Спосіб виділення високоочищеного стандарту тромбіну людини

Спосіб виділення високоочищеного стандарту тромбіну людини, який включає екстракцію концентрату фактора IX, діаліз, активацію про тромбінового комплексу, хроматографічне розділення, який відрізняється тим, що активацію протромбінового комплексу проводять в змінених умовах - співвідношення протромбін тромбопластин становить 6 1, без додаткового внесення фактора V, використовують тромбопластин вітчизняного виробництва, хроматографію здійснюють одноетапно на сорбенті гепарин - агароза, елюючи тромбін способом ступеневої, а не градієнтної елюції,, у 0,45-0,5М хлориду натрію, концентруючи препарат на мембранах "Spectra/Por" фірми "Amicon" Винахід стосується біотехнологм і є способом виділення стандарту тромбіну людини Одержаний фермент може бути використаний в медицині, експериментальних дослідженнях та КЛІНІЧНІЙ практиці Зокрема, стандарт тромбіну необхідний, поперше, для систематизованої характеристики цього ферменту, виділеного вченими багатьох груп причому різноманітними методами, з різноманітної сировини, по-друге, для ретельної перевірки терапевтичних препаратів, що містять протромбін, тому що навіть незначна лабільність препаратів визначається в одиницях тромбіну, по-третє, стандарт тромбіну необхідний для визначення одиниць активності природних інгібіторів ферменту, таких як антитромбін III і його кофактор гепарин крові і стінками судин, він бере участь у регуляції протилежно спрямованих процесів, пов'язаних як із згортанням крові, так і зберіганням и рідкого стану у кровоносному руслі [ 4 - 7 ] У плазмі тромбін активує і шактивує фактори V, VIII, XIII та білок С На клітинному рівні тромбін функціонує не тільки як селективний протеолітичний фермент, але також як гормон, дію якого опосередковано через специфічні рецептори Він Є потужним клітинним стимулятором індукції і секреції тромбоцитів, метаболізму арахідонової кислоти і митогенезу [2, 7, 8, 11, 12] Нині вважається, що всі типи клітин ссавців (за винятком еритроцитів) чутливі до тромбіну Це зокрема доведено на епітеліальних та нервових клітинах, різноманітних типів лейкоцитах, клітинах гладенької мускулатури і культивованих фібробластах [1 - 3, 11] Відомий спосіб виділення тромбіну людини з фракції III за Коном плазми крові людини, описано у статті (Fenton J W , Fasco M J , Stackrow А В et al "Human thrombins Production, evaluation and properties of a-thrombin" // J Biol Chem 1977 252, № 11 P 3587 - 3598), що включає екстракцію тромбіну й інших залежних від вітаміну К білкових факторів зсідання крові із плазми Екстракцію проводять буфером, що містить 0.02М трис, 0.02М хлорида натрію, 4% політиленгліколю (ПЕГ-6000, рН 8,0), адсорбцію факторів протромбінового комплексу проводять на охолодженому 1М ВаСЬ, елюцію протромбінового комплексу проводять Тромбін - ключовий фермент системи гемостазу Порушення регуляторної функції тромбіну відіграють важливу роль у розвитку хвороб серцево-судинної системи Закупорення просвіту кровоносних судин тромбами, емболії і гемофільні розлади нерідко призводять до летального кінця За патолопй такого типу використовують агенти, що стимулюють або пригнічують процес згортання крові, або спричинюють лізис тромбу Протеоліз фібриногену тромбіном, що призводить до утворення фібринового згустку - найбільше досліджена біологічна функція тромбіну Проте, на сьогодні відомо, що тромбін є ферментом, який здійснює багато функцій [1 -10] Взаємодіючи з усіма ланками гемостазу - білками, клітинами ю о о ю ю 55005 сірчанокислим амонієм при рН 8,0, додаючи його краплями, осад BaSO4, що утворився при цьому видаляють центрифугуванням при 3000об/хв В надосадовій рідині рН доводять до 6,0 - 6,2, після чого діалізують її проти 0,15М NaCI при 4°С Очищення протромбіну здійснюють за допомогою іонообмінної хроматографії на амберліті CG50 Для видалення супутніх білків фракцію протромбіну, одержаного після діалізу, пропускають через колонку з амберлітом CG-50, урівноважену 0.05М трис-НСІ-буфером (рН 8,0) з 0.15М NaCI Активацію протромбіну на тромбін проводять розчином тромбопластину з додатковим внесенням джерела фактора V при 25 - 37°С протягом 1 Згод (об'ємне співвідношення протромбіну^ром бо пласти ну - 3 1 Тромбін виділяють сорбцією на другій колонці амберліту CG-50, урівноваженої 0.05М трис-НСІ-буфером (рН 8,0), що містить 0.15М NaCI з наступною елюцією 0.75М NaCI при 4°С Проби зберігають замороженими при 50 - 70°С Недоліками цього способу є многостадійність і тривалість виділення тромбіну, а саме екстракція протромбіну з плазми крові людини, адсорбція ферменту хлористим барієм, повторне осадження білка сірчанокислим амонієм, двоетапна хроматографія препарату на юнообміннику на амберліті CG-50, — що обумовлює втрату ферменту і знижує його вихід та якість препарату Проте виділений тромбін є забрудненим, тому що дуже нестійкий під час збереження і швидко автолізується (при 50 - 70°С він стійкий тільки впродовж двох МІСЯЦІВ) Препарат негомогенний за електрофорезного дослідження в ПААГ, титр активного центру тромбіна становить лише 86 - 88% Слід також зазначити, що у ВИХІДНІЙ сировині у разі використання цього способу виділення, повинно міститись дуже значна КІЛЬКІСТЬ тромбіну, інакше фермент не можливо буде виділити 1кг пасти III за Коном, виділеної із плазми крові людини, повинен містити 0,8 - 1,0*106 NIH, що буває дуже рідко Крім того, режим регенерації амберліту CG-50 досить складний Регенерувати його в колонці або на воронці Бюхнера важко через малі розміри часток, внаслідок чого він забиває пори фільтрів будь-яких розмірів і швидко ущільнюється на колонці До того ж використані при виділенні тромбіну імпортні препарати тромбопластину, фактор V, амберліт CG50 є дефіцитними Як прототип обрано спосіб виділення тромбіну з найбільш близького за джерелом сировини, тобто концентрату фактора IX (Miller-Andersson M , Gaffney Р J , Seghatchian M J "Preparation and stability of a highly purified human thrombm standard" //Thromb Res 1981 20, №1 P 109 - 122), одержаного хроматографією на амберліті CG-50 і SP сефадексі та аффінною хроматографією на гепарин-сефарозі, елюючи фермент ЛІНІЙНИМ градієнтом розчину хлориду натрію (0,1 - 1,0М) в 0.05М трис-буфері (рН 7,0) Проте відомий спосіб має такі недоліки багатостадійність виділення тромбіну і тривалість очищення цільового продукту, внаслідок чого втрачається КІЛЬКІСТЬ ферменту і погіршується його якісний склад, що викликає значну лабільність препарату тромбін стійкий тільки протягом 10 тижнів, причому за наявності в реактивному середовищі 1% сироваткового альбуміну Слід зазначити, що амберліт CG-50, SP-Sephadex, IMIдазол, сироватковий альбумін є дефіцитними Крім того використано складний етап активації з використанням додатково фактора V та імпортного тромбопластину Проведено повторний діализ після очищення тромбіну на амберліті CG-50, з метою звільнення від ІОНІВ кальцію, що зумовлює лабільність препарату Задачею, що покладена в основу цього винаходу є розробка простого і доступного способу виділення тромбіну людини, спрощення технології , максимальне скорочення тривалості очищення і запобігання втрати і ферментативної активності, а також ефективне підвищення якості препарату, підвищення його стабільності при збереженні у водно-сольових розчинах (-20°С) без використання дорогих імпортних стабілізаторів Виходячи із ступеня чистоти та СТІЙКОСТІ виділеного препарату, фермент можна рекомендувати як робочий стандарт тромбіну, який необхідний для вирішення багатьох питань експериментальних досліджень і клінічної практики Для вирішення поставленої задачі концентрат фактору IX екстрагують (0.05М трис-НСІ буфер рН 7,4), діалізують та активують протромбіновий комплекс Зміна умов активації надало можливість використати ВІТЧИЗНЯНІ препарати тромбопластину без додаткового внесення джерела фактора V Активований протромбін розділяють одноетапно на аффшному сорбенті гепарин - агароза, при цьому домішки білків, різноманітні забруднення проходять через колонку при пропусканні 0.05М трис-НСІ буфер з рН 7,4 Після ЦЬОГО тромбін елюють ступеневим (а не градієнтним) способом за допомогою хлорид натрію і виділяють його за 0,45 - 0,5М хлорида натрію - хлорида натрію - і потім концентрують застосовуючи мембрани "Spectra/Рог" фірми "Amicon" Завдяки сукупності наведених вище умов, які розроблено, спосіб містить оптимальні умови для стабілізації тромбіну, який забезпечує виділення високоочищеного і стабільного препарату Фермент гомогенний в ПААГ і має молекулярну масу ЗбкДа Виділений тромбін містить 97% активних центрів, якщо для аналізу використовують синтетичний субстрат N-ФНГБ (п-нітрофентовий ефір-пгуанідинбензойної кислоти) Тромбін зберігає стабільність не менше року у разі збереження його у водно-сольових розчинах (-20°С) без використання різноманітних добавок Ефективне підвищення якості препарату дозволяє рекомендувати його як робочий стандарт, необхідний для експериментальних досліджень і клінічної практики Можливість здійснення способу підтверджена прикладами Приклад 1 100 мг концентрату фактора IX суспендують протягом ЗОхв при перемішуванні в 12мл 0.05М трис-НСІ буфері (рН 7,4) розчину, що екстрагує фермент, і ставлять на діаліз при температурі 4°С проти 0.05М трис-НСІ - буфера (рН 7,4), розведеного ВДВІЧІ охолодженою дистильованою водою, змінюючи ДВІЧІ розчин через кожні три години, і лишають діаліз на ніч Активацію комплексу перетворення протромбіну на тромбін прово 55005 дять тромбопластином Для цього 150мг тромбопластину з кадаверного мозку людини (препарат Львівського НДІ гематологи і переливання крові) гомогенізують в 1,5мл 0,2М трис-НСІ-буфері (рН 7,4), що містить 0.25М СаСЬ Потім до одного об'єму отриманого гомогенату додають шість об'ємів розчину протромбіну Суміш шкубують при температурі 37°С протягом двох годин і центрифугують 20хв зі швидкістю 6 тис об/хв, при температурі +2°С Ступінь активації тестують за активністю, згортання фібриногену використавши 0,1% розчин Хроматографію надосадової рідини проводять на аффшному сорбенті гепарин - агарозі Спочатку колонку (1,5 х 5см) зрівноважують 0.05М трис-НСІбуфером (рН 7,4) Після нанесення зразка на колонку її промивають вихідним буфером, а потім проводять елюцію ступеневим способом, використовуючи розчини хлориду натрію в концентраціях 0,5М и 1,0М у вихідному буфері (рН 7,4) Швидкість елюції розчину становить 50мл/год Відбирають окремі фракції по 2 і 5мл У кожній з одержаних фракцій визначали згортальну активність, ідентифікуючи наявність у нихтромбіну Активність тромбіну визначали за часом згортання 0,5мл 0,1%-го розчину фібриногену в 0.04М трис-НСІ-буфері (рН 7,36) з 0,1 М NaCI і 0,66% ПЕГ при температурі 29°С при додаванні в реакційну суміш 0,01 - 0,02мл розчину тромбіну Як стандарт для побудови калібрувальної кривої використовують тромбін людини фірми "Sigma" (США), активність якого було раніше відкалібровано при використанні Міжнародного стандарту тромбіну (код РД Фракції, що викликають згортання фібриногену не більше 15с, в заданих умовах експерименту об'єднують і тестують електрофоретично в ПААГ з 0,1% Ds-Na Проби зберігають у водно-сольових розчинах (-20°С) Згідно З даними титрування ферменту пнітрофеніловим ефіром n-гуанидинбензойноі кислоти (N-ФНГБ) вміст активних центрів у препараті становить 97% За допомогою методу електрофорезу в ПААГ за присутності Ds-Na виявлено функціональну гомогенність препарату з молекулярною масою ЗбкДа Виділений фермент виявився стабільним впродовж одного року при збереженні в водно-сольових розчинах без використання різноманітних дорогих добавок (білків, пептидів та ш ) Приклад 2 ЮОмг концентрату фактора IX суспендують і розділяють як показано в прикладі 1, використовуючи при цьому для екстракції буфер 0.05М трис-НСІ (рН 7,35), проводячи активацію комплексу протромбіну в такий спосіб до одного об'єму одержаного гомогенату додають п'ять об'ємів розчину тромбіну Хроматографію матеріалу проводять як у прикладі 1 Якість виділеного тромбіну подібна до такої у прикладі 1 Приклад 3 ЮОмг концентрату фактора IX суспендують як показано в прикладі 1 Подібним способом активують протромбіновий комплекс, а під час хроматографії на аффшному сорбенті використовують розчин, який одержано за елюції 0.04М трис-НСІ (рН 7,3), що містить 0.45М NaCI Швидкість елюції розчину становить 35мл/год Якість виділеного тромбіну є такою як і за ана лізу в прикладі 1 Таким чином, перевагами запропонованого способу є спрощення, доступність виділення високоочищеного тромбіну із плазми крові людини Запропоновано одноетапне хроматографічне очищення тромбіну Повний цикл регенерації сорбенту і зрівноважування колонки відбувається впродовж 2,5 - Згод порівняно з 8 - Югод, необхідними для хроматографии тромбіну на амберліті CG-50 Ступінь очищення одержаних препаратів і їхня якість значно вищі, що доведено електрофорезом в ПААГ, титруванням активного центру ферменту, його стабільністю під час зберігання Запропонований спосіб виділення тромбіну містить оптимальні умови для стабілізації Препарат зберігається у водно-сольовому розчині (-20°С) більше року без використання будь-яких домішок Титр активного центру тромбіна становить 97% Висока функціональна гомогенність виділеного тромбіну, його стабільність дозволяють запропонувати цей засіб як робочий стандарт, що необхідно для експериментальних досліджень, клінічної практики А також по-перше, для систематизованої характеристики цього ферменту, виділеного вченими багатьох груп , різноманітними методами, по-друге, для ретельної перевірки терапевтичних препаратів, що містять протромбін, активність яких завжди виражають в одиницях тромбіну, по-третє, для виміру одиниць активності ряду природних інгібіторів ферменту, таких як антитромбін III і його кофактор гепарин Список посилань 1 Fenton J W , Ofosu F A , Moon D G , MaraganoreJ M //Blood Coagulat Fibnnol 1991 2 P 69 -75 2 Fenton J W // In Serme Proteases and their Serpme Inhibitors in Nervous System (Festoft, В W ed ) Plenum Press, New-York 1990 P 3 - 7 3 Fenton J W Thrombm Specificity//Ann N-Y Acad Sci 1981 370 P 468-495 4 Кудряшов Б А , Струкова С М Значение молекулярных особенностей тромбина во взаимодействии с рецепторными структурами в организме//Усп совр биол 1984 97, вып 2 С 193-207 5 Серейская А А , Струкова С М / / ДАН СССР 1985 282, №2 С 481 -484 6 Кудряшов Б А Проблема возбуждения противосвертывающей системы в организме // Усп совр биол 1989, вып 1 С 55 - 68 7 Струкова С М,, Серейская А А , Осадчук Т В //Успехи соврем, биол 1989 107, вып 1 С 41 54 8 Максименко А В Тромбин Соотношение структура-функция в биохимических взаимодействиях//Биохимия 1993 58, вып 9 С 1373-1384 9 Гершкович А А Индуцирование лигандами конформационных изменений в тромбине как способ регуляции его активности // Биохимия 1996 61, вып 7 С 1139-1151 10 Кибирев В К, Гершкович А А Природные и синтетические ингибиторы тромбина // Укр биохим журн 1999 71, №1 С 3 - 26 11 Fenton J W , Bmg D M //Semm Thromb Hemost1986 5 P 3 - 2 7 12 Гершкович А А, Кибирев В К Хромогенные и флуорогенные пептидные субстраты проте 7 55005 олитических ферментов//Биоорг химия 1988 14, №11 С 1461-1487 13 Fenton J W Fasco М J , Stackrow А В et al Human thrombms Production, evaluation and properties of a-thrombm//J Biol Chem 1977 252, 8 №11 Р 3587-3598 14 Miller-Anderson M, Gaffney P J, Seghatchian М J Preparation and stability of a highly purified human thrombm standard // Thromb Res 1981 20, №1 P 109-122 Підписано до друку 03 04 2003 p Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24