Спосіб отримання інокулюму гетеробазидіальних грибів

Изобретение относится к биотехнологии культивируемых соматических структур макромицетов, а именно, к способам подготовки посевного'материала гетеробазидиальных грибов для последующей инокуляции жидких или твердых субстратов. Кинетические показатели роста культуры микроорганизмов вне зависимости от состава питательной среды в значительной степени определяются качеством и количеством вносимого посевного материала. Способы подготовки посевного материала для плесневых или базидиальных культур существенно отличаются. Так, например, проблема оптимальной нагрузки инокулюма у дейтеромицетов сравнительно легко решается благодаря их высокой спорообразую-щей способности. Инокуляция питательных субстратов в данном случае осуществляется споровой суспензией заданного титра [1]. Дикариотические культуры гетеробазидиальных грибов, как и базидиомицетов в целом, лишены спороношений и развиваются в виде стерильного вегетативного мицелия. Таковы, в частности, культуры выращиваемых съедобных гетеробазидиальных грибов Tremella fuciformis Berk, и Auricularia auriculajudae(Bull. et St. Amans) Wettst [2]. Широко известен способ производства посевного мицелия съедобных грибов на стерильном зерне, чаще всего ржи, с получением так называемого "зернового мицелия" [3,4]. Недостаток данного способа заключается в том, что при его воспроизводстве получают малое количество грибных пропагул на единицу веса зернового мицелия, где единичной точкой роста (диаспорой) фактически является отдельная единичная зерновка, проросшая мицелием. Это приводит к большому расходу посевного мицелия, который вносят из расчета 5-10% от веса инокулируемого субстрата. Существенное повышение числа пропагул на единицу массы посевного мицелия достигается при выращивании культур базидиальных грибов в глубинных условиях на жидких питательных средах [5]. Наиболее близким к предлагаемому нами способу инокуляции гетеробазидиальных (прототипом) грибов является способ получения инокулюма из биомассы глубинного мицелия путем его измельчения в гомогенизаторе [6]. Получаемый по упомянутому способу гомогенат содержит около 80% фрагментов мицелия длиной 150 мкм, а также более крупные фрагменты. Недостатком способа по прототипу является потеря жизнеспособности значительного числа клеток мицелия в результате механического повреждения гифальных структур. Такой способ приготовления гомогената приводит к уменьшению линейной скорости гиф в регенерировавших колониях на плотной питательной среде, а в глубинных условиях удлиняется лаг-фаза [7]. Кроме того, показано, что следствием гомогенизации мицелия базидиального гриба Schizophyllum commune Fr. на достаточно мелкие фрагменты является нарушение синхронности деления исходных пар ядер дика-риона, в результате чего клетки мицелия новой генерации не являются дикариотическими и содержат различное количество ядер, что приводит к нарушению межгеномных отношений комплементарных ядер [8], Известно, что наивысшие показатели кинетики глубинной мицелиальной культуры достигаются при пульповидной форме роста мицелия, а формирование мицелиальных шарообразных структур, максимальная величина диаметра которых не должна превышать 5 мм, снижает эти характеристики. Известно также, что пульповидный характер роста мицелия непосредственно связан с мелкодисперсностью инокулюма, который в идеальном случае должен состоять из одноклеточных пропагул. Именно при прорастании пропагул однойдвумя ростковыми гифами обеспечивается в течение непродолжительного времени экспоненциальный характер прироста биомассы индивидуальной колонии [9,10]. Таким образом, способ приготовления инокулюма базидиальных грибов методом гомогенизации мицелия имеет естественные ограничения, обусловленные необходимостью получения возможно более мелких пропагул - фрагментов многоклеточного мицелия, что неизбежно ведет, по мере углубления степени гомогенизации, кувеличению степени потери жизнеспособных клеток и возрастанию неблагоприятного воздействия механического шока на получаемый инокулюм. Сущность изобретения заключается в использовании гаплоидных культур гетеро-базидиальных грибов, развитие которых в виде дрожжевидно почкующихся клеток генетически дифференцировано, что устраняет необходимость механической гомогенизации дикариотического мицелия на одноклеточные фрагменты. Для получения дрожжевидных гаплоидных культур суспензию базидиоспор, полученных из зрелого плодового тела гриба, рассевают на поверхность питательной агаровой среды и выделяют монобазидиоспоровые культуры путем отсева одиночных дрожжевидных колоний. Способ может быть использован для всех видов гетеробазидиальных грибов, базидиоспоры которых способны прорастать почкующимися клетками [11], и может быть проиллюстрирован следующим примером. Пример. Зрелое плодовое тело тремеллы извилистой - Tremella mesenterica Retz. насыщают стерильной водой до полного набухания, после чего помещают во влажную камеру при температуре 20-22°С гименофором вниз над стерильной чашкой Петри. Осевшие на чашку базидиоспоры переносят микробиологической петлей в пробирку с 3-5 мл стерильной водопроводной воды и готовят серию последовательных разведений 1:5 или 1:10 в пробирках со стерильной водой. Суспензию базидиоспор из каждой пробирки рассевают штрихом в чашки Петри на поверхность сусло-агара и инкубируют при 27°С. Отдельные колонии отсевают на косяки с сусло-агаром или другой питательной средой, пригодной для роста гриба. Оптимум прорастания базидиоспор соответствует нейтральной реакции питательной среды. Базидиоспоры прорастают, чаще всего, несколькими ростковыми трубками, на вершине которых формируются почкующиеся дрожжевидные клетки (рис.1). Колонии, полученные из таких клеток на плотной питательной среде, являются гаплоидными. При дальнейших пересевах культуры на жидкие или плотные питательные среды (пивное сусло, среда Норкранс с сахарозой и т.д.) гриб развивается в виде почкующихся клеток (рис.2). На очень бедных средах или водопроводном агаре может наблюдаться пролиферация отдельных клеток короткой гаплоидной гифой (рис.3).