Спосіб отримання активованих лімфоцитів

Спосіб отримання активованих лімфоцитів, що включає культивування лімфоцитів з регіонарних лімфатичних вузлів онкологічних хворих в системі in vitro, який відрізняється тим, що як активаційний стимул для лімфоцитів використовують автологічні пухлинні клітини в присутності низьких доз інтерлейкіну-2. (19) (21) u200605469 (22) 19.05.2006 (24) 15.11.2006 (46) 15.11.2006, Бюл. № 11, 2006 р. (72) Гріневич Юрій Якимович, Фільчаков Феодосій Вікторович, Шуміліна Катерина Станіславівна, Смоланка Іван Іванович, Процик Володимир Семенович (73) ІНСТИТУТ ОНКОЛОГІЇ АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ 3 18627 4 тів шляхом їх культивування з автологічними пухрі; виділена кількість лімфоцитів склала 2,8 107 линними клітинами в системі in vitro, що дасть моклітин. Для довгострокового культивування викожливість їх ефективного використання для імунористовували КС RPMI 1640 („Serva” Німеччина) з терапії онкологічних хворих з метою профілактики додаванням 2мМ L-глутаміна, 10% автологічної рецидивів та метастазів після проведення хірургісироватки, 4мкг/мл гентаміцина. чного лікування. Суспензію автологічних ПК одержували за доПоставлена задача вирішується таким чином. помогою механічної і ферментативної дезагрегації Лімфоцити отримують з регіонарних ЛВ, які тканини пухлини згідно описаного методу [6]. Після одержують під час оперативного втручання у хвоцього ПК обробляли мітоміцином С („Serva”, Німерих онкологічного профілю. ЛВ вміщують в охолоччина) у кінцевій концентрації 25мкг/мл протягом джений до 4 С розчин Хенкса і тричі промивають, 30 хвилин при 37 С з метою позбавлення їх прощоб позбутися домішок крові. Потім видаляють ліферативного потенціалу. Надалі клітини тричі жирову клітковину, капсулу і механічно дезагрегувідмивали охолодженим середовищем RPMI 1640 ють орган. Отриману суспензію клітин фільтрують шляхом центрифугування при 400g протягом 10 крізь капроновий фільтр. Клітини двічі відмивають хвилин. Виділено 9 105 клітин. Спільне культивуохолодженим розчином Хенкса за допомогою вання ПК і лімфоцитів ЛВ здійснювали в співвідцентрифугування (400g) протягом 10 хвилин. Поношенні 1:30 протягом 7 діб у 250-мілілітрових тім осад клітин ресуспендують в культуральному флаконах для культивування в термостаті при середовищі (КС) і підраховують їхню кількість у 37 С у вологій камері при вмісті в повітрі 5% СО2. гемоцитометрі. Для довгострокового культивуванУ роботі використовували препарат рекомбінантня використовують КС RPMI 1640 („Serva”, Німечного ІЛ-2 людини (Ронколейкін, „Біофарма”, Україчина) з додаванням 2мМ L-глутаміна, 10% автолона) в концентрації 200Од/мл, який вносили в КС на гічної сироватки чи плазми крові донорів групи АВ 2-у і 5-у добу культивування суспензії клітин. Кіль(інактивована, тестована на контамінацію вірусом кість лімфоцитів на 7 добу культивування склала гепатиту і ВІЛ), 40мкг/мл гентаміцина. 5,2 107 клітин. Суспензію життєздатних автологічних свіжоВизначення цитотоксичної активності лімфовиділених пухлинних клітин (ПК) одержують за цитів по відношенню до клітин-мішеней (клітини Кдопомогою механічної і ферментативної дезагре562, чутливі до цитотоксичної дії природних кілегації тканини пухлини згідно описаного методу [6]. рів, та клітини Daudi, резистентні до цитотоксичної Після цього ПК обробляють мітоміцином С дії природних кілерів) за методом [7] показало, що („Serva”, Німеччина) у кінцевій концентрації низький вихідний індекс цитотоксичності (1% та 0% 25мкг/мл протягом 30 хвилин при 37 С з метою відповідно) до 7-ї доби збільшився до 24,4% та позбавлення їх проліферативного потенціалу. На13,1% відповідно. далі клітини тричі відмивають охолодженим сереII. У хворої О-вої (45 років, рак лівої молочної довищем RPMI 1640 шляхом центрифугування при залози, ст. IIIб, кл. гр.II, історія хвороби №3129) 400g протягом 10 хвилин. Спільне культивування лімфоцити виділені з регіонарних ЛВ, які одержані ПК і лімфоцитів ЛВ здійснюють в співвідношенні під час оперативного втручання. ЛВ вміщували в 1:30 протягом 6-8 діб у 250 - мілілітрових флакоохолоджений до 4 С розчин Хенкса і тричі проминах для культивування в термостаті при 37 С у вали, щоб позбутися домішок крові. Потім видалявологій камері при вмісті в повітрі 5% СО2. У роболи жирову клітковину, капсулу і механічно дезагреті використовують препарат рекомбінантного ІЛ-2 гували орган. Отриману суспензію клітин людини (Ронколейкін, „Біофарма”, Україна) в конфільтрували крізь капроновий фільтр. Клітини двічі центрації 200Од/мл, який вносять в КС на 2-у і 5-у відмивали охолодженим розчином Хенкса за додобу культивування суспензії клітин. помогою центрифугування (400g) протягом 10 Приготування суспензії лімфоцитів та ПК здійхвилин. Потім осад клітин ресуспендували в КС і снюють при суворому дотриманні правил асептипідраховували їхню кількість у гемоцитометрі; вики. Усі реагенти для культури клітин стерилізують ділена кількість лімфоцитів склала 4 107 клітин. за допомогою мікрофільтрації (мембрани з розміДля довгострокового культивування використовуром пор 0,22мкм, «Millipor», США). вали КС RPMI 1640 („Serva”, Німеччина) з додаПрикладами реалізації заявленої корисної мованням 2мМ L-глутаміна, 10% автологічної сироделі можуть вважатися результати отримання акватки, 40мкг/мл гентаміцина. тивованих лімфоїдних клітин в автологічній систеСуспензію автологічних ПК одержували за домі in vitro. помогою механічної і ферментативної дезагрегації І. У хворої Ш-к (21 рік, рак язика з проростантканини пухлини згідно описаного методу [6]. Після ням в нижню щелепу, T3N0M0, історія хвороби цього ПК обробляли мітоміцином С („Serva”, Німе№964) лімфоцити виділені з регіонарних ЛВ, які ччина) у кінцевій концентрації 25мкг/мл протягом одержані під час оперативного втручання. ЛВ вмі30 хвилин при 37 С з метою позбавлення їх прощували в охолоджений до 4 С розчин Хенкса і ліферативного потенціалу. Надалі клітини тричі тричі промивали, щоб позбутися домішок крові. відмивали охолодженим середовищем RPMI 1640 Потім видаляли жирову клітковину, капсулу і мешляхом центрифугування при 400g протягом 10 ханічно дезагрегували орган. Отриману суспензію хвилин. Виділено 3 106 клітин. Спільне культивуклітин фільтрували крізь капроновий фільтр. Клівання ПК і лімфоцитів ЛВ здійснювали в співвідтини двічі відмивали охолодженим розчином Хенкношенні 1:30 протягом 7 діб у 250-мілілітрових са за допомогою центрифугування (400g) протяфлаконах для культивування в термостаті при гом 10 хвилин. Потім осад клітин ресуспендували 37 С у вологій камері при вмісті в повітрі 5% СО2. в КС і підраховували їхню кількість у гемоцитомет 5 18627 6 У роботі використовували препарат рекомбінантго лікування. ного ІЛ-2 людини (Ронколейкін, „Біофарма”, УкраїДжерела інформації: на) в концентрації 200Од/мл, який вносили в КС на 1. Rosenberg S.A. The immunotherapy and gene 2-у і 5-у добу культивування суспензії клітин. Кільtherapy of cancer //J. Clin. Oncol. -1992. -Vol.10, №2. кість лімфоцитів на 7 добу культивування склала -P.180-200. 7 2. Use of human leukocyte antigen-mismatched 5,16 10 клітин. allogeneic lymphokine-activatedkiller cells and Визначення цитотоксичної активності лімфоinterleukin-2 in the adoptive immunotherapy of цитів по відношенню до клітин-мішеней (клітини Кpatients with malignancies /Y. Kimoto, T. Tanaka, Y. 562, чутливі до цитотоксичної дії природних кілеTanji et al. //Biotherapy. -1994. - Vol.8, №1.- P.41-50. рів, та клітини Daudi, резистентні до цитотоксичної 3. Successful engraftment after autologous дії природних кілерів) за методом [7] показало, що transplantation of 10-day cultured bone marrow низький вихідний індекс цитотоксичності (2,7% та activated by interleukin-2 in patients with acute 0% відповідно) до 7-ї доби збільшився до 21,8% та lymphoblastic leukemia /F. Beaujean, F. Bemaudin, 16,4% відповідно. M. Kuentz et al. //Bone Marrow Transplantation. Таким чином, у описаному способі показана 1995. -Vol.15, №5. -P.691-696. можливість генерації цитотоксичної активності 4. Whiteside Т. Tumor-infiltrating lymphocytes as лімфоїдних клітин з регіонарних ЛВ онкологічних antitumor effector cells //Biother. -1992. -Vol.5. -P.47хворих в системі in vitro з метою їх використання 61. для проведення АІТ. Перспективність використан5. Development of a new culture system for ня такого підходу обумовлена не просто активаціhuman lymphokine-activated killer cells /M. Murata, T. єю лімфоцитів ІЛ, як це має місце при генерації Yano, M. Togami et al. //J. Immunological Methods. ЛАК, а індукцією специфічної протипухлинної ак1990. -Vol.129, №1. -P.89-95 (прототип) тивності у попередників цитотоксичних лімфоцитів, 6. Сергеева Н.С., Свиридова И.К., Мороз И.А. які накопичуються в регіонарному лімфоїдному Получение опухолевых клеток из тканей рака легколекторі, що дренує пухлину. Крім того, експансія кого человека с целью клонирования. //Лаб. дело. активованих лімфоїдних клітин в системі in vivo не -1991. -№2. -С.28-30. має потреби у введенні високих доз екзогенного 7. Микроскопический вариант метода опредеІЛ-2, тому що стимулом для їхньої проліферації є ления цитотоксической активности лимфоцитов ПК. Вищенаведене обумовлює ефективність і дос/Ф.В. Фильчаков, Т.П. Малиновская, Ю.А. Гринетупність цього засобу не тільки для імунотерапії вич, И.А. Близнюк. //Лаб. Диагностика. -1998. -№1. онкологічних хворих, але й для профілактики ре-С.28-30. цидивів та метастазів після проведення хірургічно Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601