Спосіб одержання комплексу полісахаридів гемостатичної та протизапальної дії

Корисна модель відноситься до фармації та медицини, а саме до способів одержання біологічно активних речовин з рослинної сировини. Сучасний арсенал лікарських засобів з гемостатичною та протизапальною дією представлений, насамперед, засобами синтетичного походження, які здебільшого мають негативну побічну дію. Альтернативним рішенням є створення лікарських засобів рослинного походження з м'якою дією та практичною відсутністю негативних побічних ефектів. Відомий спосіб одержання протимікробного, кровоспинного та цитотоксичного засобу [Деклараційний патент 56771А, Україна, МПК7 А61К35/78, заявл.05.09.2002, опубл.15.06.2003, Бюл. №5], який передбачає екстракцію 70% етанолом попередньо знежиреної хлороформом подрібненої кори рослин роду вільха. Екстрагування здійснюють методом дрібної мацерації при загальному співвідношенні сировина : екстрагент 1:10-1:15. До недоліків зазначеного способу можна віднести використання у якості реактивів хлороформу та спирту етилового: перший не є безпечним і потребує використання спеціальних засобів захисту при здійсненні способу, а другий витрачається у великій кількості, що впливає на вартість одержаного засобу. В якості прототипу вибраний відомий спосіб отримання комплексу полісахаридів протиалергічної дії [Патент 24032, Україна, МПК6 А61К35/78, заявл.28.12.95, опубл.31.08.98, Бюл. №4] шляхом трикратної екстракції листя смородини чорної гарячою водою при співвідношенні сировина : екстрагент 1:5-6, об'єднання одержаних екстрактів, їх упарювання до 1/7 попереднього об'єму з наступним осадженням чотирикратною кількістю спирту етилового 92-95% при співвідношенні екстракт : спирт етиловий 1:4, відокремленням осаду, його промивкою спиртом етиловим, сушкою та подрібненням. Проте в результаті здійснення відомого способу одержують засіб з вузькоспрямованою фармакологічною дією - протиалергічною. Завданням корисної моделі є створення способу одержання комплексу полісахаридів гемостатичної та протизапальної дії шляхом екстрагування листя акації білої гарячою водою при заданих параметрах способу, в результаті чого одержують біологічно активну субстанцію з гемостатичною та протизапальною дією, яка може бути використана як активна діюча речовина у складі лікарських засобів, виконаних у різних лікарських формах і придатних до тривалого застосування внаслідок м'якої дії та практично нетоксичності засобу і відсутності побічних ефектів. Поставлене завдання вирішується таким чином, що у способі одержання комплексу полісахаридів гемостатичної та протизапальної дії, який включає екстракцію рослинної сировини водою, упарювання одержаного екстракту, осадження спиртом етиловим, відокремлення осаду, його сушку та подрібнення, винаходом передбачено, що як рослинну сировину використовують листя акації білої, екстракцію проводять при співвідношенні сировини до екстрагенту 1:14-1:15,а екстракт упарюють до 1/15 попереднього об'єму і осаджують трикратною кількістю спирту етилового. Заявлений спосіб передбачає використання в якості рослинної сировини листя акації білої. Відомі дані про використання в народній медицині суцвіть акації білої в якості в'яжучого, сечогінного, спазмолітичного, протисудомного, жарознижуючого, відхаркувального та гіпоазотемічного засобу. Використання листя акації білої як лікарської сировини для одержання засобів з гемостатичною та протизапальною дією є невідомим з джерел інформації та неочевидним. Крім того, заявлений спосіб передбачає використання листя акації білої у період листопаду, що дозволяє використовува ти дешеву і доступн у сировину, завдяки широкому розповсюдженню акації білої в Україні. Експериментальним шляхом було визначено, що оптимальним екстрагентом для одержання комплексу полісахаридів з гемостатичною та протизапальною дією з вибраної сировини є гаряча вода бажано 90°С. Цей екстрагент також вигідний з боку технологічних вимог до здійснення способу, бо є доступним, дешевим та екологічно безпечним. Співвідношення сировина : екстрагент 1:14 - 1:15 знайдено експериментальне і є оптимальним для даної сировини. Менша кількість екстрагенту не дозволяє ефективно провести екстракцію і потребує більшої кратності екстракції, а також створює труднощі технологічного характеру при обробці великої кількості сировини малим обсягом розчинника (закупорка зливної горловини тощо). Більша кількість екстрагенту нераціональна, тому що екстракція повністю досягається заявленою кількістю екстрагенту. Збільшення останнього веде до зниження концентрації екстракту і, як наслідок, до збільшення енергетичних втрат і часу на упарювання екстракту. Шляхом проведення серії експериментів були визначені інші оптимальні технологічні параметри заявленого способу: у парення екстракту до 1/15 попереднього об'єму та осадження комплексу полісахаридів трикратною кількістю спирту етилового. Використання сполучення нетрадиційного виду рослинної сировини і усіх параметрів заявленого способу дозволяє одержати цільовий продукт - комплекс полісахаридів, який має гемостатичну і протизапальну активність. Заявлений спосіб здійснюють наступним чином. Зібране у період листопада висушене подрібнене листя акації білої завантажують у реактор з мішалкою і паровою сорочкою, заливають гарячою водою 90°С у співвідношенні сировина - екстрагент 1:14-15. Екстракцію проводять на протязі 2-3-х годин при перемішуванні і постійно витриманій температурі - 90°С. Для найбільш повного вилучення комплексу полісахаридів одну й ту ж порцію сировини піддають екстракції принаймні двічі. Одержані зливи з'єднують і упарюють на вакууум-випарювальному апараті до 1/15 початкового об'єму. В упарений екстракт додають 95% етиловий спирт у співвідношенні екстракт : спирт 1:3 і залишають на добу до повного висадження. Надосадову рідину видаляють при фільтруванні під вакуумом, осад промивають етиловим спиртом, сушать і подрібнюють. Вихід готового продукту 5,5-7% від повітряне сухої сировини. Заявлений спосіб ілюструється наступними прикладами: Приклад 1. 1,7кг подрібненого повітряно-сухого листя акації білої завантажують у реактор з мішалкою і паровою сорочкою, заливають 25л гарячої води 90°С і екстрагують при перемішуванні і постійній температурі 2,5 години. Екстракцію проводять двічі. Одержані екстракти 22,5л і 22,0л відповідно об'єднують і упарюють на вакуум-випарювальному апараті. Одержаний упарений екстракт в кількості 1,5 заливають в чан, додають 4,5л етилового спирту 95%, перемішують й залишають на добу до повного висадження. Осад відділяють на фільтрі під вакуумом, промивають 95% етиловим спиртом, суша ть і подрібнюють. Вихід цільового продукту 112,20г, тобто 6,6% від початкової кількості повітряно-сухої сировини (1,7кг). Готовий продукт (субстанція) являє собою світло-кремовий негігроскопічний порошок, переважно комплекс полісахаридів, який має гемостатичну та протизапальну активність. Приклад 2. Гемостатичну активність полісахаридного комплексу, одержаного за заявленим способом, вивчали у дослідах in vitro. Гемостатичну дію визначали за часом згортання крові при додаванні у фізіологічний розчин комплексу полісахаридів у порівнянні з контролем (фізіологічний розчин) та відомими гемостатиками. Дію комплексу полісахаридів визначали у дозах 0,1мг/мл, 0,2мг/мл, 0,3мг/мл, тобто відповідно 1мг, 2мг і 3мг субстанції розчиняли у 10мл фізіологічного розчину. Дослідження проводили за методом Альтгаузена, який базується на визначенні швидкості спонтанної появи перших ниток фібрину. Для цього на підігріте до температури 37°С знежирене предметне скло наносили краплю крові, які брали із вушної вени морської свинки, і додавали відповідний розчин комплексу полісахаридів. Через кожні 15-20сек. ін'єкційною голкою проводили по краплі крові до появлення першої нитки фібрину. В якості препаратів порівняння використовували гемостатик - 5% водний екстракт листя кропиви. Результати досліду представлені в таблиці 1. Таблиця 1 Вивчення гемостатичної активності комплексу полісахаридів, одержаних за заявленим способом Об'єкти дослідження Полісахаридний комплекс, одержаний за заявленим способом Доза, мг/мл 0,1 0,2 0,3 Контроль Водний екстракт листя кропиви Час згортання Гемостатична активність у порівнянні крові, с з контролем, % 135±3,8* 34,4 144±9,5* 30,0 108±3,9* 47,57 206±18,1 116±2,8* 43,7 *вірогідно стосовно контролю р £ 0,05 Результати досліджень свідчать про наявність гемостатичної дії у комплексу полісахаридів, одержаних за заявленим способом, найбільш виражена дія зафіксована в дозі 0,3мг/мл, швидкість згортання крові відповідала 108±3,9с. Одержані дані достовірно відрізнялись від значень в контролі та перевищували дію 5% водного настою листя кропиви. Приклад 3. Протизапальну активність полісахаридного комплексу, одержаного за заявленим способом, визначали, використовуючи модель "карагенінового набряку" у пацюків. Дана модель є найбільш інформативною для вивчення протизапальної дії за антиексудативним ефектом нових біологічно активних сполук, тому що дозволяє у динаміці розглянути процес розвитку карагенінового запалення. Дослід проводили на білих безпороднихпацюках масою 200,0г. Набряк викликали субплантарним введенням 1% розчину карагеніну в кількості 0,1мл. Досліджуваний препарат уводили внутрішньошлунково за одну годину до ін'єкції карагеніну. Контрольні тварини одержували еквівалентну кількість води. В якості препаратів порівняння використовували вольтарен та альтан. Висновок про розвиток набряку робили за збільшенням обсягу лапи, який вимірювали у динаміці через 1; 2; 3; 24 години за допомогою механічного онкометра. Протизапальну активність досліджених речовин виражали у % та визначали за здатністю зменшува ти набряки у дослідних тварин у порівнянні з контрольними. Розрахунок проводили за формулою ПА = (DVo - DVк / DVк ) ´ 100 , де ΔVο і ΔVк - різниця між набряклою та ненабряклою лапою відповідно у досліді та у контролі. Дані дослідження наведені в таблиці 2. Таблиця 2 Вивчення протизапальної активності (ПА) комплексу полісахаридів, одержаних за заявленим способом Препарати Через 1год. ПА, Обсяг % 2год. Обсяг 3год. ПА,% Обсяг 24год. ПА,% Полісахаридний комплекс 8,4±0,38* 48,1 8,00±1,2* 62,6 9,00±0,20* 64,2 акації, 20 мг/кг Вольтарен, 8 мг/кг 4,6±0,57* 71,6 4,б±1,9* 78,6 5,2±1,9* 79,3 Альтан, 8 мг/кг 7,00±1,77* 56,7 б,33±1,93* 70,4 7,17±3,07* 71,5 Контроль 16,2±1,2* 21,4±0,57* 25,2±0,57* *вірогідно стосовно контролю, р £ 0,05 Обсяг ПА,% 1,2±1,34* 81,5 2,83±0,87* 56,4 2,67±1,73* 58,92 6,50±1,06* % - протизапальна активність у порівнянні з контролем. Аналіз даних таблиці 2 свідчить, що полісахаридний комплекс, одержаний за заявленим способом, має протизапальну активність в усі періоди спостереження (1, 2, 3 години), але найбільш виражена протизапальна активність спостерігалася через 24 години і складала 81,5% в порівнянні з контрольною групою. Порівняльний аналіз з такими широковідомими протизапальними препаратами, як вольтарен і альтан, свідчить, що полісахаридний комплекс, одержаний за заявленим способом, незначно поступається їм за активністю у першу годину експерименту, але суттєво перевищує вищевказані препарати через 24 години після введення. Таким чином заявлено новий спосіб одержання комплексу полісахаридів з листя акації білої, що має виражену гемостатичну та протизапальну дію і може бути використаний в якості активної діючої речовини при створенні лікарських засобів аналогічного призначення, виконаних у різних лікарських формах. Комплекс полісахаридів, одержаний за заявленим способом, практично нетоксичний, не має ульцерогенної дії, не викликає алергічні реакції та інші прояви негативної побічної дії. Заявлений спосіб є економічним, передбачає використання екологічно безпечних реактивів, може бути здійснений в умовах стандартного хімікофармацевтичного виробництва зі стандартним обладнанням. Заявлений спосіб передбачає використання листя акації білої у період листопаду, тобто найдешевшої, широко розповсюдженої вітчизняної сировини, не наносячи тим самим шкоди рослинним ресурсам.