Спосіб одержання гомозиготних рослин

Изобретение относится к биотехнологии (сельскому хозяйству) и может быть использовано в селекции растений, например сахарной свеклы, для получения гомозиготных линий в гетерозисной селекции. Известен способ получения гомозиготного материала при использовании самоопыления растений свеклы. Самоопыление проводится на протяжении нескольких лет в условиях пониженных температур (А.с. СССР №1512529, кл. A01H1/04). Способ характеризует признаки из которых отбор гомозиготных растений совпадает с существенным признаком изобретения. Однако, этот признак в способе, в отличии от изобретения, характеризуется высокой трудоемкостью процесса получения гомозиготного материала. Известен способ получения гомозиготных диплоидных линий свеклы при выделении гаплоидных растений с использованием маркерных генов у опылителя и диплоидизации гаплоидов при помощи колхицина (А.с. СССР №1635301, кл. A01H1/04). Данный способ характеризуется признаками из которых анализ плоидности макроструктур совпадает с существенным признаком изобретения. Однако эти признаки в способе, в отличии от изобретения, не обеспечивают снижения трудоемкости и длительности процесса получения гомозиготных растений из-за низкого процентного выхода гаплоидов, и необходимости удвоения хромосом у гаплоидных растений с помощью колхицина для получения дигаплоидного материала. Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ получения гомозиготных линий свеклы при использовании культуры изолированных пыльников или семяпочек (Зубенко В.Ф., Белоус В.Е., Ильенко И.И., Олейник Н.А., Бердышев А.Г., Перфильева Л.П. // Матер. Всес. науч. конф. по с.-х. биотехнологии. - Целиноград, 25 - 28 июня, 1991; Тез. выступ. - Целиноград, 1991. - С.73 - 74. Рус.). Сущность способа заключается в том, что изолированные неоплодотворенные семяпочки или пыльники высаживают на питательные среды в культуре "in vitro" с целью выделения гаплоидных растений. При проведении цитологического анализа определяют уровень плоидности новообразований. Диплоиды бракуют, как материал случайно полученный с диплоидной материнской ткани. Отбирают гаплоиды. Обрабатывают гаплоидные проростки полиплоидогенными веществами (например, колхицином) и переводят гаплоиды на диплоидный уровень. Такие признаки известного способа, как вычленение неоплодотворенных семяпочек, культивирование их на питательной среде, анализ плоидности макроструктур совпадают с существенными признаками заявляемого изобретения. Однако из-за выделения гаплоидов и необходимости последующей их обработки полиплоидизирующими веществами для получения гомозиготного материала, известный способ является трудоемким и длительным процессом. Заявляемое изобретение решает задачу: разработать способ получения гомозиготних растений путем использования растений гетерозиготных по маркерным признакам и визуального отбора по ним гомозиготных растений среди макроструктур, вместо колхицинирования гаплоидов для получения гомозиготного материала, что обеспечивает снижение затрат труда и времени. Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что в отличии от известного способа получения гомозиготных растений свеклы, включающего вычленение неоплодотворенных семяпочек, культивирование их на питательной среде, анализ плоидности полученных макроструктур, отбор гаплоидов и их полиплоидизацию при помощи полиплоидизирующих веществ для получения гомозиготного материала, в заявленном изобретении в качестве донора семяпочек (или пыльников) используют гетерозиготные по маркерным признакам растения и среди макроструктур по маркерным (рецессивным) признакам визуально отбирают дигаплоидные гомозиготные растения. Кроме того, в заявляемом изобретении в качестве маркерного признака при получении гомозиготных растений свеклы используют жизнеспособные хлорофильные мутации. В способе прототипе диплоидизированные гаплоиды могут быть отделены от диплоидов, случайно полученных с клеток материнской гетерозиготной ткани, и поэтому все диплоиды (спонтанно диплоидиаированные гаплоиды и диплоиды, полученные с материнской ткани) бракуют. В заявляемом способе в качестве донора пыльников или семяпочек используют гетерозиготные по маркерным признакам растения. В процессе культивирования пыльников или неоплодотворенных семяпочек гетерозиготного по маркерным признакам материала в культуре "in vitro" получают проростки с различными маркерными признаками гаплоидной или диплоидной природы. Проростки с диплоидным набором хромосом и доминантными признаками представляют собой спонтанно диплоидизированные гаплоиды и проростки полученные с клеток материнской гетерозиготной ткани. Эти проростки невозможно разделить и их бракуют. Растения с диплоидным набором хромосом и унаследовавшие рецессивные признаки это спонтанно диплоидизированные гаплоиды (дигаплоиды). Выделенные таким образом дигаплоидные растения используют в селекции, и в частности в селекции сахарной свеклы, как гомозиготные растения. Генетическая схема выделения дигаплоидов (гомозиготных растений) представлена на чертеже. Подбирают генетический маркер, который проявляется на проростках. Готовят донорные растения путем скрещивания доминантных и рецессивных гомозигот. Из гетерозиготного донорного растения вычленяют неоплодотворенные семяпочки и высаживают их на регенерационную среду и культивируют до появления проростков или проростков растений из каллуса. Проводят цитологический анализ и по количеству хромосом разделяют диплоиды и гаплоиды. Среди диплоидов визуально отбирают растения с рецессивными маркерными признаками, а диплоиды с доминантными признаками выбраковывают так как они представляют собой гетерозиготные диплоиды, полученные с клеток материнской ткани и дигаплоиды, которые по окраске невозможно отличить от гетерозиготных диплоидов. Диплоиды с рецессивными маркерными признаками представляют собой гомозиготные дигаплоидные растения. Эти растения используют в дальнейшем в селекционной работе. Расщепление по гетерозиготному гену у гаплоидов будет 1 : 1, такое же будет соотношение диплоидизированных гаплоидов с доминантным и рецессивным признаком. При использовании одного гена удается выделить 50% диплоидизированных гаплоидов (гомозиготных растений). Использование двух генов позволяет отбирать 75% диплоидизированных гаплоидов, а использование трех генов уже позволяет отбирать 87,5% гомозиготных диплоидных растений. Четыре гена дают возможность выделить почти 94% дигаплоидов, т.е. практически все диплоидизированные гаплоиды. При получении дигаплоидных растений свеклы используют разнообразные маркерные гены. Помимо снижения трудоемкости способа, достигается также улучшение создаваемого материала. Исключение воздействия колхицина приводит к тому, что в гетерозиготном материале не происходит вторичного появления гетерозиготности, за счет мутагенного действия колхицина. Сравнительный анализ заявленного способа с прототипом показывает, что заявленный способ отличается от известного новым существенным при знаком, заключающемся в том, что при культивировании пыльников или семяпочек гетерозиготного материала и получении макроструктур по маркерным (рецессивным) признакам можно выделить гомозиготные растения, которые прежде браковались, как диплоиды, полученные с клеток материнской ткани растения-донора. Для осуществления изобретения были проанализированы все группы генетических маркеров у свеклы и отобраны маркерные признаки, которые проявляются на ранней стадии развития. Жизнеспособные хлорофильные мутации растений контролируются рядом генов au, vir, ch и др. Доминантные аллели дают темнозеленую окраску проростков, растения с рецессивными аллелями имеют отличную окраску от растений с доминантными аллелями. Растения с рецессивным аллелем vir имеют светло-зеленую окраску, а растения с аллелем ch зеленовато-желтую окраску. Золотисто-желтую окраску приобретают проростки с аллелем au. Пример. Подобрали растения свеклы с доминантной маркерной окраской и растения с рецессивной маркерной окраской скрестили их между собой, подставив вместе во время цветения под один изолятор. Семена собрали с растений с рецессивной маркерной окраской. Среди всходов отобрали растения с доминантным признаком. Их вырастили и довели до бутонизации. Эти гетерозиготные растения служили донорами семяпочек. Семяпочки высаживают на регенерационные среды и культивируют в термостате при температуре 25 27°C и относительной влажности 75% до появления макроструктур. На ранней стадии развития наблюдают в зависимости от генотипа рецессивную или доминантную окраску проростков. Проводят цитологический анализ и определяют плоидность новообразований. Отбирают диплоидные проростки с рецессивной окраской. Это гомозиготные растения спонтанно диплоидизированные гаплоиды (дигаплоиды). В табл.1, 2, 3 приведены результаты опытов по получению гомозиготных растений сахарной свеклы. В экспериментах, при опылении растениядонора семяпочек облученной пыльцой, процент проростков с маркерным признаком и диплоидным набором хромосом, в среднем по повторностям, составил 0,99% от общего количества высаженных семяпочек и 8,6% от общего числа полученных проростков. В варианте при задержании опыления исходного материала до 7 9 дней, процент гомозиготных растений (дигаилоидов) был выше и соответственно составил - 1,75% и 8,8% (табл.1, 2). Процентный выход гомозиготных растений (спонтанно диплоидизированных гаплоидов) от числа полученных гаплоидов в первом эксперименте составил, в среднем по повторностям, 10,9%, во втором эксперименте - 10,8% (табл.3). Таким образом, использование разработанного способа позволило выделить 10% гомозиготных растений (дигаплоидов). По существующим способам выделять дигаплоиды невозможно. Полученные таким образом гомозиготные (дигаплоидные) растения используются в селекции сахарной свеклы, как исходный гомозиготный материал. Данный способ является эффективным приемом получения гомозиготных растений. При его использовании сокращаются затраты труда и время на получение необходимого количества гомозиготных растений (дигаплоидного материала). Затраты труда сокращаются за счет исключения процесса диплоидизации гаплоидов с помощью дорогостоящих по-липлоидогенных веществ. Затраты времени также сокращаются за счет исключения процесса диплоидизации гаплоидов на проведение которого требуется дватри года. Процесс диплоидизации гаплоидов с помощью полиплоидогенных веществ, например колхицина, требует воздействия колхицином на гаплоидные структуры, получения химерных (гаплоидных и дигаплоидных) тканей, отбор диплоидных тканей с помощью цитологических анализов в процессе нескольких пересадок тканей (расхимеривание) и наконец выращивание из отобранных диплоидных тканей растений. Применение предлагаемого изобретения в селекционной работе со свеклой позволит более эффективно создать новые гибриды при использовании гомозиготных растений, полученных в процессе спонтанной диплоидизации гаплоидных клеток.