Спосіб очищення та виділення 2′-дезокси-2′,2′-дифторнуклеозидів

УКРАЇНА (19) UA (11)53614 (із) С 2 (51)7С07Н19/073, 19/06 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (54) СПОСІБ ОЧИЩЕННЯ ТА ВИДІЛЕННЯ г^ДЕЗОКСИ-г'^-ДИФТОРНУКЛЕОЗИДІВ (21)97052227 (22)01.11.1995 (24) 17.02.2003 (86) PCT/US95/14086, 01.11.1995 (31)08/340,972 (32)17.11.1994 (33) US (46) 17.02.2003, Бюл. № 2, 2003 р. (72) Чу Та-Сен , US, Поутіт Лаура Мішель, US, К*єлл Дуглас Петтон, US (73) Елі ЛІЛЛІ енд Компані, US (56) Патент 5223608 US, C07H1/00, Заявл. 12.07 90; Опубл. 29 06 93 Патент 4965374 US, C07D307/32; Заявл. 04.12.89; Опубл. 23.10.90. Патент 0577303 ЕР, С07Н19/04, Заявл. 21.06.93; Опубл. 15.01.94. Патент 4526988 US, C07D307/32; Заявл. 10 03.83; Опубл. 02 07.85. (57) 1. Способ очистки и выделения нуклеозида, обогащенного бета-аномером, включающий: а) получение смеси, содержащей R" и обогащенный бета-аномером нуклеозид формулы (IB): ХО ОХ (IB) где каждый X независимо выбирают из групп защиты гидроксила, и R' представляет нуклеиновое основание формулы NHW О N где W представляет группу защиты амина, и R" представляет нуклеиновое основание формулы: NHW' NH где W представляет группу защиты амина или водород, в высококипящем растворителе, b) разбавление смеси органическим растворителем, выбранным из группы, состоящей из простых эфиров, сложных эфиров и нитрилов, c) добавление разбавленной реакционной смеси в водную кислоту, и d} выдерживание полученной кислой смеси при температуре от 70 °С до 100 °С до тех пор, пока не осадится продукт формулы (IB), где W представляет собой теперь W 2. Способ по п. 1, где реакционную смесь разбавляют ацетонитрилом, этилацетатом и тетрагидрофураном 3. Способ по п 2, где реакционную смесь разбавляют ацетонитрилом. 4. Способ по п. 1, где водная кислота представляет собой 1-6 н соляную кислоту. 5. Способ по п 1, где кислую смесь перемешивают во время осаждения продукта. 6. Способ по п. 1, дополнительно включающий отщепление защитных групп очищенного продукта формулы (IB) для образования нуклеозида, который представляет собой 1-(2'-дезокси-2',2'дифтор-0-рибофуранозил)-4-аминопиримидин-2он. СМ О со со ю 53614 Изобретение относится к фармацевтической химии и представляет собой способ очистки и выделения 2'-дезокси-2',2'-дифторнуклеозидов. Постоянный интерес к синтезу 2'дезокси нуклеозидов и их аналогам отражается в их удачном использовании в качестве терапевтических средств при лечении вирусных заболеваний и злокачественных опухолей. Определяющей стадией в общем синтезе 2'-дезоксинуклеозидов является очистка и выделение целевой бетааномерной формы нуклеозида, поскольку синтез 2'-дезоксинуклеозидов обычно не является стереоспецифическим и приводит к образованию смеси альфа- и бета- нуклеозидов Vorbruggn, et al., J. Qrg Chem, 41, 2084 (1976), M Hofer, Chem. Ber, 93, 2777 (1960), Walter, et al., Nucleic A.cid Research, 12, 6827 (1984), R P. Nodge, et at , J Org. Chem., 56, 1553 (1991), Tann, et al., J. Org. Chem , 50, 3644 (1985), Howell, et al., J. Org. Chem., 53, 85 (19888) и патент США 4965374, Chou, et al., все описывают различные синтезы смеси альфа- и бета-аномерных дезоксинуклеозидов. Несмотря на успехи, достигнутые на стадии переработки в синтезе нуклеозидов, остается потребность в способе, способном эффективно очищать и выделять обогащенные бета-аномером 2'-дезокси-2',2'-дифторнуіаіеозидьі с повышенным выходом, где дифторнуклеозиды были синтезированы в отсутствие катализатора. В соответствии с этим, цель данного изобретения состоит в разработке способа эффективной очистки и выделения обогащенных бета-аномером 2'-дезокси-2',2'дифторнуклеозидов. Другие цели и преимущества данного изобретения станут очевидными из последующего описания. Данное изобретение представляет собой способ очистки и выделения обогащенных бетааномером нуклеозидов, содержащий а) предоставление смеси, содержащей R", и обогащенный бета-аномером нуклеозид формулы: (IB) где каждый X независимо выбирают из гидроксизащитных групп, и R' представляет нуклеиновое основание формулы где W представляет аминозащитную группу, и R" представляет нуклеиновое основание формулы: NHW' где W представляет аминозащитную группу или водород; в высококипящем растворителе; b) разбавление смеси органическим растворителем, выбранным из группы, состоящей из простых эфиров, сложных эфиров и нитрилов, c) добавление разбавленной реакционной смеси в водную кислоту; и d) выдерживание полученной таким образом кислотной смеси при температуре от 70°С до 100°С до тех пор, пока не осадится продукт формулы IB, гдеУУ представляет теперь W . Наилучший способ осуществления изобретения На всем протяжении этого документа все температуры приводятся в градусах Цельсия, все отношения, проценты и подобные приводятся в массовых долях, а отдельные соединения и все смеси приводятся в объемных единицах, заисключением случаев, где указано иначе. Аномерные смеси выражают как отношение масса/масса или в виде процента. Термин "алкил", один или в комбинации, относится к алифатическим углеводородным группам с нормальной, циклической и разветвленной цепью, которые предпочтительно содержат вплоть до 7 атомов углерода, например, метильной, этильной, н-пропильной, изопропильной, н-бутильной, третбутильной, н-пентильной, н-гексильной, 3метилпентильной группам и подобным или замещенным алифатическим углеводородам с нормальной, циклической и разветвленной цепью, например, хлорэтилу, 1,2-ди-хлорэтилу и тому подобным Термин "замещенный", один или в комбинации, относится к замещению одной или несколькими группами, выбранным из циано, галогена, карбоалкокси, толуоила, нитро, алкокси, алкила и диалкиламино. Фраза "обогащенный аномером", один или в комбинации, относится к аномерной смеси, где отношение конкретного аномера выше, чем 1:1, и включает практически чистый аномер Гидроксизащитные группы (X) относятся к гидроксизащитным группам, известным в данной области, как описано в главе 3 Protective Groups m Organic Chemistry, McOittie Ed., Plenum Press, New York (1973), и в главе 2 Protective Group in Organic Synthesis., Green, John, J. Wiley and Sons, New York (1981). Предпочтительными гидроксизащитными группами являются образующие сложный эфир группы, например, формил, ацетил, замещенный ацетил, пропионил, бутинил, пивалоил, 2хлорацетил, бензоил, замещенный бензоил, фе 53614 феноксикарбонил, метоксиацетил; карбонатные производные, например, феноксикарбонил, этоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил, винилоксикарбонил, 2,2,2-трихлорэтоксикарбонил и бензилоксикарбонил; группы, образующие алкиловый простой эфир, например, бензил, дифенилметил, три фен ил метил, трет-бутил, метоксиметил, тетрагидропиранил, аллил, тетрагидротиенил, 2метоксиэтокси-метил; карбаматы, например, Nфенилкарбамат и N-имидазоил-карбамат; более предпочтительными являются бензоил, монозамещенный бензоил и дизамещенный бензоил, ацетил, пивалоил, трифенилметиловые простые эфиры, и наиболее предпочтительным является бензоил. Аминозащитные группы (W) выбирают из группы, состоящей из групп, образующих силиламины, например, триалкилсилила, включая триметилсилил; изопропилдиалкилсилила, алкилдиизопропилсилила, триизопропилсилила, 1,1,3,3тетраизопро-пилдисилоксанила, третбутилдиалкилсилила и трет-бутилдиарилсилила; карбаматов, например, трет-бутоксикарбонила, бензилоксикарбонила, 4метоксибензилоксикарбонила и 4нитробензилоксикарбонила; формила, ацетила, бензоила и пивал-амидо групп, образующих простой эфир, например, метокси-метила, третбутила, бензила, аллила и тетрагидропиранила; предпочтительной аминозащитной группой является три метил-сил ил. Первой стадией в способе заявленного изобретения является обеспечение смеси, содержащей R", и обогащенный бета-аномером нуклеозид формулы IB: (IB) ХО F где каждый X независимо гидроксизащитных групп, и R нуклеиновое основание формулы: выбирают из представляет NHW где W представляет аминозащитную группу, и R" представляет нуклеиновое основание формулы: NHW' 6 где W представляет аминозащитную группу или водород; в высококипящем растворителе. Такую смесь можно получить многими различными способами. Способы синтеза такой смеси описаны в заявке на Европейский Патент № 93304817.5. Некоторыми способами (в частности, без использования катализатора; с использованием избытка R''-нуклеинового основания, с.9, ЕР 93 304 817.5-, и с использованием высококипящего растворителя, с. 10, строки 13-17), описанными в Европейской заявке № 93304817.5, можно получить обогащенные бета-аномером нуклеозиды с отношением альфа- и бета-аномеров между собой, равным от более, чем 1:1 до менее или равным 1:9. Для достижения таких соотношений необходимо использовать большой избыток R" продукта, который отделяют от целевого продукта заявленным способом. Высококипящий растворитель представляет растворитель, который имеет точку кипения выше 70°С. Высококипящий растворитель является умеренно полярным, стабильным в кислой среде и имеет ненуклеофильный характер. Типичные высококипящие растворители включают ароматические галогеналкил-, алкоксии галогензамещенные ароматические растворители и их смеси. К предпочтительным высококипящим растворителям относятся 1,2-дихлорэтан, 1,1,2трихлорэтан, глим, диглим, толуол, ксилолы, анизол, дихлорбромметан, хлорбензол, дибромхлорметан, трибромметан, дибромметан, ацетонитрил, пропионитрил, диоксан и их смеси, тогда как более предпочтителен анизол. Как только получают смесь, содержащую R" и описанный, обогащенный бета-аномером нуклеозид, заявленный способ идет по следующему пути. Сначала реакционную смесь разбавляют органическим растворителем сточкой кипения выше 60"С. Приемлемые растворители относятся к классам простых эфиров, сложных эфиров и нитрилов; предпочтительными примерами их являются ацетонитрил, этилацетат и тетрагидрофуран. Разбавление проводят при повышенной температуре, которая может быть температурой реакции. Органический растворитель нужно нагревать до повышенной температуры, кроме того, температура как реакционной смеси, так и растворителя должна быть в диапазоне от 70°С до 110°С. Наиболее предпочтительным растворителем является ацетонитрил. Количество добавленного органического растворителя находится в диапазоне от 1мл до 5мл на 1 грамм используемого R" (защищенный или незащищенный цитозин). После разбавления реакционной смеси не требуется особого периода выдерживания; разбавленную смесь можно сразу вводить в следующую стадию. Разбавленную реакционную смесь добавляют в большое количество водной кислоты при повышенной температуре. Назначением водной 5 кислоты является растворение избытка R" (защищенный или незащищенный цитозин), который использовали в реакции гликозилирования, описанной на странице 9 описания к ЕР № 93304817.5. Следовательно, коли 8 53614 тельный альфа-нуклеозид остается в большей чество и величина кислотности водной кислоты части растворенным в органическом слое. Таким зависит от избыточного количества R" (защищенобразом, кислую смесь выдерживают при постоный или незащищенный цитозин), используемого янной температуре до тех пор, пока не имеют мев самой реакции. Кроме того, количество водной сто эти два физических изменения. Как правило, кислоты зависит также от выбора кислотного ведля этого достаточно от 10 минут до 1 часа. щества, используемого при получении водной После достаточного периода выдерживания кислоты. осажденный бета-нуклеозид отделяют от двух Наиболее предпочтительной кислотой жидких фаз фильтрацией или является соляная кислота, используемая в концентрации от 1н до 6н, наиболее центрифугированием и дополнительно предпочтительно при 4н. При использовании промывают водной кислотой. Фильтрацию или такой кислоты и 5-20-кратного избытка R" центрифугирование проводят при постоянной (защищенного или незащищенного цитозина), температуре для предотвращения осаждения из объем водной соляной кислоты составляет—от раствора растворенного в нем защищенного или Змл до 5мл на 1 грамм используемого R" незащищенного цитозина R". (защищенного или незащищенного цитозина). Бета-нуклеозид, выделенный и очищенный таким образом, может все же иметь Тем не менее, возможно предпочтительное присутствующую аминозащитную группу (W), или использование других водных минеральных эта аминозащитная группа (W) может быть кислот и условий реакции. Например, при отщеплена и замещена на атом водорода. Бетанеобходимости, оператор использует такие нуклеозид, выделенный и очищенный указанным минеральные кислоты, как серная, сернистая, выше способом, является продуктом высокой фосфорная, азотная и фосфоновая кислоты. чистоты по отношению к альфа-нуклеозиду, R" Концентрацию кислоты меняют в довольно (защищенному или незащищенному цитозину) и широких пределах, приблизительно в обратной другим примесям; кроме того, установлено, что пропорции по отношению к приемлемому объему целевой продукт получают с превосходным из общей стадии выделения. Как правило, выходом. используют водную кислоту с концентрацией от 1 н до 10%. Объем ее определяют методом Когда кислую смесь фильтруют или оптимизации эксперимента с целью определения центрифугируют для удаления твердого продукта, количества индивидуальной кислоты в органический и водный слои разделяются. реакционной смеси. Необходимые эксперименты Избыток продукта R" (защищенного или просты; от оператора требуется проведение незащищенного цитозина) находится в водном только последовательной корректировки слое, откуда его можно удалить и ре циркулировать обратно в процесс. Защищенный концентрации кислоты и ее объема относительно или незащищенный цитозин R"мoжнo также используемой конкретной реакционной смеси и выделить простым охлаждением водного слоя и слежения за растворимостью продукта R" фильтрацией осажденного продукта R" или путем (защищенного или незащищенного цитозина) в придания водному слою щелочных свойств, каждом случае. охлаждения щелочного раствора и последующего Водная кислота не должна быть горячей, при фильтрования для сбора осажденного ее объединении с реакционной смесью, а иметь защищенного или незащищенного цитозина R". комнатную температуру, поскольку всю смесь Выделенный цитозин по описанному выше нагревают до температуры от 70°С до 100°С. способу по обычной процедуре рециркулируют в Теплота реакции может быть достаточной для процесс получения смеси так, как описано в ЕР № доведения смеси до такой температуры или в 93304817.5. Таким образом, заявленный способ некоторых случаях необходимо нагреть смесь обеспечивает экономичную рециркуляцию посредством наружного нагрева. В некоторых защищенного или незащищенного цитозина R", случаях теплота реакции выше 100°С, поэтому что является полезным достижением заявленного реакционную смесь охлаждают, чтобы она способа. оставалась ниже 100°С. Это следует принимать во внимание также и потому, чтобы повышение Конечной фазой процесса является удаление температуры водной кислоты не приводило к защитных групп X и любой оставшейся W из преждевременному отщеплению на этой стадии защищенного, очищенного твердого нуклеозида защитных групп. Когда в качестве органического формулы IB. Удалением защитных групп получают растворителя используют ацетонитрил, наиболее то же самое аномерное отношение предпочтительная температура составляет от незащищенного нуклеозида. 70°Сдо80°С. Большинство силиламинозащитных групп легко отщепляют с помощью протонного растворитеКислую смесь, образуемую в результате доля, такого, как вода или спирт. Большинство силибавления разбавленной реакционной смеси в ламинозащитных групп уязвимы к отщеплению во водную кислоту, выдерживают, предпочтительно время контс ;тирования с минеральной кислотой. при умеренном перемешивании, в течение некоАцильные защитные группы, например, бензоил, и торого времени. Физическими изменениями, котоациламино-защитные группы удаляют гидролизом рые имеют место во время этого периода выдерс помощью сильного основания при температуре с живания, являются растворение избытка R" 0°С до 100°С. Сильные или умеренно сильные {защищенного или незащищенного цитозина) в основания, походящие для использования в этой водном кислом слое и осаждение целевого бетареакции, имеют рКа (при 25°С) от 8.5 до 20.0. Тануклеозида. Осаждение селективное, и нежела 10 9 53614 кие основания включают гидроокиси щелочных и/или выделить из реакционной смеси способом, металлов, например, гидроокись натрия или каописанным в Патенте США 4 965 374 лия; алкоксиды щелочных металлов, например, Следующий пример иллюстрирует метоксид натрия или трет-бутоксид калия; амиды характерные особенности данного изобретения и щелочных металлов; амин: например, диэтилане предназначен для какого-либо ограничения его мин, гидроксиламин, аммиак и подобные; и объема. і .другие основания, например, гидразин и подобПример 1 * ные. Для каждой защитной группы необходимо Получение, очистка и выделение использование по меньшей мере одного эквиваобогащенного бета-аномером 1-(2'-деокси-2\ 2'лента основания. дифтор-3',5'-ди-0-бензоил-0-рибофуранозил)-4аминопиримидин- 2-она с 22.5 эквивалентами бисАцильные защитные группы можно также три-метилсилилцитозина удалить с помощью кислых катализаторов, например, метансульфокислоты, соляной В трехгорлую колбу на 250мл добавляют ЗОг кислоты, бромистоводородной кислотой, серной цитозина, 25мг сульфата аммония и 150мл кислотой или кислыми ионообменными смолами. гексаметилдисилазана и смесь нагревают до Такой гидролиз предпочтительно проводят при 125Х и выдерживают в течение 30 минут после относительно высокой температуре, например, растворения всех твердых соединений. Затем температуре флегмы данной смеси, однако при температуру поднимают до 145°С, выдерживают использовании сильных кислот процесс ведут при до остановки кипения и затем выдерживают при комнатной температуре. Следует принимать меры температуре до 120°С в вакууме до начала предосторожности, чтобы ацильные защитные образования твердых продуктов выше уровня группы преждевременно не отщеплялись на более жидкости в колбе. Затем смесь охлаждают до ранних стадиях заявленного способа 105°С и добавляют 25мл анизола. Удаление простых эфирных защитных групп В другой колбе на 125мл смешивают 10мл проводят известными способами, например, с анизола и 5 75г 2-дезокси-2,2-дифтор-3,5помощью этантиола и хлорида алюминия. дибензоил-0-рибофуранозил-1-аметансульфоната и смесь нагревают до Трет-Бутилдиметилсилильная защитная образования гомогенной жидкости. Эту жидкость группа требует для ее удаления кислых условий, добавляют при постоянной температуре в смесь например, контактирования с газообразным цитозина и объединенную смесь выдерживают галогеноводородом при 100°С в течение 24 часов. Удаление защитных групп можно удобно проводить в спиртовых растворителях, особенно 133мл часть 4н соляной кислоты помещают в водных алканолах, например, метаноле. Тем не колбе на 500мл. 31 Змл часть ацетонитрила менее, реакцию деблокирования (удаления, добавляют в реакционную смесь и разбавленную защитной группы) можно также проводить в реакционную смесь затем выливают на кислоту любом удобном растворителе, таком как полиолы, при постоянном перемешивании, в то время как включая этиленгликоль, простые эфиры, для колбы на 500мл применяют охлаждающую например, тетрагидрофуран, кетоны, например, баню. Объединенную смесь перемешивают при ацетон и мети лэтилкетон, или 70°С в течение 10 минут и затем фильтруют при постоянной температуре. Влажную д и мети л сульфоксид В предпочтительном примере осуществления фильтровальную лепешку суспендируют в изобретения в реакции удаления защитной группы течение 10 минут при 70°С в 25мл 4н используют аммиак для удаления бензоильной хлористоводородной кислоты и снова фильтруют. гидроксизащитной группы при температуре 10°С Полученную лепешку суспендируют в течение 10 Тем не менее, предпочтительно использование в минут (При 70°С в 25мп деионизированной воды, этой реакции избытка основания, хотя количество фильтруют и влажный остаток снова используемого избыточного основания не суспендируют при 70°С в 50мл деионизированной является критическим параметром. воды. рН водной суспензии поднимают до 7 с помощью бикарбоната натрия и смесь Получаемый бета-обогащенный нуклеозид перемешивают в течение 10 минут при 50"С или NH-. выше и снова фильтруют Полученную лепешку суспендируют еще раз в 50мл деионизированной воды при 70°С в течение 10 минут, фильтруют, остаток сушат и анализируют 3 98г полученного продукта соответствует выходу в 61% и содержит менее 1% нежелательного альфа-аномера Данное изобретение описано достаточно подробно, включая и предпочтительные примеры его осуществления. Тем не менее, следует признать, что специалисты в данной области при рассмотрении настоящего изобретения могут произвести некоторые изменения или усовершенствования, которые не выходят за пределы объема и сущности изобретения, изложенного в формуле. или его органическую или неорганическую кислотно-аддитивную соль можно экстрагировать 11 53614 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77 м Київ, 04050, Україна (044)236 - 47 - 24 12