЛ при введенні у комбінації з придатною комбізультати, схожі з результатами у таблицях 3-8 нацією ад'ювантів здатний індукувати системний (дані не показані). гуморальний імунітет. У другому експерименті мишей Swiss-Webster 19 79426 20 Таким чином, ад'ювантні (імуностимулюючі) імунізували підшкірно у сідничну область Αb1-42властивості 529 SE і GM-CSF або IL-12, очевидно, пептидом і 529 SE з кількостями GM-CSF, що варіюються. Титри IgG кінцевих точок збільшувались є синергічними при приготуванні сумісної композиції. залежним від дози чином у міру збільшення GMАнтигенні композиції даного винаходу модуCSF (від 0,1 до 1 до 10мкг) (таблиця 9). Титри IgG люють імунну реакцію поліпшенням реакції у видля всіх комбінацій 529 SE плюс GM-CSF були гляді антитіл хребетного хазяїна і клітиннобільш високими, ніж для груп, що одержують інший ад'ювант, QS-21, один або з GM-CSF. Титри підопосередкованого імунітету після введення антигенної композиції, що містить вибраний антиген з класу IgG1 також збільшувались для різних груп патогенних вірусу, бактерії, гриба або паразита і 529 SE плюс GM-CSF у порівнянні з групою, що ад'ювантну кількість AGP, такого як 529 (у водній одержувала 529 SE плюс GM-CSF у першій дозі і формі або у формі стабільної емульсії), комбінотільки 529 SE у другій дозі (таблиця 10). Титри підкласу IgG2a також збільшувались для різних ваний з цитокіном або лімфокіном, зокрема GMCSF або IL-12. Було показано, що інші цитокіни груп 529 SE плюс GM-CSF у порівнянні з групою, або лімфокіни мають імуномодулюючу активність, що одержувала тільки 529 SE, залежним від дози у тому числі, але не тільки, інтерлейкін 1-альфа, 1чином (таблиця 11). бета, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 і 18, інУ третьому експерименті мишей SwissWebster імунізували підшкірно у сідничну область терферони-альфа, бета і гама, гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор і фактор некрозу пуΑb1-42-пептидом і 529 SE з кількостями GM-CSF, хлин альфа і бета. що варіюються, або без кількостей GM-CSF, що Агоністи або антагоністи визначених цитокінів варіюються. Титри кінцевих точок IgG збільшуваабо лімфокінів також знаходяться в обсязі даного лись для різних груп 529 SE плюс GM-CSF (0,5 до винаходу. У застосуванні тут термін «агоніст» 2 до 5 до 10мкг), хоча і не в залежності від дози означає молекулу, що підсилює активність зазна(таблиця 12). Титри підкласів як IgG1, так і IgG2a чених цитокінів або лімфокінів або функціонує татакож збільшувались для різних гр уп 529 SE плюс ким же чином, як зазначені цитокіни або лімфокіGM-CSF у порівнянні з групою тільки 529 SE, хоча і ни. Прикладом такого агоністу є міметик не в залежності від дози (таблиці 13 [IgG1] і 14 зазначених цитокінів або лімфокінів. У застосуван[IgG2a]). ні тут термін «антагоніст» означає молекулу, яка У четвертому експерименті використовували інгібує або запобігає активності зазначених цитокітрансгенних мишей, що експресують варіантну нів або лімфокінів. Прикладами таких антагоністів форму білка-попередника амілоїду (АРР), що має є розчинний рецептор IL-4 і розчинний рецептор мутацію при залишку 717, з валіном, заміненим TNF. фенілаланіном [49]. Ця мутація пов'язана із сімейУ застосуванні тут термін «ефективна ад'юваною хворобою Альцгеймера у людей. Ці трансгенні нтна (імуностимулююча) кількість» означає дозу миші (названі мишами PDAPP), які прогресуючим комбінації описаних тут ад'ювантів, яка придатна чином розвивають багато патологічних ознак хводля індукції збільшеної імунної реакції на вибраний роби Альцгеймера, у тому числі відкладення Αb, антиген у хребетного хазяїна, у порівнянні з хазяїнейритні бляшки і астроцитоз, і, отже, служать як ном, що одержує цей вибраний антиген під час модель тварини для хвороби Альцгеймера лювідсутності цієї комбінації ад'ювантів. Конкретна дини. доза буде залежати частково від віку, ваги і медиУ цьому четвертому експерименті мишей чного стану хазяїна, а також від способу введення PDAPP імунізували підшкірно Αb1-42-пептидом з і конкретного антигену. У кращому варіанті ця комрізними ад'ювантами або без ад'ювантів і при добінація ад'ювантів буде використовува ти 529 у зах, показаних у таблиці А. Зокрема, миші групи 1 діапазоні 0,1-500мкг на дозу; у більш кращому ваодержували Αb1-42-пептид з MPLÔ (Согіха, ріанті використовують діапазон 1-100мкг на дозу. Hamilton, MT) у стабільній емульсійній формі (SE) Придатні дози легко визначаються особами з кваяк позитивний контроль; миші групи 2 одержували ліфікацією у даній області. Антигенні композиції Αb1-42-пептид з MPLÔ SE плюс мишачий GMданого винаходу можуть бути також змішані з імуCSF; миші групи 3 одержували Αb1-42-пептид з нологічно прийнятними розріджувачами або носі529 SE плюс мишачий GM-CSF; миші групи 4 одеями загальноприйнятим чином для приготування ржували PBS як негативний контроль. Групи 2 і 3 ін'єкційних рідких або розчинів суспензій. виявляли більш швидке збільшення величин титАнтигенні або імуногенні композиції даного вирів анти-Аb1-42-антитіла, а також більш високий находу вводять людині або хребетному, що не є максимальний титр, ніж групи 1 або 4. людиною, різними шляхами, у тому числі, але не Однак титри в групах 2 і 3 знижувались до ектільки, інтраназальним, пероральним, вагінальвівалентного титру позитивних титрів групи 1 у ним, ректальним, парентеральним, інтрадермальмежах 2-3 місяців (Фігура А). Гр упи 1, 2 і 3 показаним, трансдермальним [див., наприклад, Міжнароли значиме зниження рівнів Αb у головному мозку дну заявку WO 98/20734, що включена як при вимірюванні за допомогою ELISA (таблиці В-С посилання], внутрішньом'язовим, внутрішньоочеі Фігури В-С), більш низькі амілоїдні навантаження ревинним, підшкірним, внутрішньовенним і внутрі(таблиця D і Фігура D) і меншу нейритну дистрошньоартеріальним шляхом. Кількість антигенного фію (таблиця Ε і Фігура В), у порівнянні з негативкомпонента або компонентів антигенної композиції ними контролями групи 4. Групи 2 і 3 мали значибуде варіюватись в залежності від конкретного ме зменшення астроцитозу в порівнянні з антигену, а також від віку, ваги і медичного стану позитивними контролями групи 1 (Фігура F). хазяїна, а також від способу введення. Знову, від 21 79426 22 повідні дози легко визначаються особами з кваліVibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, фікацією у даній області. Переважно, хоча і неMycobacterium tuberculosis, Mycobacterium aviumобов'язково, антиген і комбінацію ад'ювантів ввоMycobacterium istracellulare complex, Proteus дять одночасно. Число доз і схема введення доз mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, для антигенної композиції також легко визначаStaphylococcus epidermidis, Clostridium tetani, ються особами з кваліфікацією у даній області. У Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi, деяких випадках ад'ювантні властивості комбінації Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, ад'ювантів можуть зменшува ти число необхідних Actinobacillus pleuropneumoniae i Mycoplasma доз або часовий хід схеми прийому лікарського gallisepticum. засобу. Бажані імуногенні композиції проти грибкових Комбінації ад'ювантів даного винаходу придапатогенів, що містять комбінації ад'ювантів даного тні для застосування в антигенних або імуногенних винаходу, містять у собі композиції, спрямовані на композиціях, що містять велику різноманітність попередження та/або лікування захворювання, яке антигенів з великого кола патогенних мікроорганівикликається, без обмеження, Aspergillus, змів, у тому числі, але не тільки, антигенів з віруBlastomyces, Candida, Coccidiodes, Cryptococcus і сів, бактерій, грибів або паразитичних мікроорганіHistoplasma. змів, що інфікують людей і хребетних тварин, що Бажані імуногенні композиції проти паразитів, не є людиною, або антигенів з ракової клітини або що містять комбінації ад'ювантів даного винаходу, нухлинної клітини. Антиген може містити пептиди містять у собі композиції, спрямовані на попереабо поліпептиди, одержані з білків, а також фрагдження та/або лікування захворювання, яке виклименти кожного з наступних компонентів: сахаридів, кається, без обмеження, Leishmania major, Ascaris, білків, полі- або олігонуклеотидів, ракових або пуTrichuris, Giardia, Schistosoma, Cryptosporidium, хлинних клітин, алергенів, аутологічних молекул Trichomonas, Toxoplasma gondii і Pneumocystis (таких як білок-попередник амілоїду) або інших carinii. макромолекулярних компонентів. У деяких випадБажані імуногенні композиції для індукування ках в антигенну композицію може бути включена терапевтичного або профілактичного антиракового більша кількість антигенів, ніж один антиген. ефекту у хребетного хазяїна, що містять комбінації Бажані вірусні імуногенні композиції, що місад'ювантів даного винаходу, містять у собі компотять комбінації ад'ювантів даного винаходу, місзиції, що використовують раковий антиген або потять у собі композиції, спрямовані на попередженв'язаний з пухлиною антиген, у тому числі, без ня та/або лікування захворювання, яке обмеження, специфічний для передміхурової завикликається, без обмеження, вірусом імунодефілози антиген, карцино-ембріональний антиген, циту людини, вірусом імунодефіциту мавп, респіMUC-1, Her2, CA-125 і MAGE-3. раторно-синцитіальним вірусом, вірусом парагриБажані імуногенні композиції для ослаблення пу типів 1-3, вірусом грипу, вірусом простого реакцій на алергени у хребетному хазяїні, що місгерпесу, цитомегаловірусом людини, вірусом гепатять комбінації ад'ювантів даного винаходу, міститу А, вірусом гепатиту В, вір усом гепатиту С, тять у собі композиції, які містять алерген або його папіломавірусом людини, поліовірусом, ротавіруфрагмент. Приклади таких алергенів описані у сом, каліцивірусами, вірусом кору, вірусом пароти[Патенті Сполучених Штатів №5830877 [51] і опубту, вірусом коревої краснухи, аденовірусом, вірулікованій Міжнародній патентній заявці № сом сказу, вірусом чуми собачих, вірусом чуми WO99/51259 [52], що включені тим самим як посивеликої рогатої худоби, метапневмовірусом людилання], і містять у собі пилок, отрути комах, лупу ни, пневмовірусом птахів (раніше названим вірутварин, спори грибів і лікарські засоби (такі як песом ринотрахеїту індичок), Хендравірусом, Ніпавініцилін). Ці імуногенні композиції перешкоджають русом, коронавірусом, парвовірусом, вірусами продукуванню IgE-антитіл, відомої причини алерінфекційного ринотрахеїту, вірусом котячого лейгійних реакцій. козу, вірусом інфекційного котячого перитоніту, Бажані імуногенні композиції для ослаблення вірусом інфекційного бурсального захворювання реакцій на аутологічні молекули у хребетного хазяптахів, вірусом Ньюкаслської хвороби птахів, віруїна, що містять комбінації ад'ювантів даного винасом хвороби Марека, вірусом респіраторного і реходу, містять у собі композиції, що містять аутолопродуктивного синдрому свиней, вірусом кінського гічну молекулу або її фрагмент. Приклади таких артеріїту і різними вірусами енцефаліту. аутологічних молекул, крім Αb1-42-пептиду, опиБажані бактеріальні імуногенні композиції, що саного вище, містять у собі інсулін з b-ланцюгом, містять комбінації ад'ювантів даного винаходу, що бере участь у діабеті, молекулу G17, що бере містять у собі композиції, спрямовані на попереучасть у такому захворюванні, як гастроезофагеадження та/або лікування захворювання, яке виклильний рефлюкс, і антигени, що негативно регулюкається, без обмеження, Haemophilus influenzae ють (знижують) аутоімунні реакції при захворю(як типовим, так і нетиповим), Haemophilus ваннях, таких як множинний склероз, системний somnus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus червоний вовчак і ревматоїдний артрит. pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus У випадку ВІЛ і SIV (вірусу імунодефіциту agalactiae, Streptococcus faecalis, Helicobacter мавп) ці антигенні композиції містять, щонайменpylori, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, ше, один білок, поліпептид, пептид або фрагмент, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, одержані із зазначеного білка. У деяких випадках в Chlamydia psittaci, Bordetella pertussis, Alloiococcus антигенну композицію включені множинні білки, otiditis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, поліпептиди, пептиди та/або фрагменти ВІЛ або Salmonella choleraesuis, Escherichia coli, Shigella, SIV. 23 79426 24 Комбіновані форми ад'ювантів даного винахоПептид солюбілізували у стерильній воді і розбавду придатні також для включення ад'юванта у поляли у придатних буферах або культуральному лінуклеотидні імуногенні композиції (також відомі середовищі для клітин перед використанням. як імуногенні композиції ДНК). Такі імуногенні комАд'юванти позиції можуть додатково містити допоміжні агенВсі препарати ад'ювантів, які містять 529, одети, такі як бупівікаїн [див. Патент США №5593972 ржували від Corixa [Hamilton, МТ]. 529 SE готували [53], який включений як посилання]. у вигляді попередньої емульсії типу «масло у воді» Для кращого розуміння даного винаходу пред(0,8-2,5% масло) на основі сквалену, що має конставлені наступні приклади. Ці приклади наведені центрації 529 у діапазоні 0-50мкг/мл. Фосфат тільки з метою ілюстрації і не повинні розглядаалюмінію готували у власній лабораторії. Повний тись як такі, що обмежують об'єм даного винаходу. ад'ювант Фрейнда (CFA) і неповний ад'ювант Приклади Фрейнда (IFА) придбавали у Difco Laboratories, Приклад 1 Detroit, MI. Пептиди T1SP10MN(A) і ад'юванти Матеріали і способи Фрейнда емульгували у співвідношенні 1:1 з викоНаступні матеріали і способи використовували ристанням двох спарених шприців. Рекомбінантно в експериментах, повідомлених у прикладах 2-7 експресований мишачий IL-12 одержували від нижче. Genetics Institute [Cambridge, MA]. Рекомбінантний Тварини мишачий GM-CSF придбавали у Biosource Самок мишей Balb/c у віці 7-9 тижнів придбаInternatinal [Camarillo, CA] у вигляді ліофілізовановали у Talconic Farms, Inc. (Germantown, NY). Саго порошку без носія. СтимулонÔ QS-21 придбамок мишей Swiss-Webster у віці 7-9 тижнів також вали у Antigenics Inc. [Framingham, MA]. придбавали у Talconic Farms, Inc. Всіх мишей Імунізації утримували в обладнанні, схваленому АмериканМишей імунізували підшкірно у сідничну обською Асоціацією осіб з догляду за лабораторними ласть у загальному обсязі 0,2мл, порівну розділетваринами. Мишей акліматизували до обладнання ному на кожну сторону сідничної області. Імунізації для їх утримування протягом одного тижня перед виконували при різних тимчасових інтервалах, початком досліджень. зазначених нижче. Антиген і цитокіни розбавляли у Антигени забуференому фосфатом сольовому розчині до В експериментах із ВІЛ у прикладах 2-3 нижче придатних концентрацій і готували з ад'ювантами використовували два різних синтетичних пептиди. менше ніж за 16 годин перед імунізацією, у стериПослідовність мультиепітопного пептиду HIV-1-MN льних умовах. Ім уногенні композиції змішували TISP10MN(A) (-Cys) (також названого тут MN-10) є обережним струшуванням і зберігали при 4°С. Ці наступною: форми перемішували вертексом безпосередньо перед імунізацією. Аналіз сироватки з використанням твердофазного імуноферментного аналізу У тварин брали кров перед початковою імунізацією і у зазначених тимчасових точках. Аналіз сироватки був представлений у вигляді середньоЦей пептид був описаний раніше [33, 34] і місго геометричного окремих титрів. Для аналізу спетить послідовності з gp120MN ВІЛ-1, які індукують цифічного для пептиду ВІЛ антитіла і розподілу CD4+ Th-клітинні реакції як у мишей, так і у людей, підкласів пептид суспендували або у карбонатноголовну нейтралізуючу детермінанту і сайт, який му буфері (15мМ Na2CO3, 35мМ NaHCO3, p 9,6), упізнається CD8+ CTL у мишей Balb/c. Цей пептид або у PBS, при концентрації 1мкг/мл і вміщували у був наданий доктором R. Scearce [Duke University, 96-ямкові мікротитраційні планшети (Nunc) в обсяDurham, NC]. Для аналізу CTL з метою порівняння зі 100:1. Після інкубування протягом ночі при 37°С використовували сторонній пептид, названий ШВ. планшети промивали і блокували (0,1% желаЦей пептид відповідав епітопу CTL у V3-петлі HIVтин/PBS) при кімнатній температурі протягом 2-4 1-IIIВ (Arg Gl y Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr IIe (SEQ годин. Планшети ELISA промивали промивним ID N0:8)), і був придбаний у Genosys буфером (PBS, 0,1% ТвінÔ 20) перед додаванням Biotechnologies Inc. [The Woodlands, TX]. Пептиди серійно розведеної сироватки (PBS, 0,1% желатин, солюбілізували у стерильній воді і розбавляли у придатних буферах або культуральному середо0,05% ТвінÔ20, 0,02% азид натрію). Після 4годинного інкубування ямки промивали і придатні вищі для клітин перед використанням. розведення біотинільованих антиізотип/підкласівВ експериментах з амілоїдом прикладів 4-6 і 8 антитіл додавали для інкубування при 4°С протянижче використовували пептид, названий Αb1-42. гом ночі. Ямки промивали та інкубували з кон'югоПослідовність Αb1-42 є наступною: ваною зі стрептавідином пероксидазою хріну. Після інкубування ямки промивали і виявляли ABTS. Ямки зчитували при 405нм. Титри стандартизували з використанням контрольних сироваток. Той же самий протокол використовували для аналізу Αb1-42-пептид-специфічних антитіл і розЦей пептид був описаний раніше [47] і відповіподілу підкласів, за винятком того, що використодає внутрішньому фрагменту з 42 амінокислот вували концентрацію 0,3мкг/мл на мікротитраційбілка-попередника амілоїду. Αb1-42 одержували ний планшет. від Elan Pharmaceuticals [South San Francisco, CA]. Одержання клітин 25 79426 26 Для аналізів проліферації і аналізу цитокінів in TlSP10MN(A) (-Cys)-IgG для загальних IgG і підvitro одержували клітини селезінки мишей у зазнакласів чених часових точках. С успензії окремих клітин Реципрокні титри кінцевих точок підкласів IgG одержували з пулів від 3-5 мишей. Для аналізу вимірювали з об'єднаної сироватки (n=5 Balb/c) проліферації і цитокінів клітини суспендували в через п'ять тижнів після початкової імунізації, чекруглодонних 96-ямкових культуральних планшерез два тижні після вторинної імунізації. Мишей тах, попередньо покритих протягом ночі пептидімунізували підшкірно у сідничну область 25мкг ными антигенами ВІЛ, контрольними білками або T1SP10MN(A) (-Cys) з використанням у цілому тільки середовищем RPMI-10. Клітини селезінки 0,2мл, розділених порівну на дві 0,1мл-ин'єкції на додавали при 5x105 клітин на ямку з використанкожній стороні при тижні 0 і тижні 3. 529 SE розбаням культурального середовища, що має 2х добавляли для одержання емульсії, що містить 1,25% вки. Клітинні культуральні супернатанти збирали з скваленове масло і 25мкг 529 на дозу. SE є емульямок у трьох повторностях для аналізу цитокінів сією-носієм типу масло у воді, що складається зі після трьох або шести днів після початку культисквалену, гліцерину і емультуючого агента. Рекомвування. Відразу після збирання супернатантів бінантний мишачий IL-12 надавали у кількості 40нг культури короткочасно обробляли 3Н-тимідином на мишу. Рекомбінантний мишачий GM-CSF ввопротягом 18-24 годин і збирали для кількісного дили при 25мкг на мишу. Результати наведені у визначення проліферації клітин. таблиці 1 із середніми геометричними титрами Приклад 2 плюс стандартні помилки для кожної групи. Реципрокні титри кінцевих точок антиТаблиця 1 Рецмпрокні титри кінцевих точок aнті-TlSP10MN(A) (-C ys)-IgG для загальних IgG і підкласів IgG Титри кінцевих точок Ад'юванти HIV-пептид, мкг IgG IgG1 IgG2a 529 (25) SE (1,25% масло) 25 206301±175149 37567±31526 180671±277211 529 (25) SE (1,25% масло)+rIL-12 (,04) 25 460516±690712 74269±169868 222446±400716 529 (25) SE (1,25%масло)+GM-CSF 25 1085658±1064924 238379±62199 117657±25301 (25) Приклад 3 Аналіз CTL у мишей Balb/с Для імунізації мишей використовували протоколи прикладу 2. Оцінювали CTL-активність клітин селезінки, виділених з мишей через 14 днів після вторинної імунізації. 529 SE готували з 25мкг 529 SE, що містять 1,25% масло з 10мкг GM-CSF або 40нг IL-12 або без них, плюс 25мкг TISP10MN(A) (Cys). Для аналізу CTL клітини селезінки витягали з імунізованих мишей через 14 днів після вторинної імунізації. Використовували власне кажучи раніше описаний протокол. Коротко, поєднували клітини селезінок, що не містять еритроцити, із трьох мишей на груп у. Ефекторні клітини селезінки (4x106 на мл) повторно стимулювали у 24-ямкових культуральних планшетах в обсязі 1,5-2мл протягом семи днів з 1мкг/мл або пептиду «MN-10», або 10мірного пептиду епітопу CTL «ІІІВ» або без пептиду HIV. Обидва епітопи CTL були обмежені H-2Dd. Культури доповнювали 10Е/мл рекомбінантного мишачого IL-2 (Biosource) протягом останніх п'яти днів культивування. Для аналізу цитотоксичної активності клітини Р815 мітили Сr51 і короткочасно обробляли 5мкг/мл пептиду (ІІІВ або MN-10) протягом чотирьох годин і додавали до культивованих ефекторних клітин селезінки. Якщо не використовували пептид HIV, то серію клітин-мішеней не піддавали цій короткочасній обробці. Використовували триразові розведення відношень ефекторних клітин до клітин мішеней («Е:Т») 30:1-1,1:1. Процент CTL-активності розраховували у вигляді проценту вивільнення хрому з використанням рівняння ((специфічне вивільнення хрому-спонтанне вивільнення хрому)/(максимальне вивільнення хрому-спонтанне вивільнення хрому))*100. Вивільнення хрому оцінювали після 6-годинного періоду інкубації. Середнє спонтанне вивільнення хрому завжди було менше 15% від максимального вивільнення. Результати даних із дня 28 показані у таблиці 2. Таблиця 2 Відношення ефектор:мішень 529 SE+:E:T% специфічне вивільнення 30:1 10:1 3,3:1 1,1:1 Пептид MN-10 * IL-12 GM-CSF 31 53 71 19 41 70 5 11 35 2 4 14 * 8 5 2 1 Пептид ІІІВ Без пептиду IL-12 GM-CSF * IL-12 GM-CSF 11 19 4 8 8 8 21 2 5 9 1 5 про -2 -1 0 2 -3 -2 -3 27 79426 28 * Без додаткового ад'юванта Приклад 4 Реципрокні титри кінцевих точок анти-Ab1-42IgG для загальних IgG і підкласів Одержаних аутбрідингом мишей SwissWebster поділяли на групи по 10 мишей кожна. Кожна група одержувала 30мкг Αb1-42-пептиду, що відповідає внутрішньому району АРР із довжиною 42 амінокислоти. Перша група не одержувала ад'юванта; друга група одержувала 50мкг 529 SE, що містить 2,5% масла; третя група одержувала 50мкг 529 SE, що містить 2,5% масла плюс 10мкг GM-CSF; четверта гр упа одержувала 10мкг GMCSF; п'ята гр упа одержувала SE, що містить 1,25% масла; шоста група одержувала SE, що містить 1,25% масла плюс 10мкг GM-CSF; сьома група одержувала 50мкг QS-21. Мишей імунізували підшкірно у сідничну область загальним обсягом 0,2мл, розділеним порівну в кожну з двох ділянок у основи хвоста/сідничної області. Імунізації виконували при тижні 0 і тижні 3. У мишей брали кров у дні 0, 20, 35 і 70. Сироватку аналізували з окремих мишей. Реципрокні титри кінцевих точок анти-Аb1-42-пептид-ІgG для загальних IgG і підкласів вимірювали в окремих сироватках (n=10 Swiss-Webster) на тижні 5 і на тижні 10. Результати IgG кінцевих точок наведені у таблицях 3 (тиждень 5) і 4 (тиждень 10). Результати підкласу IgG1 наведені у таблицях 5 (тиждень 5; групи, що не одержують ад'юванта або QS-21, не вимірювали) і 6 (тиждень 10). Результати для підкласу IgG2a наведені у таблицях 7 (тиждень 5; групи, що не одержують ад'юванта або QS-21, не вимірювали) і 8 (тиждень 10). Таблиця 3 Титри кінцевих точок анти-Ab1-42-IgG тижня 5 Ад'юванти Відсутні 529 SE (50) 529 SE (50)+GM-CSF (10) GM-CSF (10) SE (1%) SE (1%)+GM-CSF (10) QS-21 (50) Середній геометричний титр 12976 16204 608474 214497 33342 453367 4076 Стандартна помилка ±14386 ±225221 ±623575 ±609067 ±15493 ±162750 ±9036 Таблиця 4 Титри кінцевих точок анти-Аb1-42-IgG тижня 10 Ад'юванти Відсутні 529 SE (50) 529SE(50)+GM-CSF (10) GM-CSF (10) SE (1%) SE (1%)+GM-CSF (10) QS-21 (50) Середній геометричний титр 21426 86847 943075 1049414 255631 1005899 47222 Стандартна помилка ±24959 ±187792 ±989177 ±390525 ±114025 ±407108 ±159775 Таблиця 5 Титри кінцевих точок анти-Аb1-42-IgG тижня 5 Ад'юванти 529 SE (50) 529 SE (50)+GM-CSF (10) GM-CSF (10) SE (1%) SE (l%)+GM-CSF (10) Середній геометричний титр 461 1936 8654 4515 24422 Стандартна помилка ±627 ±12680 ±10100 +6273 ±19764 29 79426 30 Таблиця 6 Титри кінцевих точок анти-Аb1-42-IgG тижня 10 Ад'юванти Відсутні 529 SE (50) 529 SE (50)+GM-CSF (10) GM-CSF (10) SE (1%) SE (1%)+GM-CSF (10) QS-21 (50) Середній геометричний титр 2086 969 2076 8483 3623 12472 988 Стандартна помилка ±2448 ±521 ±4901 ±10998 ±3456 ±11502 ±895 Таблиця 7 Титри кінцевих точок анти-Аb1-42-IgG тижня 5 Ад'юванти 529 SE (50) 529 SE (50)+GM-CSF (10) GM-CSF (10) SE (1%) SE (1%)+GM-CSF (10) Середній геометричний титр 2224 94764 25554 1484 8405 Стандартна помилка ± 10099 ±849173 ±13191 ±2271 ±31303 Таблиця 8 Титри кінцевих точок анти-Аb1-42-IgG тижня 10 Ад'ютанти Відсутні 529 SE (50) 529SE (50)+GM-CSF (10) GM-CSF (10) SE (1%) SE (1%)+GM-CSF (10) QS-21 (50) Середній геометричний титр 5910 5944 47694 64910 2350 7421 3544 Приклад 5 Реципрокні титри кінцевих точок анти-Аb1-42IgG для загальних IgG і підкласів з кількостями GM-CSF, що варіюються Одержаних аутбрідингом мишей SwissWebster поділяли на групи по 10 мишей кожна. Кожна група одержувала 30мкг Аb1-42-пептиду при тижнях 0 і 3. Перша група одержувала 25мкг 529 SE плюс 10мкг GM-CSF; др уга гр упа одержувала 25мкг 529 SE плюс 1мкг GM-CSF; третя група одержувала 25мкг 529 SE плюс 0,1мкг GM-CSF; четверта гр упа одержувала 25мкг 529 SE плюс 10мкг GM-CSF у примуючій дозі і потім 25мкг тільки 529 SE у другій дозі; п'ята група одержувала Стандартна помилка ±39626 ±9100 ±88053 ±54824 ±2326 +31153 ±26332 25мкг QS-21; шоста група одержувала 25мкг QS21 плюс 10мкг GM-CSF. Мишей імунізували підшкірно у сідничну область загальним обсягом 0,2мл, розділеним порівну в кожну з двох ділянок у основи хвоста/сідничної області. У мишей брали кров у дні 0, 21 і 42. Реципрокні титри кінцевих точок анти-Аb1-42-пептид-ІgС для загальних IgG і підкласів вимірювали в окремих сироватках (n=10) на тижні 6. Результати IgG кінцевих точок наведені у таблиці 9. Результати підкласу IgG1 наведені у таблиці 10. Результати підкласу IgG2a наведені у таблиці 11. Таблиця 9 Титри кінцевих точок анти-Аb1-42-IgG тижня 6 Ад'юванти 529 SE (25)+GM-CSF (10) 529 SE (25)+GM-CSF (1) 529 SE (25)+GM-CSF (0,1) 529 SE (25)* QS-21 (25) QS-21 (25)+GM-CSF (10) Середній геометричний титр 353660 150935 86145 25365 1866 48970 Стандартна помилка ±148940 ±218332 ±91724 +54083 ±18430 ±116106 31 79426 32 * Перша доза 529 SE (25)+GM-CSF (10); друга доза тільки 529 SE (25). Таблиця 10 Титри кінцевих точок анти-Аb1-42-IgG тижня 6 Ад'юванти 529 SE (25)+GM-CSF (10) 529 SE (25)+GM-CSF (1) 529 SE (25)+GM-CSF (0,1) 529 SE (25)* QS-21 (25) QS-21 (25)+GM-CSF (10) Середній геометричний титр 10867 24909 6608 4511 581 7618 Стандартна помилка ±18333 ±18625 ±17736 ±8154 ±126 ±29145 * Перша доза 529 SE (25)+GM-CSF (10); друга доза тільки529 SE (25). Таблиця 11 Титри кінцевих точок анти-Аb1-42-IgG тижня 6 Ад'юванти 529 SE (25)+GM-CSF (10) 529 SE (25)+GM-CSF (1) 529 SE (25)+GM-CSF (0,1) 529 SE (25)* QS-21 (25) Середній геометричний титр 243758 116222 98018 16018 немає даних Стандартна помилка ±354383 ±143140 ±391797 ±165298 немає даних * Перша доза 529 SE (25)+GM-CSF (10); друга доза тільки 529 SE (25). Приклад 6 Реципрокні титри кінцевих точок анти-Аb1-42IgG для загальних IgG і підкласів з кількостями GM-CSF, що варіюються Одержаних аутбрідингом мишей SwissWebster поділяли на групи по 10 мишей кожна. Кожна група одержувала 30мкг Аb1-42-пептиду на тижнях 0 і 3. При імунізації на тижні 0 перша група одержувала 50мкг 529 SE; друга група одержувала 50мкг 529 SE плюс 10мкг GM-CSF; третя група одержувала 50мкг 529 SE плюс 5мкг GMCSF; четверта група одержувала 50мкг 529 SE плюс 2мкг GM-CSF; п'ята гр упа одержувала 50мкг 529 SE плюс 0,5мкг GM-CSF; шоста гр упа одержувала 1% SE. При імунізації на тижні 3 першап'ята групи одержували ту ж саму дозу, що і при імунізації на тижні 0, за винятком того, що 529 SE була зменшена з 50 до 25мкг. Кількість SE, одержувану шостою гр упою, збільшували з 1% при імунізації на тижні 0 до 1,2% при імунізації на тижні 3. Мишей імунізували підшкірно у сідничну область загальним об'ємом 0,2мл, розділеним порівну у кожну із двох ділянок у основи хвоста/сідничної області. У мишей брали кров у дні 2, 20 і 35. Реципрокні титри кінцевих точок анти-Аb1-42-пептид-IgG для загальних IgG і підкласів вимірювали в окремих сироватках (n=10) при тижні 5. Результати IgG кінцевих точок наведені у таблиці 12. Результати підкласу IgG1 наведені у таблиці 13. Результати підкласу IgG2a наведені у таблиці 14. Таблиця 12 Титри кінцевих точок анти-Аb1-42-IgG тижня 5 Ад'юванти 529 SE (50) 529 SE (50)+GM-CSF (10) 529 SE (50)+GM-CSF (5) 529 SE (50)+GM-CSF (2) QS-21 (25)+GM-CSF (10) 529 SE (50)+CSF (0,5) SE (1%) Середній геометричний титр 6119 52312 16392 321524 30133 36934 7784 Стандартна помилка ±3103 ±78421 ±17706 ±224875 ±134774 ±29449 ±9041 33 79426 34 Таблиця 13 Титри кінцевих точок анти-Аb1-42-IgG тижня 5 Ад'юванти 529 SE (50) 529 SE (50)+GM-CSF (10) 529 SE (50)+GM-CSF (5) 529 SE (50)+GM-CSF (2) 529 SE (50)+CSF (0,5) SE (1%) Середній геометричний титр 499 1424 3407 18328 3526 2556 Стандартна помилка ±676 ±2468 ±5653 ±8067 ±17606 ±5615 Таблиця 14 Титри кінцевих точок анти-Аb1-42-IgG тижня 5 Ад'юванти 529 SE (50) 529 SE (50)+GM-CSF (10) 529 SE (50)+GM-CSF (5) 529 SE (50)+GM-CSF (2) 529 SE (50)+CSF (0,5) SE (1%) Середній геометричний титр 1386 48519 11659 124815 26190 694 Приклад 7 Імунізація Th-CTL- і C4-V3-пептидом макакрезус Наступний експеримент спланований для прямого порівняння кількості комбінованих форм пептидів і ад'ювантов у приматів (макак-резус) для ідентифікації потенційних комбінацій пептид/ад'ювант для переходу до клінічних дослідів на людині. Конкретно, форму 529 SE, що містить ад'ювант, оцінювали у порівнянні з неповним ад'вантом Фрейнда (IFА) у комбінацій з (1) пептидним кон'югатом, виробленим з SIV-env Тхелпер/Siv gag CTL (ST1-pllc), що має наступну послідовність: Стандартна помилка ±5173 ±148981 ±23132 ±167340 ±40254 ±1325 або пептидним кон'югатом C4-V3, виробленим із ВІЛ-1 (C4-V3 89.6P), що має наступну послідовність: Побудова дослідження: Для цього дослідження використовували всього 8 тварин, 4 Mamu-A*01+ і 4 Mamu-А*01-, як описано у таблиці 15. Таблиця 15 529 SE і GM-CSF у порівнянні з IFA Група № 1 2 Число тварин 2 Mamu-А01+ 2 Mamu-А01+ 3 2 Mamu-А01 4 2 Mamu-А01 Тварина 93x021 98n002 98n008 98n007 98n013 95x011 96x004 Тварини групи 1 одержували 0,5мл Th-CTLпептиду (1,0мг/мл) в емульсії типу вода у маслі з 0,5мл IFA у загальному об'ємі 1,0мл. Тварини групи 2 одержували 0,5мл ST1-р11С (1,0мг/мл), об'єднані з 240мкг GM-CSF людини, 50мкг 529 SE з кінцевою концентрацією масла 1% у загальному об'ємі 1,0мл. Тварини групи 3 одержували 0,5мл пептиду C4-V3 89.6P (2,0мг/мл) в емульсії вода у Імуногенна композиція ST1-p11C ST1-p11C Ад'ювант IFA 529 SE/GM-CSF C4-V389.6P IFA C4-V389.6P 529 SE/GM-CSF маслі з 0,5мл IFА, кінцевий об'єм 1,0мл. Нарешті, тварини групи 4 одержували 0,5мл пептиду C4V389·6P (2,0мг/мл), об'єднані з 250мкг GM-CSF людини, 50мкг 529 SE з кінцевою концентрацією масла 1% у загальному об'ємі 1,0мл. Усіх тварин імунізували внутрішньом'язовою ін'єкцією зі схемою введення на 0, 4 і 8 тижнях. Проби периферичної крові брали безпосередньо 35 79426 36 перед тижнями 1 або 2 після кожної імунізації для Форма C4-V389·6P+529 SE/GM-CSF, що ввомоніторингу індукції CTL за фарбуванням тетрадили внутрішньом'язовою ін'єкцією в одному місці меру, р11С (Cys Thr Pro Туr Asp lle Asn Gin Met; три рази тваринам групи 4, була зв'язана тільки з SEQ ID NO:3, амінокислоти 19-27), специфічним одним мінорним несприятливим ефектом. Одна з реакціям ELISPOT і CTL-реакціям загальної маси тварин групи 4 (95x011) мала блювоту незабаром культури (Групи 1 і 2), а також за реакціями пеппісля одержання третьої імунізації на тижні 8. Інші тид-специфічних антитіл (Групи 1-4). несприятливі ефекти не спостерігались. Безпека і переносимість У всіх тварин групи 1 і гр упи 3, в яких тварини ST1-p11C+IFA: Форма ST1-p11C+IFA, яку одержували IFA як ад'ювант, спостерігали істотні вводили внутрішньом'язовою ін'єкцією в одному реактивності місць ін'єкції. Ці результати вказумісці три рази тваринам групи 1, була пов'язана з ють на те, що 0,5мл IFA погано переносяться при істотною реактивністю місця ін'єкції. У однієї твавведенні внутрішньом'язовою ін'єкцією в одному рини (93x021) розвився абсцес розміром 1,5см у місці ін'єкції. Слід також зазначити, що 3 з 4 твамісці ін'єкції через два тижні після другої імунізарин, що одержували 529 SE/GM-CSF як ад'ювант, ції. У іншої тварини (95x009) також розвився абсмали блювоту на тижні 8 незабаром після імуніцес розміром 2,0см у місці ін'єкції через два тижні зації. Хоча відомо, що анестетик (кетамін) пов'япісля третьої імунізації, що прорвався через шкізаний із блювотою, не було документовано жодру і зажадав накладення пов'язки. ного випадку блювоти тварин протягом ходу ST1-p11C+529 SE/GM-CSF: Форма ST1цього дослідження. У той же час, існує недостатp11C+529 SE/GM-CSF, яку вводили внутрішньоньо доказів, щоб зв'язувати блювоту тварин з м'язовою ін'єкцією в одному місці три рази у тваякими-небудь шкідливими ефектами, пов'язанирин групи 2, була пов'язана з мінорними несприями з 529 SE/GM-CSF. тливими ефектами. Обидві тварини групи 2 мали Результати: Індукція клітинних імунних реакблювоту незабаром після одержання третьої імуцій (Групи 1 і 2) нізації при тижні 8. Інші несприятливі ефекти не Фарбування р11С-тетрамеру свіжовиділеної спостерігались. крові: C4-V389.6P+IFA: Форма C4-V389.6P+IFA, що Перед імунізацією і через один і два тижні півводили внутрішньом'язовою ін'єкцією в одному сля імунізації свіжовидідену периферичну кров місці три рази тваринам групи 3, була пов'язана з від усі х Mamu-A*01-позитивних тварин (Групи 1 і істотною реактивністю місця ін'єкції. У однієї тва2) піддавали скринінгу на присутність p11Cрини (98n013) розвився абсцес розміром 1,0см у специфічних CD3 +CD8+ Т-лімфоцитів за допомомісці ін'єкції через один тиждень після другої імугою фарбування розчинного тетрамеру МНС нізації. У іншої тварини (98n007) також розвився Класу І. Як показано у таблиці 16, тільки у однієї абсцес розміром 1,5см у місці ін'єкції через один тварини (93x021), серед тих, які одержували ST1тиждень після другої імунізації. Цей абсцес у тваp11C-петид у комбінації з ІЕА, виявлена наяврини зажадав дренування і накладання пов'язки ність індукованих імунізацією клітинних імунних через чотири тижні. реакцій у нестимульованій периферичній крові. C4-V389.6P+529 SE/6M-CSF: Таблиця 16 Процентне фарбув ання р11С-тетрамеру і р11С-специфічніреакції ELISPOT у св іжовиділеній периферичній кров і Тиждень 5 Тиждень 6 1 тиждень після 2 тижня після 2-ої імунізації 2-ої імунізації ELISPOT Фарбув ання ELISPOT Фарбув ання Фарбув ання ELISPOT Число SFC Форма тетрамеру Число SFC тетрамеру тетрамеру Число SFC на 106 кліа 6 св іжої кров і на 10 кліт ин св іжої кров і св іжої кров і на 10б клітин тин ST1-p11C+IFA 0,02 0,0 0,00 0,0 0,00 3,8 ST1-p11C+IFA 0,02 Немає даних 0, 15 56,3 0,12 21,9 ST1-p11C+529 SE/GM-CSF 0,00 0,6 0,05 0,0 0,01 6,3 ST1-p11C+529 SE/GM-CSF 0,05 0,0 0,04 15,0 0,01 9,4 Тиждень ПРО Перед імунізацією Тв арина/ група 95x009 (1) 93x021 (1) 98n002 (2) 98n002 (2) Тв арина 95x009 (1) 93x021 (1) 98n002 (2) 98m002 (2) Тиждень 8 Тиждень 9 Тиждень 10 4 тижні після 1 тиждень після 2 тижні після 2-ої імунізації 3-ої імунізації 3-ої імунізації Форма Св іжа кров ELISPOT Св іжа кров ELISPOT Св іжа кров ELISPOT ST1-p11C+IFA 0,00 Немає даних 0,01 2,5 0,02 1,9 Немає даНемає даST1-p11C+IFA 0,02 Немає даних 0,14 0,02 них них Немає даST1-p11C+529 SE/GM-CSF 0,06 Немає даних 0,00 0,00 3,8 них Немає даST1-p11C+529 SE/GM-CSF 0,02 Немає даних 0,02 0,00 0,0 них 37 79426 38 Нав едені у в игляді проценту CD3+ CD8+ Т-лімфоцитів св іж овиділеної кров і, що зафарбов уються позитив но р11Стетрамером; ND, не в иконували. Р11С-специфічні реакції ELISPOT: для додаткової оцінки індукції клітинних імунних реакцій у тварин Групи 1 і 2 лімфоцити свіжовиділеної периферичної крові піддавали скринінгу на присутність р11С-специфічних CD3+CD8+ T-лімфоцитів за допомогою аналізу ELISPOT. Як показано у таблиці 16, тільки тварина 93x021, що продемонструвала детектовані рівні рНС-специфічних CD8+ Т-лімфоцитів відповідно до аналізу тетрамеру свіжовиділеної крові, мала детектовані р11С-специфічні CD8+ Т-лімфоцити відповідно до аналізу ELISPOT. У кожному випадку, позитивна реакція, визначена аналізом p11C-тетрамеру, підтверджувалась позитивною р11Сспецифічною реакцією ELISPOT. p11C-специфічні клітинні імунні реакції після стимуляції пептидом p11C in vitro: У спробі збільшення числа p11C-специфічних клітин перед аналізом свіжовиділені лімфоцити периферичної крові стимулювали in vitro пептидом p11С і rhIL-2. Через 14 днів одержані ефекторні клітини піддавали скринінгу на зв'язування p11C-тетрамеру, а також на p11C-специфічну літичну активність у стандартному аналізі CTL з вивільненням хрому. Результати аналізу p11C-тетрамеру і функціональних аналізів CTL показані у таблиці 17. Тварина 93x021, що постійно виявляла p11Cспецифічні імунні реакції у свіжовиділених лімфоцитах, продемонструвала дуже високий рівень зв'язування тетрамеру і функціональної активності CTL через один тиждень після другої імунізації. Це свідчило про індукцію дуже ефективної p11C-специфічної клітинної імунної реакції. На противагу результатам, що спостерігаються у свіжовиділених лімфоцитах, одна тварина з групи 2 (98n008), ST1-p11C+529 SE/GM-CSF) почала виявляти доказ р111С-специфічних клітинних імунних реакцій через два тижні після другої імунізації. Однак p11C-специфічна імунна реакція, що спостерігається у тварини групи 2, була значно більш низького розміру, ніж реакція, що спостерігається у цієї відповідаючої тварини з групи 1. Таблиця 17 Процентне фарбув ання p11С-тетрамеру і функціональні p11С-специфічні CTL-реакції після стимуляції пептидом p11С in vitro Тиждень 5 Тиждень 6 1 тиждень після 2 тижні після 2-ої імунізації 2-ої імунізації Фарбув ання CTL 20:1 Фарбув ання CTL 20:1 Фарбув ання Тв арина/група Форма CTL 20:1 Е:Т тетрамеру а Е:Тb тетрамеру Е:Т тетрамеру немає да95x009 (1) ST1-p11C+IFA 0,03 0,6 0,23 0,27 0,0 них 93x021 (1) ST1-p11C+IFA 0,03 0,0 34,31 66,3 15,15 4,69 немає да98n002 (2) ST1-p11C+529 SE/GM-CSF 0,21 0,0 немає даних 0,73 немає даних них немає да98n002 (2) ST1-p11C+529 SE/GM-CSF 0,16 0,0 немає даних 5,84 немає даних них Тиждень 0 Перед імунізацією Тиждень 8 Тиждень 9 4 тижні після 1 тиждень після 2-ої імунізації 3-ої імунізації Фарбув ання CTL 20:1 Фарбув ання CTL 20:1 Тв арина/група Форма тетрамеру Е:Т тетрамеру Е:Т немає да- немає 95x009 (1) ST1-p11C+IFA 0,76 3,0 них даних немає да- немає 93x021 (1) ST1-p11C+IFA 4,90 7,3 них даних немає да- немає 98n002 (2) ST1-p11C+529 SE/GM-CSF 0,07 5,7 них даних немає да- немає 98nOO8 (2) ST1-p11C+529 SE/GM-CSF 2,24 11,4 них даних а b Тиждень 10 2 тижні після 3-ої імунізації Фарбув ання CTL 20:1 Е:Т тетрамеру 0,72 немає них 0,0 да немає даних 0,39 j 0,0 5,00 0,0 Нав едені у вигляді проценту CD3+CD8+ культивов аних кліт ин, що зафарбовуються позитив но р11С-тетрамером. Нав едені у вигляді проценту р11С-специфічного лізису (мінус фон) при співв ідношенні ефектор:мішень (Е:Т) 20:1. Аналіз внутрішньоклітинних цитокінів: для додаткової характеристики функціональних і фенотипічних властивостей імуноген-індукованих пептид p11C-специфічних лімфоцитів внутрішньоклітинну експресію піддавали моніторингу на експресію цитокінів Тh1-типу IFN-g, TNFa, IL-2 і цитокіну Тh2-типу IL-4. Внутрішньоклітинну екс пресію цитокінів піддавали моніторингу в лімфоцитах периферичної крові після початкової стимуляції in vitro у присутності 10мкм пептидів р11С і rhIL-2. Потім ці культури підтримували протягом 14 днів з 40Е/мл IL-2. Через два тижні культивовані клітини стимулювали або тільки середовищем, або 10мкМ пептидом p11C+anti-Human 39 79426 40 CD28 і anti-human CD49d протягом однієї години. усі х клітин активно секретували IFN-g, TNFa або Через одну годину ці клітини обробляли БрефелIL-2. Приблизно 8% усіх CD3+ лімфоцитів після дином А протягом додаткових п’яти годин, щоб стимуляції пептидом p11C in vitro активно секредати можливість внутрішньоклітинним цитокінам тували цитокін Тh2-типу IL-4, і було виявлено, що сконцентруватись в ендоплазматичному ретикусекретуючі IL-4 клітини були обмежені субпопулумі. Внутрішньоклітинну експресію цитокінів виляцією CD3+CD4+ лімфоцитів. Після оротко чазначали потім кількісно проточною цитометрією сного повторного піддавання дії пептиду р11С, (таблиці 18 і 19). субпопуляції р11С-тетрамер+ і CD3+CD8+ лімфоЯк показано у таблиці 18, через два тижні піцитів активно секретували цитокіни Тh1-типу IFNсля стимуляції пептидом р11С in vitro CD3+ лімg і TNFa, але не могли бути індуковані до секреції фоцити периферичної крові тварини групи 1 значимо збільшених рівнів IL-2. Після повторного 93x021 (ST1-p11C+IFA) показали низький рівень впливу пептиду р11С секреція цитокіну Тh2-типу експресії цитокіну Тh1-типу, причому менше 1,5% IL-4 не змінилась. Таблиця 18 Аналіз внутрішньоклітинних цитокінів тварини 93x021 групи 1 через два тижні після другої імунізації Субпопуляція лімфоцитів b р11С-тетрамер+ b Загальний CD3+ b CD3+CD4+ b CD3+CD8+ Субпопуляція лімфоцитів b р11С-тетрамер+ b Загальний CD3+ b CD3+CD4+ b CD3+CD4+ Середовище INF-g p11C 977 7628 2488 5273 a S.I. Середовище TNFa p11C S.I. 27612 65567 5545 60573 28,3 8,6 2,2 11,5 90 12256 6252 6865 20342 51361 2827 48439 226,0 4,2 0,4 7,1 Середовище IL-2 p11C S.I. Середовище IL-4 p11C S.I. 751 2879 1377 1502 2004 6463 1683 4783 2,7 2,2 1,2 3,2 Немає даних 78069 71275 6794 Немає даних 90563 81437 9126 Немає даних 1,2 1,1 1,3 Таблиця 19 Аналіз внутрішньоклітинних цитокінів тварини 93x008 групи 2 через один тиждень після третьої імунізації Субпопуляція лімфоцитів b р11С-тетрамер+ b Загальний CD3+ b CD3+CD4+ b CD3+CD4+ Середовище INF-g p11C 545 6829 3310 3189 Субпопуляція лімфоцитів b р11С-тетрамер+ b Загальний CD3+ b CD3+CD4+ b CD3+CD4+ a S.I. Середовище TNFa p11C S.I. 560 10489 3789 6825 1,0 1,5 1,1 2,1 748 3402 1428 2587 454 13443 2567 11324 0,0 4,0 1,8 4,4 Середовище IL-2 11C S.I. Середовище IL-4 p11C S.I. 77 385 1379 36 456 2868 1761 2095 5,9 7,4 1,3 58,2 Немає даних 219789 170804 49053 Немає даних 202122 158175 44083 Немає даних 0,9 0,9 0,9 a S.I. Індекс стимуляції. Наведено у вигляді числа зазначених клітин, що зафарбовуються позитивно на зазначений цитокін, на 106 CD34+ клітин, мінус фонове фарбування (ізотипічний контроль). b Як показано у таблиці 19, через два тижні після стимуляції пептидом p11C in vitro, CD3+ лімфоцити периферичної крові з тварини 98п008 групи 2 (ST1-p11C+529 SE/GM-CSF) показали низький рівень експресії цитокіну Тh1-типу, причому менше 1,0% усіх клітин активно секретували IFN-g, TNFa або IL-2. Цікаво, що приблизно 20% усі х CD3+ лімфоцитів активно секретували цитокін Th2-типу IL-4 з 2,5-кратним збільшенням числа IL-4 продукуючих клітин у порівнянні з твари ною групи 1. Як і у випадку тварини групи 1, було винайдено, що секретуючі IL-4 клітини є обмеженими субпопуляцією CD3+CD4+ лімфоцитів. Після короткочасного повторного впливу пептиду p11C, субпопуляції p11С-тетрамер+ і CD3+CD8+ лімфоцитів тварини з групи 2 могли стимулюватись до секреції TNFa, але не IFN-g. На противагу тварині групи 1, після повторного впливу пептиду можна було спостерігати значиме збільшення експресії IL-2 CD3+CD8+ лімфоцитами. Як і у випадку тва 41 79426 42 рини групи 1, після повторного впливу пептиду моральних (у вигляді антитіл) реакцій титри р11С секреція цитокіну Тh1-типу IL-4 не зміниELISA анти-SТ1-p11C-антитіл вимірювали у силась. роватці тварин групи 1 і 2 безпосередньо перед Результати: Індуковані імуногеном гуморальімунізацією і через 1 і 2 тижні після другої і трені імунні реакції (Групи 1 і 2): тьої імунізації. Результати підсумовані у таблиці Для оцінки індукції імуноген-специфічних гу20. Таблиця 20 Титри кінцевих точок ELISA сироватки з макак-резус, імунізованих ST1-p11С (групи 1 і 2) Тварина 95x009 Група 1 Форма ST1-p11C+IFA 93x021 1 ST1-p11C+IFA 98x002 2 ST1-p11C+529 SE/GM-CSF 98n008 2 ST1-p11C+529 SE/GM-CSF Тиждень 5 6 9 10 5 6 9 10 5 6 9 10 5 6 9 10 Титр ST1-p11C-антитіла 12800 12800 6400 12800 51200 102400 51200 51200