Спосіб одержання гаплоідів рослин

Изобретение относится к сельскому хозяйству (биотехнологии) и может быть использовано в селекции растений, например, свеклы, для получения гаплоидов растений. Известен способ получения гаплоидных материалов с использованием маркерных генов опылителя [Авт. св. СССР № 1635301, кл. А 01 Н 1/04]. Способ характеризуется признаками, из которых анализ плоидности макроструктур и отбор гаплоидов совпадают с существенными признаками изобретения. Однако эти признаки в способе, в отличие от изобретения, не обеспечивают снижения трудоемкости процесса из-за низкого процентного выхода гаплоидов. Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существен-' ных признаков является способ получения гаплоидных растений свеклы с использованием изолированных семяпочек в культуре "in vitro" [Зубенко В.Ф., Белоус В.Е., Ильенко И.И., Олейник Н.А., Бердышев А.Г., Перфильева Л.П.//Матер. Всес. науч. конф. по с.-х. биотехнолог., Целиноград. 25-28 июня, 1991.: Тез. выступ. - Целиноград, 1991. - С. 73-74Рус]. Сущность способа заключается в том, что неоплодотворенные семяпочки вычленяют с нераскрывшихся бутонов, высаживают их на питательные среды, культивируют в темноте при температуре 20-25°С, относительной влажности 75% до появления макроструктур, определяют плоидность новообразований при помощи цитологического анализа и отбирают гаплоиды. Такие признаки известного способа как вычленение неоплодотворенных семяпочек, культивирование их на питательной среде, анализ плоидности макроструктур, отбор гаплоидов совпадают с существенными признаками заявляемого изобретения. Однако вычленение неоплодотворенных семяпочек с нераскрывшихся бутонов, когда они еще недоразвиты из-за незавершенности всех процессов гаметогенеза, ведет к снижению процентного выхода растений с гаплоидным набором хромосом, составляющего у известного способа 2-4%, что значительно ниже, чем у заявляемого изобретения. Заявляемое изобретение решает задачу снижения затрат при получении гаплоидов растений. При осуществлении способа получают до 62% гаплоидных структур, т.е. по сравнении с прототипом затраты на получение гаплоидов растений снижаются в 15-30 раз. Указанный технический результат обеспечивается тем, что в отличии от известного способа получения гаплоидных растений, включающего вычленение неоплодотворенных семяпочек из нераскрывшихся бутонов, культивирование нa питательной среде, анализ пломдности полученных макроструктур и отбор гаппоидов, в заявляемом изобретении вычленение неоплодотворенных семяпочек проводят после раскрытия цветков. В случаях, когда цветки собраны в соцветия и не происходит раскрытия цветков, например початок у кукурузы, неоплодотво-ренные семяпочки вычленяют после начала цветения и в период активного цветения. В раскрытом цветке прошли все этапы формирования элементов зародышевого мешка и полное развитие семяпочки. Полностью развитая семяпочка готова к оплодотворению, развитию и формированию зародыша. Это и обуславливает увеличение количества гаплоидов растений, по сравнению с использованием незрелых семяпочек вычленяемых из нераскрывшихся бутонов. Применение данного способа позволяет значительно снизить трудоемкость осуществляемого под лупой процесса вычленения семяпочек так как вычленение маленьких недозрелых семяпочек из мелкой завязи бутонов более сложно, чем вычленение развитых семяпочек из разросшихся крупных завязей раскрытых цветков. Сравнительный анализ заявляемого способа с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известного новым существенным признаком, заключающемся в том, что вычленение неоплодотворенных семяпочек проводят после раскрытия цветков. Таким образом, заявляемое изобретение является новым, так как оно не известно из уровня техники. В общедоступных источниках информации не выявлены сведения о том, что вычленение неоплодотворенных семяпочек проводимое после раскрытия цветков в сочетании с другими приемами повышает процентный выход гаплоидов. Достижение такого технического результата явным образом не следует из уровня техники и обеспечивается только при использовании всех существенных признаков изобретения в заявляемой последовательности. Это дает основание сделать заключение о соответствии заявляемого изобретения условию патентоспособности "изобретательский уровень". Заявляемое изобретение с помощью известных и новых существенных признаков обеспечивает существенное увеличение выхода гаплоидов и может быть использовано в селекции растений. Поэтому оно является промышленио применимым. Для осуществления изобретения у растений сахарной свеклы - доноров неоплодотворенных семяпочек проводят кастрацию цветков до раскрытия их и кастрированные цветки помещают под изолятор. После раскрытия цветков из завязи с использованием лупы и препаровальных игл под ламинарным боксом вычленяют неопло-дотворенные семяпочки. Семяпочки вводят в культуру "in vitro". В каждую пробирку высаживают по 5-6 штук. Используют питательную среду для высаживания семяпочек, основу которой входят макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге иСкуга с добавлением 1 мл/л - БАП, 0,1 мл/л НУК, 100 мг/л мезоинозита, 30 г/л сахарозы. Среда имеет рН равное 5,8. (Гаплоидия и селекция. - М., Наука.- 1976.-С. 111). Семяпочки культивируют в темноте при температуре 20-25°С и относительной влажности 75% до появления макроструктур. У образовавшихся макроструктур (каллус, проростки) с помощью цитологических методов подсчитывают количество хромосом и определяют плоидность (Цитологические и цитогенетические исследования в селекции сахарной свеклы. - Методические рекомендации. - Киев: Наукова думка. - 1982. - С. 9). Затем отбирают гаплоиды и используют их для последующего создания гомозиготных линий или других целей. Данный способ является эффективным приемом стимуляции гаплоидии. При его использовании значительно увеличивается частота образования гаплоидных структур свеклы (см. таблицу). Культивирование семяпочек, выделенных из раскрывшихся цветков, увеличивает частоту образования гаплоидных структур больше, чем в 30 раз при этом частота образования гаплоидного каллуса увеличивается почти в 40 раз, а густота образования гаплоидных проростков увеличивается в 20 раз. Соответственно в 2040 раз снижаются затраты на получение гаплоидов сахарной свеклы. Применение предлагаемого изобретения в селекционной работе со свеклой позволит более эффективно создавать новые гибриды при использовании гомозиготных материалов, полученных на основе гаплоидов.