Середовище для розбавлення і заморожування сперми бугаїв

Изобретение относится к искусственному осеменению сельскохозяйственных животных, а именно к защитным средам для разбавления и криоконсервации спермы животных и может быть использовано на племпредприятиях. В настоящее время криоконсервация спермы имеет широкую практическую реализацию благодаря наличию целого ряда законченных технологий. Для повышения устойчивости клеток к криоповреждающим факторам используют специальные синтетические среды, создающие оптимальные условия для их криоконсервации. Известна среда для разбавления и замораживания спермы быков, содержащая помимо основных общеизвестных компонентов (лактоза, глицерин, желток) вещества ингибирующие окислительные процессы в сперме (т. е. обладающие биологически активными средствами) - сорбит или тиосульфат натрия. Компоненты этой среды не дефицитны, среда удобна в практическом применении и обладает удовлетворительными криофилактическими свойствами для спермы высокой морозоустойчивости. Существенным недостатком известной среды является: - незначительное повышение криорезистентности замораживаемой спермы, вследствие чего невозможно решить проблему замораживания спермы быков пониженного качества (не соответствующей существующим ГОСТам), т. е. решить проблему производственного брака спермопродукции; - незначительное повышение оплодотворяющей способности спермы в сравнении с существующими. В основу изобретения поставлена задача создать дешевую, доступн ую для широкого применения в практике среду для разбавления и замораживание спермы быков, которая благодаря использованию ее в качестве криоконсерванта, обладающего восстанавливающим (корректирующим) действием на морозоустойчивость спермы пониженного качества, обеспечивала бы снижение производственного брака спермопродукции и повышение ее оплодотворяющей способности. Поставленная задача решается тем, что среда для разбавления и замораживания спермы быков, содержащая дисахарид (лактоза или сахароза), глицерин, желток куриных яиц и биологически активный препарат, согласно изобретению, в качестве биологически активного вещества содержит препарат лекарственного растения - эхинацею пурпурную (Echinacea purpurea Moench) при следующем соотношении компонентов, мас.%: Заявляемую среду готовят следующим образом: дисахарид, сухую измельченную наземную часть или корень эхинацеи пурпурной и воду дистиллированную, взятые в количествах, указанных в составе, выдерживают в водяной бане в течение 15 минут, охлаждают и фильтруют через стерильную марлю. К фильтрату добавляют глицерин и желток куриных яиц. Эхинацея пурпурная или рудбекия пурпурная (Echinacea purpurea Moench) - многолетнее лекарственное растение из Северной Америки, в последние годы широко культивируется на Украине. Она содержит полисахариды, фенольные соединения, эфирное масло, фитостеролы, жирные кислоты, широкий спектр макро- и микроэлементов, т. е. по своему составу это целая композиция биологически активных веществ [Дудченко Л. Г. и др. Фито химическое исследование и фармакологические свойства видов рода эхинацеи/ /Тезисы докл. Ill Украинской конференции по медицинской ботанике. - К. 1992, с. 52-53]. В настоящее время хорошо изучены ее биологические свойства на организменном уровне. Известно, что эхинацея пурпурная является сильным активатором макрофагов, гранулоцитов и лимфоцитов, повышает резистентность организма, иммунитет и относится, таким образом, к растительным стимуляторам иммунной системы [Моисеева Г. Ф., Беликов В. Г. Иммуностимулирующие полисахариды высших растений. - Фармация, 1992, №3, с.79-84]. Препараты эхинацеи обладают противоаллергическими свойствами, мягко стимулируют центральную нервную систему [Авторское свидетельство СССР №1731207, кл.А61Д19/02, 1992]. Механизм действия препаратов эхинацеи на клеточном уровне не изучен. Предполагается, что биологически активные вещества эхинацеи пурпурной в составе криоконсерванта оказывают стабилизирующее действие на мембранные структуры спермиев, снижают перекисное окисление их липидов, в результате че го повышается устойчивость клеток к криоповреждающим факторам. Исследование проводили на сперме быков-производителей, принадлежащих Киевскому племпредприятию. Для получения, оценки и дальнейшей криообработки использовали методы, заложенные в технологическую схему племпредприятий и обусловленные действующей Инструкцией [Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных. - М. Колос, 1981]. Нативную и заморожено-оттаянную сперму оценивали методом корреляционной доплеровской спектроскопии на лазерном анализаторе качества спермы (Авторское свидетельство СССР №1731207, кл. А61D19/02, 1992). При этом оценивали такие показатели как подвижность спермиев (М, баллы), линейную скорость их движения (V, мкм/с), энергию (Е, усл.ед.) и специальные тесты для определения криорезистентности: по результатам замораживания - тест криорезистентности (КРТэ); прогнозирующий тест тест осмотической устойчивости скорости спермиев (OCTv). В исследованиях использовали эякуляты пониженного качества, которые в соответствии с действующим ГОСТом 23745-79 должны выбраковываться: I опыт - сперма среднего качества: М=6-7,5 балов, V=65-75мкм/с, Е=35-60ед, OCTv=37; ІІ опыт - сперма низкого качества: M=5-6 балов, V=55-65мкм/с, E=25-35ед., OCTv=20-37. Каждый полученный эякулят после оценки делили на разные части и соответственно разбавляли известной средой (прототип), а также заявляемыми средами. Сперму охлаждали 4-5ч и замораживали в парах азота. Хранили замороженные спермодозы в жидком азоте. В качестве прототипа использовали среду следующего состава, мас.%: Пpимеp 1. Опыт проводили на 23 эякулятах пониженного качества. В опыте использовали помимо известной среды (прототип) заявляемые среды следующего состава, мас.%: Среды для криоконсервации готовили следующим образом: навески лактозы и измельченной высушенной наземной части эхинацеи пурпурной заливали дистиллированной водой и выдерживали в кипящей водяной бане 15 минут, затем охлаждали, фильтровали и добавляли остальные компоненты. Каждый из эякулятов делили на 5 частей, разбавляли соответствующей средой и замораживали. Результаты замораживания в известной и заявляемых средах представлены в табл. 1. Данные табл. 1 свидетельствуют, что заявляемые среды хорошо защищают сперму при замораживании. Оптимальный состав из всех исследуемых сред оказался у сред №2 и №3. При их использовании криорезистентность составила свыше 47%, подвижность оттаянной спермы превышала контрольные величины (прототип) на 12,4%, выживаемость - на 37-45% при статистически значимой разнице. Состав №4 был наименее эффективным, результаты замораживания оказались на уровне контроля. Пример 2. В опыте использовали 12 эякулятов быков-производителей низкого качества. Каждый эякулят делили на 5 частей и соответственно разбавляли известной средой (прототип) или заявляемыми средами следующего состава, мас.%: Сахароза Глицерин Желток куриных яиц Корень эхинацеи пурпурной Вода дистиллированная остальное №1 10 5,0 10 0,1 №2 9,0 4,5 15 0,5 №3 8,5 4,0 15 1,0 №4 7,5 4,0 20 2,0 до 100 мл Результаты замораживания представлены в табл. 2 Сперма, замороженная с использованием известной среды после оттаивания имела очень низкие показатели, которые не соответствовали требованиям действующего ГОСТа 26030-83 и практически на племпредприятиях такая сперма выбрасывается. Сперма, замороженная в заявляемых средах состава №2,3 и 4 успешно перенесла замораживание и после оттаивания соответствовала всем требования ГОСТа Пример 3. Для проверки оплодотворяющей способности сперма быков была заморожена в известной и заявляемой среде (разделенный эякуляты). Оплодотворяющую способность оценивали на телках совхозов "Гоголевский" и "Красиловский" Броварского района Киевской области. Исследование проведено на 200 телках. Оплодотворяющая способность спермы, замороженной в заявляемой среде, составила 80,5%, что на 15,2% превышало прототип. Приведенные в примерах результаты свидетельствуют о более высокой биологической полноценности спермы при применении заявляемой среды в сравнении со средой, избранной в качестве прототипа. Это проявляется в следующем: - в более высокой подвижности спермиев на 12-17% (табл. 1 и 2), что свидетельствует о большей сохранности жизнеспособных клеток, при криоконсервации; разница статистически значима (р