Спосіб визначення стійкості картоплі до збудника раку synchytrium endobioticum (sснilb.) perc шляхом індукованої преципітації

Корисна модель відноситься до галузі сільського господарства, зокрема до захисту рослин від негативної дії шкідливих організмів та хвороб. В сільському господарстві відомий метод інфрачервоної мікроскопії для діагностики ушкодження і стійкості зернових до шкідників [1]. В картоплярстві відомі польові та лабораторні способи визначення стійкості сортів та гібридів картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb) Perс. Польовий спосіб визначення ракостійкості картоплі, заснований на безпосередньому зараженні зразків картоплі зимовими зооспорангіями збудника раку у природних польових умовах [2]. Лабораторний спосіб включає в себе зараження паростків картоплі літніми зооспорангіями зі свіжих ракових наростів (прототип) [3]. Також відомий біохімічний спосіб визначення ракостійкості картоплі, заснований на зараженні листків картоплі білковим екстрактом зі свіжих ракових наростів картоплі [4]. Спосіб, що вирішується у найближчому аналозі, полягає в тому, що він включає в себе зараження зразків картоплі зооспорами від свіжих наростів в лабораторних умовах при температурі 11-13ºС. та їх аналіз під бінокулярної лупи та визначення ступеню стійкості. Згадані способи та спосіб-найближчий аналог мають такі недоліки: 1. Вони є трудомісткими. 2. Їх використання пов'язане з затратою часу, який займає цілий вегетаційний період розвитку рослин картоплі та патогену. В основу корисної моделі поставлено завдання розробити спосіб визначення стійкості картоплі до збудника раку шляхом визначення ступеню екстинкції спектроскопії. Поставлене завдання досягається тим, що у запропонованому способі шляхом виділення білків з паростків різних за стійкістю до раку зразків картоплі з наступним аналізом здатності утворювати комплекси рослина-хазяїнпатоген в присутності поліетиленгликолю визначають ступінь екстинкції білкових комплексів паростків сортів та гібридів картоплі при зараженні хворобою спектрофотометричним методом і таким чином вдається визначити ступінь стійкості до хвороби. 1. Для зараження використовується 2г інфекційного матеріалу проти 10г при найближчому аналозі. 2. Запропонований спосіб дозволяє визначити ступінь стійкості за значно коротший термін часу - за 1 годину (при найближчому аналозі - протягом 21 доби). 3. Суттєвою відмінністю нового способу є те, що спектроскопією вдається точніше визначити ступінь стійкості картоплі, ніж іншими способами, особливо способом-найближчим аналогом. Приклади здійснення способів Приклад 1. (найближчий аналог) Зразки бульб сортів та гібридів картоплі, коли паростки досягають 1-2мм, заражають літніми зооспорангіями зі свіжих ракових наростів протягом 24 годин при 11-13ºС. Для цього на верхівку бульби картоплі навколо паросткової частини приліплюють паперове кільце за допомогою суміші парафіну та вазеліну (1:1). В кільце наливають дистильовану воду, кладуть шматочки свіжого ракового наросту. Зразки залишають у клімокамері з підвищеною вологістю і температурі 11-13ºС. Час експозиції 24 години. Інфекцію з паперовими кільцями знімають з бульб і залишають зразки картоплі при температурі 17-18ºС протягом 20 діб, після чого відзначають реакцію паростків картоплі на зараження патогеном. Для цього їх аналізують під бінокулярною лупою і визначають ступінь ураження: 1 - некротизована тканина паростка, одиничні соруси; 2 - розсіяні соруси (якщо більше 5), щільні соруси без деформації паростка; 3 - щільні соруси з деформацією паростка, раковий наріст. В аналізованих таким чином зразках картоплі (6шт.) (Таблиця 1, додаток 1) ступінь ураження паростків картоплі збудником раку склала: 1-3 зразків; 2-0 зразків; 3-3 зразків картоплі. Приклад 2 З паростків різних сортів картоплі а також з ракових наростів виділяють білковий екстракт таким чином: 2г наростів подрібнюють і розтирають з 2мл 5М боратним буфером (рН 8,4), . Гомогенат віджимали крізь капронову сітку і центрифугували 10 хвилин при 12000об/хв. При цьому білки виділяються в супернатанті, а залишки випадають в осад. Супернатант 7мл очищують через колонку з сефадексом G-25, врівноважену буфером, який вміщував той же боратний буфер (рН 8,4). Після початку виходу білка відбирають 2-3мл і зберігають в холодильнику при 4-6ºС. Для визначення ступеню індукованої преципітації при утворенні комплексів рослина-хазяїн-патоген долають рівну кількість (1мл) білкового екстракту з рослин картоплі + екстракт з ракового наросту + 4% розчин поліетиленгликолю і при температурі 18ºС протягом 1 години визначають утворення комплексів. На спектрофотометрі "Ломо-26" при довжини хвилі 450нм визначають величину пропускання світла Р (в %) за формулою: Р=Ро-Рк (Рпег-Рбуф.) де Р - підсумковий результат проби в відсотках пропускання світла, або одиниця оптичної щільності, Ро - відсоток пропускання світла дослідного зразка, Рк - контрольної, Рпег - 40 поліетиленгликолю та величину екстинкції: Е=-lgP. Концентрацію комплексів (в г/л) визначають за формулою Е=кС, де Е - величина екстинкції, к - коефіїтдент пропускання світла, С - концентрація комплексу білка рослинахазяїн-паразит. Математичну обробку даних проводили по Доспехову Б.А. [5] Результати досліджень представлені у таблиці 1 (Додаток 1). За результатами аналізу здатності утворення комплексів зразків картоплі величина екстинкції у сприйнятливих сортів картоплі Поліська рожева, Вале, Гібрид П 95 145-5 коливається в межах 1,4-1,8; у стійких сортів картоплі Божедар, Водограй, Подолянка находиться в межах 0,4-0,8 (Таблиця 1, додаток 1, фігура 1, перелік фігур креслення, додаток 2). На фігурі 1 зображено концентрація комплексів рослина-хазяїн-патоген сприйнятливого до раку сорту картоплі Поліська рожева (1,6), сприйнятливого до раку сорту картоплі Вале (1,4), сприйнятливого до раку гібриду картоплі П 85 145-5 (1,8) та концентрацію комплексів рослина хазяїн-патоген стійкого до раку сорту картоплі Подолянка (0,6), стійкого до раку сорту картоплі Водограй (0,8)та стійкого до раку сорту картоплі Божедар (0,4). Концентрація даних комплексів знаходиться в прямій залежності з ступенем стійкості даних сортів картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb/) Perc. Таким чином шляхом визначення концентрації білкових комплексів контрастних за стійкістю до раку сортів картоплі з збудником раку вдається визначити їх ступінь стійкості до патогену. Процес визначення ступеню здатності утворення комплекса а також стійкості 6 зразків картоплі до збудника раку на спектрофотометрі склав 1 годину , а способом зараження зооспорами від свіжих ракових наростів (прототипом) - 21 добу. Запропонований спосіб визначення стійкості картоплі до раку підтверджує експериментальна перевірка, яка здійснювалась при ураженні збудником раку картоплі сортів та гібридів, отриманих з Поліської дослідної станції та Інституту картоплярства УААН. Літературні джерела 1. Вилкова Н.А., Шапиро И.Д., Борщева Т.А. Использование инфракрасной микроскопии для диагностики повреждения и устойчивости зерновок к клопам. В сб. Методы исследований патологических изменений растений. - М.: Колос, 1976. - С.216-219. 2. Салтыкова Л.П., Тарасова В.П. Ме тодические указания по испытанию картофеля на ракоустойчивость. - Л., 1982. - 51с. 3. Салтыкова Л.П., Яковлева В.И. Лабораторная диагностика ракоустойчивости картофеля методом заражения ростков от свежих раковых наростов: Методические указания. - М., 1979. - 8с. 4. Яковлева Н.Н., Кадырматов И.Н. Способ определения ракоустойчивости картофеля: Авторское свидетельство №380264 от 15.05.1973г., бюллетень №21. 5. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. - М.: Колос, 1973. - 336с. Таблиця 1 Ступінь стійкості селекційного матеріалу картоплі до збудника раку, визначений різними способами (2006р.) № п/п 1 1. 2. 3. 4. 5. 6. Сорти, гібриди картоплі 2 Поліська рожева Вале П85 145-5 Подолянка Водограй Боже дар Ступінь стійкості Прямим способом Способом індукованої зараження (прототип) преципітації, в %(М±m) 3 5 3 1,6±0,73 3 1,4±0,56 3 1,8±0,56 1 0,6±0,77 1 0,8±0,54 1 0,4±0,77 На фігурі 1 зображено величини концентрації комплексів рослина-хазяїн-патоген поліетиленгликолю: 1 - концентрація комплексу сприйнятливого до раку сорту картоплі Поліська рожева 2 - концентрація комплексу сприйнятливого до раку сорту картоплі Вале 3 - концентрація комплексу сприйнятливого до раку гібриду П 85 145-5 4 - концентрація комплексу стійкого до раку сорту картоплі Подолянка 5 - концентрація комплексу стійкого до раку сорту картоплі Водограй 6 - концентрація комплексу стійкого до раку сорту картоплі Божедар в присутності