Стабілізований розчин a-тромбіну

Стабілізований розчин α-тромбіну, який містить тромбін, стабілізатор та розчинник, який відрізняється тим, що він містить тромбін у концентрації 1·10-7М, як стабілізатор органічний лігандіонної природи - роселін, у концентрації 1,05-1,60·10-4М, при цьому рН розчину становить 7,2-7,4. (19) (21) 20040705505 (22) 08.07.2004 (24) 17.07.2006 (46) 17.07.2006, Бюл. №7, 2006р. (72) Колодзейська Марія В'ячеславівна, Макогоненко Євген Митрофанович, Волков Георгій Леонідович (73) ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ІМ.О.В.ПАЛЛАДІНА НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ 3 76270 4 тикою цього процесу, бо цю зону рН, як відомо, В наших дослідженнях використано роселін, можна вважати додатковим фактором стабілізації який діє на сольватну оболонку молекули тромбіну ферменту. Крім того, в експериментах використов досить низькій концентрації - 1,05•10-4 вували різноманітні препарати, зокрема комерцій1,6•10-4М. При цьому використано низькі розчини ні, які не є гомогенними та високоактивними (100ферменту (концентрація 1•10-7М). Крім того, дослі1000 NIH на 1мг білка). Пізніше було використано дження стабілізації тромбіну слід здійснювати в досить концентровані розчини тромбіну (300зоні рН 7,2-7,4, а не в зоні оптимуму рН (7,6-8,0), 500NIH в 1мл), що помітно погіршувало характещоб уникнути побічної інактивації препарату. ристику дійсної ефективності стабілізації тромбіну Зсідальну активність тромбіну визначали за запропонованою сумішшю реагентів, тому що в тромбіновим часом, тобто часом зсідання 0,5мл цих препаратах містяться досить небезпечні, так 0,1%-го розчину фібриногену під впливом 0,01мл звані "баластні" білки - фактор Ха, плазмін, плазмірозчину тромбіну при 29°С та рН 7,35, яку виражаноген, які спричиняють додаткову лабільність троли в одиницях NIH. мбіну під час обмеженого протеолізу ферменту. Для визначення впливу стабілізувального реаЗгідно з патентом, для дослідження стійкості фергенту змішували розведені розчини ферменту менту, крім цитратного, використано фосфатний (1•10-7М), одержані після кінцевого етапу очищенбуфер, що недоцільно, оскільки він призводить до ня, з роселіном до кінцевої концентрації 1,05•10-4 помутніння ферментних розчинів через присут1,60•10-4М. + ність в середовищі іонів Са , утворюючи помітний Переваги запропонованого способу: осад комплексних сполук, що неприпустимо у разі замість традиційних стабілізувальних домішок практичного використання препаратів. Досліджу(солей, поліолів, поліетиленгліколю) запропоновавані ферментні розчини мають рН 6,5-6,7. З огляду но новий стабілізатор для тромбіну - органічний на це, доцільно для визначення біологічної активліганд іонної природи; ності тромбіну підвищити концентрацію іонів водрозведені препарати тромбіну зберігаються за ню до оптимуму, що досягається використанням присутності цього реагенту при температурі +4°С 0,5 або 1,0М NaOH. Це досить кропітка і додаткова на термін від двох місяців до 1,2-1,4 року при темробота, яка значно збільшує тривалість експерипературі -20°С без змін біологічної активності, що менту. Крім того, умови дослідження стабілізації свідчить про стабільність тромбіну; ферменту також неоптимальні, досить м'які та копоказано, що у разі термоінактивації препарароткотривалі. ту (температура +37°С) зберігається 100% зсідаЗадачею цього винаходу є розроблення новольної активності протягом 178год (7-10 днів); го простого способу стабілізації тромбіну людини оптимальні концентрації стабілізувального -4 -4 під час довготривалого зберігання препарату у агенту становлять 1,05-10 -1,6-10 М, що є досить формі досить розведених розчинів при температунизькими в системі тромбін-ліганд; рах від -20 до +4°С, за термоактивації при темпеяк найкраще середовище для дослідження ратурі +37°С із використанням дешевіших реагенстабілізації тромбіну рекомендовано 0,05М тристів. Замість традиційних домішок (солей, поліолів, НСІ-буфер з рН 7,2-7,4. поліетиленгліколю, тощо) для стабілізації тромбіну Роселін стабілізує тромбін, зв'язуючись із реавикористано органічний ліганд іонної природи ктивним центром тромбіну. Це зв'язування відбуроселін. Слід зазначити, що низькомолекулярні вається з аніонною ділянкою  -домену активного азобензольні ліганди, в т. ч. і цей реагент, вперше центру тромбіну, в якому виявлено основні амінобуло синтезовано R. Е. Lovrien (США, Minnesota кислоти - аргінін та лізин. Аполярною зв'язувальUniversity) для розділення амінокислот, поліпептиною ділянкою активного центру тромбіну забезпедів і білків копреципітацією (матрикс копреципітації чується гідрофобна взаємодія. При цьому та кокристалізації - MCC) [7,8]. Концепція МСС органічний ліганд іонної природи впливає на конгрунтується на тому, що білки мають досить рухформацію молекули білка, перетворюючи її з конливу конформаційну структуру. В молекулах білків формаційно вільної (аморфної) на твердішу і у розчинах міститься до 50% води, яка зменшуючи спричиняючи дегідрування молекули білка, внамолекулярну взаємодію, впливає на процеси крисслідок чого утворюються компактні ефективні комталізації або преципітації. Органічні ліганди іонної плекси ліганд-ліганд. Роселін ефективно захищає природи виконують досить важливі функції при фермент від процесів денатурації таких, як протевиділенні білків, а саме: 1) змінюють конформацію оліз, зміна рН середовища, нагрівання тощо. макромолекул і замість рухливих форм білків обуМожливість здійснення способу стабілізації мовлюють появу компактніших структур; 2) обезтромбіну людини підтверджено прикладами. воджують молекули внаслідок витіснення води, Приклад 1. 200мг концентрату фактора IX сузв'язаної з білком, спричинюючи збільшення комспендують в 10мл 0,05М трис- НСІ-буфері (рН 7,4) пактності після зв'язування з білком і підвищуючи і ставлять на діаліз при температурі 4°С проти здатність до денатурації та стабілізацію проти 0,05М трис-НСІ- буфера (рН 7,4), розведеного протеолізу, зміни рН-середовища і нагрівання; 3) вдвічі охолодженою дистильованою водою, змівпливають на характер первинного зв'язування з нюючи декілька разів розчин через кожні три годивідповідною біомолекулою через наявність зарядів ни, після чого залишають на діаліз впродовж ночі. на лігандах катіонної або аніонної природи і присуАктивацію комплексу перетворення протромбіну тність у біомолекулі неполярних гідрофобних груп. на тромбін проводять тромбопластином. Для цьоВзаємодія між цими групами сприяє утворенню го 200мг активатора гомогенізують у 2мл 0,2М сітки ліганд-ліганд (матрикс), що є рушійною ситрис-НСІ-буфера (рН 7,4), що містить 0,25М СаСl2. лою МСС-реакції [9]. Потім до одного об'єму гомогенату додають шість 5 76270 6 об'ємів розчину протромбіну. Суміш інкубують при проб тромбіну, які зберігали протягом 60 днів у температурі 37°С протягом двох годин і центрифухолодильнику при температурі +4°С. Стабілізувагують 20хв зі швидкістю 6000об/хв при температурі льний агент роселін додавали до експеримента+2°С. льної системи: 0,20мл тромбіну + 0,02мл ліганду Хроматографію надосадової рідини здійснюорганічної природи. В дослідах використовували ють на іонообмінному сорбенті ДЕАЕ-сефадексі А0,05М трис-НСІ-буфер (рН 7,4). Кінцева концент50. Колонку (2х8см) врівноважують 0,05М трисрація роселіну була 1,37•10-4М. Концентрація троНСІ-буфером (рН 7,4). Після нанесення зразка на мбіну в зазначеній композиції становила в середколонку її промивають вихідним буфером, а потім ньому 1•10-7М. Для визначення зсідальної послідовно елююють білок з іонообмінника розчиактивності із суміші відбирали 0,01мл розчину. ном хлориду натрію в концентраціях 0,1М; 0,2М та Біологічну активність визначали одночасно для 0,7М у вихідному буфері (рН 7,4). Швидкість елюції всіх проб досліду, порівнюючи дію даних стабілізарозчину становить 60мл/год. Відбирають аліквоти торів між собою і з контрольним експериментом, в окремих фракцій (по 5мл). У кожній з одержаних якому не використовували реагенти. фракцій визначали зсідальну активність, ідентифіОдержані результати свідчать про стабілізукуючи наявність у них тромбіну. Детальну хараквальну дію роселіну на фермент, яка була макситеристику ферменту наведено у нашому патенмальною при температурі +4°С, що свідчить про ті [10]. додаткове доочищення тромбіну від деяких баласНайактивнішу фракцію тромбіну одержано пістних білків за інкубації такого типу. В контрольних ля елюції білка з колонки 0,1М розчином хлориду дослідах, проведених без внесення в середовище натрію. Об'єм її становить 55мл і містить 10400 цього реагенту, виявлено лише незначну зсідальNIH-активності. Питома активність тромбіну станону активність, що свідчить про денатурацію тромвить 2200-2400NIH од. на 1мг білка. Для визнабіну за таких умов. чення впливу органічних лігандів ми змішували Приклад 3. Досліджено термоінактивацію тророзведені ферментні розчини, одержані після хромбіну при температурі 37°С протягом 24, 48 та матографії на іонообміннику ДЕАЕ-Сефадекс А-50 78год (упродовж 7 днів). Стабілізувальний агент (рН 7,4), з роселіном (кінцева концентрація роселін додавали в розчин у такій кількості, щоб 1,4•10-4М). Ферментні розчини зберігаються при кінцева концентрація його становила 1,37•10-4М. температурі -20°С протягом 1,5 року без змін зсіБуло показано, що зсідальна активність ферменту дальної активності, що свідчить про стабільність практично не змінюється за цей період, в той час ферменту. як у контролі без наявності цього реагенту тромбін Приклад 2. Досліджено стійкість розведених інактивується на 98%. Комп’ютерна верстка М. Клюкін Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601