Штам бактерій асіnетовастеr sр. імв в-7005 – продуцент екзополісахаридів

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения штамма бактерий, продуцирующего высоковязкие экзополисахариды (ЭПС) многофункционального назначения, которые могут быть использованы в качестве стабилизаторов дисперсных систем, а также загусти телей и эмульгаторов в нефтедобывающей, парфюмерной, химической, горнодобывающей, пищевой промышленности. Известны бактериальные культурыпродуценты ЭПС: Xanthomonas campestris 8162 [11 NRLL B-12075, NRLL B-12074 [2], АТСС 31601 [3], Pseudomonas elodea ATCC 31461 [4], Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 [5] и др. Недостатком этих продуцентов является фитопатогенность X.campestris, патогенность Ps.aeruginosa, большая естественная изменчивость штаммов, диссоциация их на мукоидные и немукоидные формы, что влечет за собой нестабильность выхода и качества синтезируемых ЭПС. Кроме того, каждый из ЭПС, синтезируемых указанными продуцентами, характеризуется определенными физико-химическими свойствами, ограничивающими возможность их практического использования Известен штамм Acinetobacter sp. ЦМП М B3243 [6, прототип], синтезируемый ЭПС, в состав которого входят глюкоза, галактоза, манноза и рамноза (3 : 1 : 2 : 1), пировиноградная и жирные кислоты. Наличие жирных кислот в составе ЭПС обусловливает совокупность уникальных свойств их растворов: способность к структурированию в присутствии одно- и двухвалентных катионов, повышению вязкости при низких значениях pH, низких скоростях сдвига, в системе -глицин. Задача настоящего изобретения - новый штамм бактерий продуцент ЭПС, характеризующи хся свойствами, превосходящими свойства растворов ЭПС согласно прототипу и расширяющими возможность их практического применения. Штамм бактерий Acinetobacter sp. ИМВ B7005 (лабораторный номер 12SR), устойчивый к стрептомицину (1000мкг/мл) и рифампицину (100мкг/мл). Штамм Acinetobacter sp. ИМВ B-7005 был получен из исходного штамма Acinetobacter sp. ЦМП М B-3243 (6, прототип) в два этапа. На первом этапе осуществляли прямой ступенчатый отбор вариантов, устойчивы х к стрептомицину (1 500мкг/мл), на втором из стрептомицинустойчивого штамма аналогично получали варианты, устойчивые к рифампицину (1 100мкг/мл). Получение мутантов осуществляли на агаризованной сусловой среде. Штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов ИМВ НАН Украины под номером B-7005. Штамм Acinetobacter sp. ИМВ B-7005 характеризуется следующими культуральноморфологическими и физиолого-биохимическими признаками. Культурально-морфологические признаки. Клетки Acinetobacter sp. ИМВ B-7005 представляют собой в логарифмической фазе роста толстые короткие палочки, в стационарной - кокковидные, расположенные парами, реже - в коротких цепочках. Размеры клеток 0,95 - 1,5 ´ 1,2 - 2,0мкм. Спор не образуют. Размножение клеток осуществляется путем бинарного деления. Клетки грамотрицательные, неподвижные. Электронно-микроскопические исследования подтвердили отсутствие органов движения и позволили выявить тяжи экзополисахаридов вокруг клеток. Клеточная стенка в срезах имеет грамотрицательный тип строения. Органеллы, вакуоли отсутствуют. Особенности роста на агаризованных средах. При росте на сусло-агаре образует выпуклые блестящие слизистые колонии кремоватого цвета с ровными краями, поверхность колоний гладкая, консистенция - слизистая, тягучая, при снятии с агара вся колония тянется за петлей. Диаметр колонии 4 - 8мм. Особенности роста на жидкой среде. При росте на жидкой минеральной среде с этанолом, глюкозой, фруктозой в качестве источника углеродного питания образует высоковязкую суспензию кремово-белого цвета. Физиолого-биохимические признаки. Аэроб. Каталазоположительный, оксидазоотрицательный, кислотонеустойчивый. Температурный диапазон роста 10 - 42°C. Оптимальная температура роста 24 - 30°C, pH 5,5 8,0. Оптимум 6,5 - 7,5. Желатин не разжижает. Крахмал не гидролизует. Молоко не сбраживает. Нитраты не восстанавливает. Сероводород, индол и ацетоин не образует. Отношение к источникам углерода. Ассимилирует сахарозу, глюкозу, фр уктозу, маннозу, целлюлозу, ксилозу, галактозу, арабинозу, этанол, маннит, уксуснокислый натрий, янтарнокислый натрий, пируват, малат, фумарат. При росте на глюкозе закисляет среду. Отношение к источникам азота. В качестве источника азотного питания использует соли аммония, нитраты, нитриты, мочевину, пептон. Растет на безазотистой среде Эшби. Олигокарбонитрофил. Отношение к факторам роста. Нуждается в дополнительных факторах роста дрожжевом автолизате и пантотеновой кислоте. Сведения о патогенности. Непатогенен для теплокровных животных и человека, нетоксичен. Условия хранения. Периодический пересев проводят один раз в месяц на скошенную агаризованную сусловую среду с последующим выращиванием при 30°C в течение 2 - 3 суток. Хранят при +4°C. Состав среды и условия получения посевного материала. Состав среды, мас.%: Культивирование проводят в колбах на качалке (220об/мин) при 30°C. Продолжительность инкубации 24 - 36 часов. В качестве инокулята используют двухсуточн ую культур у, выращенную на скошенном сусло-агаре. Культивирование Acinetobacter sp. для получения экзополисахаридов осуществляют в ферментере АК-210 (рабочий объем 5л) или БИОР (рабочий объем 150л) при температуре 28 - 30°C в условиях аэрации и перемешивания при концентрации растворенного кислорода 20 - 40%. pH среды 6,5 - 7,5, предпочтительнее 7,0, продолжительность культивирования 24 - 48 часов. Состав среды тот же, что и для получения посевной культуры. Количество этанола - 1,5% (объемных). Количество посевного материала - 3 - 5% от объема питательной среды. Количество синтезируемых ЭПС к концу процесса культивирования составляет 3 - 4г/л, концентрация биомассы - 1,8 - 2,5г/л. Пример 1. Химический состав ЭПС. Культивирование Acinetobacter sp. ИМВ B-7005 осуществляли в условия х, описанных выше. Культуральную жидкость, содержащую ЭПС, диализовали против дистиллированной воды в течение 7 суток, разбавляли дистиллированной водой в 2 - 3 раза, центрифугировали для отделения клеток (12000об/мин, 40мин). Супернатант концентрировали в вакууме (50°C) до первоначального объема, после чего осаждали ЭПС добавлением 1,5 объемов изопропанола. Осадок ЭПС промывали в чистом изопропаноле и высушивали при комнатной температуре. Для определения нейтральных моносахаридов и уроновых кислот, входящих в состав ЭПС Acinetobacter sp., образцы гидролизовали в запаянных ампулах с 2N трифтор уксусной кислотой в течение 2,5 часов при 121°C. Содержание нейтральных моносахаридов и уроновых кислот определяли с помощью углеводного анализатора "Biotronik LC2000" (колонка 0,38 ´ 12,5см, смола Dionex Ах811) в 0,5М Na-боратном буфере (pH 8,0) при 60°C и 0,04М фосфатном буфере (pH 2,4) при 70°C соответственно, детектировали при 570нм после реакции с 2,21-бицинхонинатом меди. Для определения липидов, входящи х в состав ЭПС Acinetobacter sp. проводили щелочную обработку растворов ЭПС. Для щелочного гидролиза ЭПС, приводящего к отщеплению липидного компонента, к 0,15% растворам ЭПС добавляли боргидрид натрия и твердый NaOH из расчета 10мг и 500мг соответственно на 100мг ЭПС, выдерживали при периодическом перемешивании в течение 48 часов при комнатной температуре, после чего нейтрализовали растворы концентрированной соляной кислотой и осуществляли экстракцию липидов гексаном или хлороформом. Для удаления гексана (хлороформа) полученный экстракт упаривали на роторном испарителе до постоянной массы. Липидные экстракты исследовали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках "SHufol" ("Kavalier", Чехия). Анализ проводили с использованием следующих систем растворителей (подвижная фаза): неполярная система: 1) гексан - диэтиловый эфир - уксусная кислота (90 : 10 : 1) 2) петролейний эфир - диэтиловый эфир (9 : 1) полярная система: 1) хлороформ - метанол - ацетон - уксусная кислота (90 : 10 : 6 : 1) 2) хлороформ - метанол - вода (65 : 25 : 4). ЭПС, синтезируемый Acinetobacter sp. ИМВ B7005, состоит из нейтральных моносахаридов глюкозы, галактозы, маннозы и рамнозы. Кислые группы представлены остатками глюкуроновой и пировиноградкой кислот. Молярное соотношение глюкозы, галактозы, маннозы, рамнозы, глюкуроновой и пировиноградной кислот составляет 3 : 1 : 2 : 1 : 1 : 1. В составе липидного компонента обнаружены высшие жирные кислоты, высшие спирты, моно-, ди-, триглицериды. Липиды связаны с углеводной цепью ЭПС прочной химической связью: их удается обнаружить только после щелочной обработки ЭПС. Содержание липидного компонента в составе ЭПС составляет 5,0 - 6,5%. Таким образом, состав ЭПС по предлагаемой заявке отличается от состава ЭПС согласно прототипу наличием глюкуроновой кислоты и липидного компонента. Пример 2. Свойства растворов ЭПС оценивали по изменению вязкости растворов ЭПС в присутствии катионов, в области низких значений pH (при переводе в -форму), в системе глицин. Растворы ЭПС, полученные после диализа культуральной жидкости, отделения клеток и кон центрирования в вакууме, разбавляли дистиллированной водой до концентрации 0,03% (по углеводам). К полученным растворам ЭПС добавляли до концентрации 0,1М; для перевода растворов ЭПС в -форму проводили обработку растворов ЭПС катионитом КУ-2 - 8 (300мг смолы на 15мл раствора ЭПС). Для изучения поведения растворов ЭПС в системе -глицин к раствору ЭПС добавляли 0,003М затем 0,015М глицина; раствор нагревали до 80°C и выдерживали при этой температуре 5 минут, после чего охлаждали. Вязкость растворов ЭПС измеряли на стеклянном капиллярном вискозиметре типа "Оствальд" при температуре 20°C. Относительное увеличение вязкости определяли как частное от деления разности значений вязкости растворов ЭПС одинаковой концентрации в исследуемых условиях и в дистиллированной воде йа значение вязкости раствора в дистиллированной воде и выражали в процентах. Вязкость 0,03% (по углеводам) растворов ЭПС Acinetobacter sp. (по предлагаемой заявке и по прототипу), а также 0,1% раствора ксантана фирмы "Sigma" в исследуемых условия х представлена в табл.1. Таким образом, Acinetobacter sp. ИМВ B-7005 синтезирует ЭПС, растворы которых обладают способностью существенно повышать вязкость в присутствии катионов, при понижении pH, в системе глицин. Относительное увеличение вязкости растворов ЭПС ИМВ B-7005 в исследуемых условиях выше по сравнению с вязкостью растворов ЭПС по прототипу. Улучшение реологических свойств растворов ЭПС ИМВ B-7005 обусловлено наличием в его составе липидного компонента. Ксантан фирмы "Sigma" не обладает свойствами, характерными для ЭПС, синтезируемых Acinetobacter sp. ИМВ B-7005. Пример 3. Свойства растворов ЭПС Acinetobacter sp. ИМВ B-7005 после щелочной обработки. Щелочную обработку ЭПС Acinetobacter sp., приводящую к отщеплению липидного компонента, проводили, как описано в примере 1. Для выделения ЭПС, не содержащих липидных компонентов, к растворам, полученным после экстракции липидов (пример 1) добавляли изопропанол, осадки ЭПС растворяли в дистиллированной воде, растворы диализовали против дистиллированной воды в течение 5 суток, после чего концентрировали в вакууме. Полученные растворы разбавляли дистиллированной водой до концентрации 0,03% (по углеводам) и исследовали изменение их вязкости в присутствии 0,1М -форме, системе -глицин (табл.2). Таким образом, растворы ЭПС, не содержащих в своем составе липидных компонентов, не структурируются катионами, не повышают вязкость при понижении pH, в системе -глицин, т.е. уникальные свойства растворов ЭПС, синтезируемых Acinetobacter sp., обусловлены наличием в их составе липидных компонентов.