Спосіб розмноження напівкарликових підщепів яблуні в культурі тканини

Изобретение относится к области культур изолированных тканей и органов и может быть использовано для получения растений из меристематических верхушек. Наиболее близким к изобретению является способ размножения растений в культуре ткани, в котором узел активно растущего побега с почками переносят на питательную среду Мурасиге-Скуга и культивир уют до получения побегов, после чего побеги микрочеренкуют и микрочеренки пересаживают на среду МурасигеСкуга для укоренения. Для узла активно растущего побега отработан состав питательной среды, в условиях которой он сможет активно развиваться. Классический состав среды Мурасиге-Скуга содержит макро- и микроэлементы. Рецепт приготовления питательной среды следующий: а) Приготовление раствора минеральных солей (макроэлементы): Однако при использовании в качестве исходного материала узла активно растущего побега не гарантирует возможность получения морфологически чистой, свободной от эндогенной микрофлоры высокопродуктивной культуры. Кроме того, отсутствие в питательной среде для укоренения Бета индолилмасляной кислоты задерживает процесс корнеобразования и дает слабо развитые корешки. Задачей изобретения является получение способа размножения полукарликовых подвоев яблони в культуре ткани, дающего возможность получения морфологически чистой высокопродуктивной культуры свободной от эндогенной микрофлоры и значительно повышающего процент укоренения, ускорения корнеобразования, усиления развития корней по отношению к существующим способам и повышающего жизнеспособность растений. Данная задача достигается тем, что в качестве эксплантата используется апикальная меристема, которую переносят на пита-тельную среду Мурасиге-Скуга, содержащую (мг) са харозу до 20000,0, тиамин 0,51,0, мезоинозит 90-100, агар 7000,0-10000,0, 6-бензиламинопурин 2,5-3,0 и бета-индолилуксусную кислоту 0,05-1,1 мг на 1 л среды, культивируют до образования побегов, после чего побеги микрочеренкуют и микрочеренки пересаживают на среду Мурасиге-Скуга для укоренения, содержащую (мг) тиамин 0,5-1,0, сахарозу 15000,0-20000,0 и в равном количестве Бета-индолилуксусную и Бета-индолилмасляную кислоты по 1,2-1,5 мг/л. Способ осуществляется следующим образом. Предложенный способ осуществляется на примере одногодичных побегов полукарликовых подвоев яблони 54-118. Мезоинозит, содержащийся в питательной среде для образования побегов служит фотосинтезатором. Увеличение количества агара до 7000,0-10000,0 необходимо для апикальной меристемы, чтобы она не утонула в питательной среде и находилась в устойчивом состоянии. Поэтому среда должна быть более агаризованной. Наличие других компонентов, а также отличия в их количестве объясняется тем, что такой состав адаптирован для размножения полукарликовых подвоев яблони 54-118. При вводе в культур у исходный зеленый материал стерилизуется следующим образом: эксплантаты на протяжении двух часов промывают проточной водопроводной водой, затем 10-15 мин, в мыльном растворе, после чего 10 мин. ополаскивают в дистиллированной воде с дальнейшей обработкой 4-6 сек 70% раствором спирта-ректификата и 2-3 мин. выдерживают в 15% растворе гипохлорида натрия. После этого эксплантаты 4 раза по 5 мин. промывают стерильной дистиллированной водой. Далее, в асептических условиях, в лами-нар - боксе под микроскопом вычленялась верхушечная меристема, оставляя при этом 2-3 пары примордиальных листочков. После этой операции эксплантат помещался на искусственную питательную среду Мурасиге-Скуга для индукции пролиферации, содержащую (мг) макро- и микроэлементы, сахарозу до 20, тиамин 0,5-1,0, пиридоксин 1,0-1,5, никотиновую кислоту 1,0-1,5, мезои-нозит 100, агар 7000,0-10000,0 и 6-бензила-минопурин 3,0 на 1 л среды или композиция 6бензиламинопурин и бета-индолилуксусная кислота 0,1 мг на 1 л среды. При этом наблюдалось влияние концентрации цито-кинина (6-бензиламинопурина) на количество образования латеральных почек на 1 конгломерат после второго пассажа. Контролем служила питательная среда без стимуляторов роста. В исследованиях были испробованы питательные среды с добавлением цитокинина (б-БАП) в концентрациях 1.0; 2.0; 3.0; 4,0 мг/л {табл.1). Для корнеобразования питательная среда содержала (мг) половинную концентрацию макроэлементов, тиамин 0,5-1,0, пиридоксин 1,0-1,5, никотиновую кислоту 1,0-1,5, сахарозу 15000,0-20000,0 с добавлением бета-индолилмасляной кислоты с различной концентрацией: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 мг/л среды. Контролем была питательная среда без стимуляторов роста (Табл.2). Культивирование эксплантатов проводилось в специальныхклиматических камерах с автоматизированным режимом: В каждом варианте исследований было использовано по 15 эксплантатов. Пассирование эксплантатовмикропобегов на свежие питательные среды проврдилось в стерильных условиях, которые исключали их заражение сапрофитной флорой. Анализ табл.1 йоказывает, что несмотря на наличие в питательной среде 6-БАП, пробуждение пазушных почек эксплантатов в первом пассаже не наблюдалось. Коэффициент размножения при этом равнялся единице. Начиная со второго пассажа из эксплантата формировались побеги и наблюдалось пробуждение почек, которые при пересадке на свежую питательную среду с повышенным содержанием 6-БАП давали большое количество новых побегов и почек. Удлинение микропобегов и массовое образование почек на один конгломерат отмечалось на питательной среде с концентрацией 3,0 мг/л 6-БАП. Для индукции ризогенеза в питательную среду добавляли бета-индолилмасля-ную кислоту (И МК) в концентрациях - 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 мг/л (табл.2). Макро-и микроэлементы оставались близкими к среде Мурасиге-Скуга, а из органических ве ществ добавлялся аденин и глицин. Развитые микропобеги пересаживались для корнеобразования на эти питательные среды. Анализ таблицы 2 свидетельствует, что процент укоренения микропобегов зависит от концентрации индолилмасляной кислоты. При использовании питательной среды без стимулятора ризогенеза (контроль исследований) было зафиксировано образование у микропобегов калюса, кое-где образовывались корешки. С увеличением концентрации ИМК от 0,5 до 1,5 мг/л корне-образование значительно увеличивалось. При использовании наименьшей концентрации ИМК корнеобразование шло очень медленно, корешки тоненькие, светло-розовые, при пересадке легко ломаются. С увеличением концентрации ИМК до 1,5 мг/л увеличивалось количество укорененных побегов. На питательной среде с концентрацией ИМК2,0 мг/л процесс корнеобразования затягивался. На отдельных эксплантатах наблюдалось образование калюса. Наиболее лучший результат при укоренении размноженных побегов получен на питательных средах с добавлением ИМК концентрацией 1,5 мг/л. При этом наблюдалось повышение укоренения побегов, увеличивалось количество между узлов, наблюдалось сильное развитие корней в длину, образовывались корни второго порядка и лучше развивался листовой аппарат. Указанный состав питательной среды испытан и адаптирован для размножения полукарликовых подвоев яблони 54-118. На других растениях эта среда не исследовалась. Предложенный способ размножения полукарликовых подвоев яблони в культуре ткани дает возможность получения морфологически чистой высокопродуктивной культуры и значительно повышает процент укоренения, ускорения корнеобразования, усиление развития корней и повышает жизнеспособность растений.