Спосіб одержання фітогемаглютініна

Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности, и касается способа получения фитогемагглютинина. Известны способы получения веществ, обладающих митогенной активностью (А.с. СССР №1131506) путем экстракции тонко измельченной муки фасоли сорта "Красногвардейская" водой, подкисленной концентрированной соляной кислотой до pH 1,0, в присутствии антиоксиданта с последующим фракционным высаливанием кристаллическим сульфатом аммония, диализом, очисткой колоночной хроматографией на сефадексе G-100 и сублимационной сушкой целевого продукта. По сравнению с заявляемым описываемый способ более длителен, стадия очистки сложна по исполнению, целевой продукт, получаемый по этому способу, нестерилен, что значительно сужает область его использования. Наиболее близким к заявляемому является способ получения фитогемагглютинина путем экстракции измельченных семян фасоли белой 0,1н раствором соляной кислоты с последующим осаждением сульфатом аммония, диализированием, стерильной фильтрацией и лиофильной сушкой (ТУ 6 - 09 - 10 - 437 - 75). Недостатком этого способа является длительность процесса, недостаточно высокие специфическая активность и выход целевого продукта, получаемого по способу-прототипу. Целью заявляемого способа является повышение специфической активности и сокращение времени. Поставленная цель достигается тем, что измельченные семена экстрагируют в кислой среде с последующим осаждением экстракта, стерилизующей фильтрацией и сублимационной сушкой, причем, согласно изобретению, семена фасоли сорта "Гайдарская" экстрагируют буфером Мак-Ильвейна при pH 2,6 - 3,2 и соотношении сырье : экстрагент 1 : (4 - 6), осаждение экстракта проводят ацетоном трехкратно при соотношениях 1 : (0,4 - 0,6) : (0,75 - 1,5) : (0,75 - 1,75). Пример 1. 1кг семян фасоли сорта "Гайдарская" измельчают до состояния муки. Экстракцию проводят 5л екстрагента с pH 3,0 (буфер Мак-Ильвейна) в течение 2 часов при перемешивании в обычных условиях. После отделения шрота от экстракта последний осветляют на центрифуге при 3000об/мин в течение 20мин. Полученный экстракт 3,3л осаждают при перемешивании 1,65л холодного ацетона (T = +4°C). Смесь оставляют в холодном месте (T = +4°C) на 30мин. Недостаточную жидкость декантируют, а осадок отделяют на центрифуге (3000об/мин) в течение 20мин. Полученный осадок отбрасывают. К раствору вновь прибавляют при перемешивании 4,95л холодного ацетона и оставляют для образования осадка на 1ч в холодном месте при T = +4°C. Затем декантируют надосадочную жидкость, осадок отделяют на центрифуге при 3000об/мин в течение 2 - 3мин и растворяют в 700мл дистиллированной воды. Осадок отделяют центрифугированием при 3000об/мин в течение 5мин, затем отбрасывают, а к надосадочной жидкости прибавляют 700мл холодного ацетона. После отстаивания в течение 30 минут в холодном месте при +4°C, осадок отделяют центрифугированием, растворяют в центрифужных стаканах в 600мл воды. Осадок отделяют, а надосадочную жидкость высушивают сублимацией в вакууме в условиях, создающих стерильность работы. Раствор перед этим пропускают через микропористые капроновые мембраны с размером пор 0,3 - 0,8мкм и один слой фильтровальной бумаги. Фильтрат в стерильных условиях разливают по 1мл во флаконы. Предварительное замораживание проводят в течение 5 - 6ч при T = -25 - -30°C. Сушк у проводят при +30°C до полного удаления влаги во флаконах. После этого флаконы закрывают резиновыми пробками и алюминиевыми колпачками. Выход после одной загрузки составляет 6,4 ± 0,3 грамма фитогемагглютинина с активностью 450 ± 40 митотических пластин на 0,2мг препарата. В последующи х примерах при описанных выше режимах менялось влияние pH экстрагента на митогенную активность в выход целевого продукта. Результаты по выходу и активности приведены в табл.1. Как показано в табл.1 прирост митогенной активности наблюдается параллельно с увеличением выхода целевого продукта в кислой области и захвата в препарат сопутствующи х гликопротеинов. В последующи х опытах 10 - 17 при описанных выше режимах показано влияние соотношения сырья и экстрагента на митогенную активность и выход целевого продукта. Как следует из данных, приведенных в табл.2, оптимальным значением, способствующим получению целевого продукта с наибольшей активностью и выходом являются соотношение 1 : 5. В примерах 18 - 25 представлена зависимость митогенной активности и выхода ФГА от объема ацетона, взятого для первого осаждения. Фракционное отделение сопутствующи х гликопротеинов позволяет достичь максимума активности при соотношении 1 : 0,5. Дальнейшее снижение активности и увеличение выхода целевого продукта можно объяснить за счет попадания в препарат сопутствующи х ве ществ с большей молекулярной массой. В примерах 26 - 31 представлены данные по влиянию объема ацетона на митогенную активность и выход целевого продукта при втором осаждении. Несомненно, что оптимальным объемом, позволяющим достигнуть максимальной митогенной активности является соотношение смесь - растворитель 1 : 1. Последующее увеличение приводит к уменьшению активности целевого продукта. Данные, приведенные в табл.6, показывают, что при осуществлении заявляемого способа значительно сокращается время его проведения, повышается специфическая активность целевого продукта при одновременном сохранении/увеличении его выхода. При этом необходимо отметить, что продукт, полученный по заявляемому способу, хранится в течение 1,5 лет без изменения специфической активности в отличие от ФГА, полученного по способу-прототипу. Гарантийный срок хранения ФГА - 6 месяцев со дня изготовления (ТУ 6 - 09 10 - 437 - 75, лист 10). Фитогемагглютинин находит применение при проведении научно-исследовательских работ, например, для получения реакции бласттрансформации лимфоцитов и стимуляции их митотического деления в культуре лимфоцитов периферической крови человека.