Спосіб виділення та очищення тромбіну

Спосіб виділення та очищення тромбіну з активованого концентрату протромбінового комплексу, який включає використання методу афінної хроматографії на макропористому кремнеземному носії, який відрізняється тим, що для підвищення ступеня очищення препарату, е фективності способу, а також для покращення аналітичних характеристик кінцевого продукту як ліганд використовують тріазиновий барвник Активний яскравоголубий К. (19) (21) u200700211 (22) 09.01.2007 (24) 25.06.2007 (46) 25.06.2007, Бюл. № 9, 2007 р. (72) Магеровський Юрій Васильович, Брагінець Олена Григорівна, Шурко Наталія Олегівна, Даниш Ольга Йосифівна, Вороняк Мирослав Іванович, Вус Марія Миронівна, Орлова Любов Володимирівна, Даниш Тарас Васильович (73) ІНСТИТУТ ПАТОЛОГІЇ КРОВІ ТА ТРАНСФУЗІЙНОЇ МЕДИЦИНИ АМН УКРАЇНИ, Магеровський Юрій Васильович, Брагінець Олена Григорівна, Шурко Наталія Олегівна, Даниш Ольга Йосифівна, 3 24182 протромбіну в тромбін проводять з використанням тромбопластин-кальцієвої суміші. Афінну хроматографію тромбіну проводять на колонці з n-Сl-бензилхлорид-силохромом, врівноважену 0,05М тріс-НСІ-буфером, рН 8,0. Після пропускання екстракту тромбіну колонку послідовно промивають вихідним буфером, 25 %-ним розчином пропанолу-2, 0,25М розчином e-АКК і десорбують тромбін 25%-ним розчином пропанолу-2 з 1М NaCI в 0,05 М тріс-НСІ-буфері, рН 8,0. Недоліками даного способу є наступні: 1. Для досягнення високої очистки тромбіну необхідна рехроматографія одержаного елюату. 2. Двоетапність афінної хроматографії зменшує кінцевий вихід продукту внаслідок втрат на кожному з етапів. Задачею даної корисної моделі є підвищення ступеню очищення тромбіну, збільшення його кінцевого виходу, спрощення технології внаслідок одностадійності хроматографічного процесу. Поставлена задача досягається запропонованим способом одержання тромбіну, яка включає пропускання активованого тромбопластинкальцієвою сумішшю концентрату тромбіну через колонку з силохромом-Активним яскраво-голубим К, десорбцію баластних біліків 25 %-ним розчином пропанолу-2, 0,25М розчином e-АКК та елюцію тромбіну 25%-ним розчином пропанолу-2 в присутності 1 М розчину натрію хлориду, діаліз одержаного розчину та ліофілізацію. Відмінність запропонованого способу полягає у застосуванні в якості ліганда для афінної хроматографії тромбіну на кремнеземній матриці тріазинового барвника - Активного яскраво-голубого К (C.I. 61211). Застосування нового хроматографічного носія дозволяє підвищити ступінь очищення тромбіну на 33% (близько 2000 од. NIH/мг білка), спростити технологію одержання препарату за рахунок одностадійності хроматографічного процесу, зменшити тривалість процедури, збільшити кінцевий вихід препарату на 40%. Пропонований хроматографічний сорбент має суттєво ви щу сорбційну ємність по відношенню до тромбіну у порівнянні з найближчим аналогом (ємність по тромбіну 10500од-NIH/г сорбенту проти 2000од. од.МН/г сорбенту - найближчого аналога). В представлених прикладах кількість білка наведена в мг, активність тромбіну виражена в міжнародних одиницях NIH (National Institute of Health) по часу утворення фібринового згустка в стандартизованих умовах з використанням розчину фібриногену. Активність тромбіну визначали по часу зсідання 1мл 0,1%-ного розчину фібриногену в 0,15М NaCI з 0,01М тріс-НСІ буфером, рН 7,3, при додаванні 0,01-0,05мл розчину тромбіну при температурі 37°С. Калібрувальну криву будували аналогічно, використовуючи в якості стандарту тромбін 4 ВРХ фірми "Calbiochem" (США), а також 1-й Міжнародний стандарт тромбіну (код 70/157) [8]. Приклад 1. 2кг фракції ІІ+ІІІ за Коном суспендували протягом 1,5-2 год в 8л розчину такого складу: 0,02М тріс-НСІ-буфер, рН 8,0, 0,15М NaCI, 0,02М тринатрій-цитрат і 5%-ний ПЕГ-115. В присутності ПЕГ-115 осаджуються ліпопротеїни, фібриноген і денатуровані білки, від яких позбавлялись центрифугуванням протягом 30хв при 2500g. До одержаного супернатанту додавали 1/10 об'єму охолодженого до +4°С 1М розчину хлориду барію. Перемішували протягом 1 год., центрифугували 20 хв. при 2000 g. Надосадкову рідину заморожували при -30°С і використовували в подальшому для виділення плазміногену і імуноглобуліну G. Осад промивали 2л дистильованої води, повторно центрифугували при аналогічних умовах, суспендували в 500мл дистильованої води, по краплях додавали 75мл 3,3 М забуференого до рН 8,0 розчину сульфату амонію. Нерозчинний матеріал видаляли центрифугуванням при 4000-5000g протягом 25хв, а надосадкову рідину (приблизно 600-700мл) діалізували протягом 10-15 год проти 8л 0,15М розчину NaCl. За цей час розчин 0,15М NaCI змінювали двічі. Одержаний концентрат факторів протромбінового комплексу використовували для подальшої очистки з метою одержання препарату тромбіну. Для активації протромбіну в тромбін 10г ліофільно висушеного тромбопластину гомогенізували з 100мл 0,2 5М розчину хлориду кальцію в 0,2М тріс-НСІ-буфері, рН 7,4 і до одного об'єму гомогенату додавали 7 об'ємів віддіалізованого протромбінового комплексу. Суміш інкубували протягом 60-120хв при температурі 37°С, доки активність тромбіну не ви ходила на плато (приблизно 7001000 од. NIH/мл розчину). Через кожні 10хв відбирали проби для визначення згортуючої активності тромбіну. Одержаний екстракт тромбіну центрифугували 30хв при 4000g при + 4°С і супернатант пропускали через колонку з сорбентом активним-яскравоголубим К розміром 2,5х32см, врівноважену 0,05М тріс-НСІ-буфером, рН 8,0. Далі колонку із зв'язаним на сорбенті тромбіном послідовно промивали вихідним буфером, 25%-ним розчином пропанолу2, 0,25М розчином e-АКК і десорбували тромбін 25%-ним розчином пропанолу-2 з 1M NaCI в 0,05M тріс-НСІ-буфері, рН 8,0. Швидкість елюції становила 0,2-0,4мл/(хв х см 2). Тромбінвмісні фракції об'єднували, діалізували проти 0,15MNaCl при +4°С протягом ночі і після заморозки при - 25°С ліофільне висушували. Вихід тромбіну з 2 кг фракції ІІ+ІII за Коном 1000000-1500000 од. NIH, питома активність - 2000 од. NIH/мг білка. В таблиці представлені характеристики препарату тромбіну, одержаного пропонованим способом і способом-найближчим аналогом. 5 24182 6 Таблиця властивості Сорбційна властивість Питома активність Активність тромбіну тромбіну, од. NIH/мг сорбенту, од. NIH/г в елюаті, од.NIH/мл сорбенту білка Вихід тромбіну (по активності), % спосіб приклад 1 найближчий аналог 10500 1200±200 2000 90±5 2000 800±100 1500 79±5 З наведених даних видно, що ступінь очищення тромбіну, який характеризується підвищенням його питомої фібриноутворюючої здатності, вищий в 1,3 рази в пропонованому способі. Вихід сумарної згортуючої активності (ефективність способу) у порівнянні з аналогічним показником для найближчого аналога для пропонованого способу у 1,14 рази вищий. Питома ємність пропонованого сорбенту в 5,25 рази вища у порівнянні з найближчим аналогом, що дозволяє за один технологічний цикл використати значно більшу кількість вихідної сировини для одержання препарату тромбіну. Скорочення часу виділення тромбіну за рахунок одностадійного хроматографічного процесу здешевлюють пропонований спосіб, елюція тромбіну більш концентрованим піком спрощує наступні роботи технологічного процесу (діаліз, ліофілізацію), внаслідок чого покращуються аналітичні показники кінцевого продукту - діагностичного чи лікувального препарату. Джерела інформації: 1. Грачева Н.А., Ужинова Л.Д., Курд А.Л. и др./УБиоорган. химия.-1981.- Т. 7.- № 10.- С. 15601565. 2. Schmer G. The prufication of bovine thrombin by affinity chromatography on benzamidine Комп’ютерна в ерстка Д. Шев ерун agarose.//Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem.-1972.V.353.-P. 810-814. 3. Hatton M.W., Regoeczi E. The affinity of human, rabbit and bovine thrombins for sepharoselysine and other conjugates //Biochem. Biophys. Acta.-1976.-V.427.-P. 575-585. 4. Affinity chromatography of human thrombin on modified silica /Gaida A.V., Monastyrskii V.A., Magerovskii Yu.V. et al. //J. Chromatogr. - 1987. - V. 424, No. 2.-P. 385-391. 5. Хроматография тромбина на модифицированных кремнеземах: роль матрицы, спейсера и величины рН./ Гайда А.В., Монастырский В.А., Магеровский Ю.В. и др.//Биотехнология.- 1989.- Т. 5.- № 4.- С. 449-454. 6. Магеровский Ю. В. Очистка тромбина и тромбопластина методом аффинной и гельпроникающей хроматографии на модифицированных кремнеземных сорбентах: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Львов, 1989. -21с. 7. 65. Монастырский В.А., Магеровский Ю.В., Гайда А.В. Применение полиэтиленгликоля для выделения протромбинового комплекса // Гематол. и трансфузиол.-1986.- №2.-С.51-53. 8. Human Blood Coagulation, Haemostasis and Thrombosis./Ed. by R. Biggs//Blackwell Scientific Publications, Philadelphia.-1976.- 722 P. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601