Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Способ получения гирудина путем высушивания медицинских пиявок 96% этанолом, отличающийся тем, что водный раствор лиофильно высушенных пиявок прогревают в кипящей водяной бане в течение 3-15 минут, центрифугируют, проводят гель-филътрацию надосадочной жидкости через сефадекс Г-25, собирают первый белковый пик, связывают с калликреином плазмы крови, иммобилизированным на водонерастворимом носителе, собирают несвязавшуюся часть и упаривают раствор до сухого остатка.

2. Способ по п. 1, отличающиеся тем, что вместо водного раствора высушенных пиявок используют гомогенат пиявок.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вместо водного раствора высушенных пиявок используют экстракты культуры бактерия симбионта медицинских пиявок.

Текст

Способ получения гирудина путем высушивания медицинских пиявок 96% этанолом, отличающийся тем, что водный раствор лиофильно высушенных пиявок прогревают в кипящей водяной 28191 надосадочную жидкость в роторном испарителе и пропускают через сефадекс Г-25 в колонке размером 50´1,5 мм. Собирают первый белковый пик (с М.М. от 6 до 8,5 кДа) и подвергают аффинной хроматографии на калликремиагарозе в объеме. Несвязавшуюся с калликрепном часть раствора собирают и лиофилизируют. Активность гирудина - 8500 АТNIН Ед/мг. Количество гирудина - 7 мг. При электрофорезе одна полоса с ММ 7100 Да. Пример 2 Берут 100 медицинских пиявок (205 гр). Гомогенезируют в измельчителе тканей, суспендируют в дистилированной воде, генкубируют 30 минут при 37°С, зaтeм отделяют осадок фильтрованием через сетко-марлевый фильтр. Раствор прогревают в кипящей водяной бане в течение 5 минут, затем охлаждают, центрифугир уют, собирают надосадочную жидкость и упаривают ее до минимального объема (1,5 мг) в роторном испарителе. Наносят на колонку (50´1,5 мм) с сефадексом Г-25 и собирают первый белковый пик, который подвергают а ффинной хроматографии на калликрите плазмы крови, иммобилизованном на сиферозе. Собирают несвязавшуюся с калликреином часть раствора и лиофилизируют. Пример 3 Готовят водный экстракт из разрушенной ультразвуком культуры бактерии-симбиогета медицинских пиявок, центрифугируют при 40000 об в течение 40 минут. Получают надосадочную жидкость, которую подвергают процедурам, указанным в примере изображения № 1. Пример 4 Берут 20 гр Пиявита (порошка лиофильно высушенных медицинских пиявок), полученного из 200 гр замороженных пиявок. Проводят водную экстракцию, центрифугир уют при 2000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость прогревают в кипящей водяной бане в течение 8 минут, затем после Охлаждения центрифугируют при 2000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость упаривают до минимального объема (2 мл), наносят на колонку (50´1,5 мм) с сефадексом Г-25. Собирают первый белковый пик и подвергают его аффинной хроматографии на калликрин-агарозе. Несвязавшуюся часть раствора собирают и лиофилизируют. При прогревании водного раствора высушенных пиявок в кипящей водяной бане менее 3 минут, конечный продукт имеет низкую активность в пересчете на белок. Невозможно выделить гирудин, так как только разрушение дестабилезы приводит к освобождению связанного с ней гирудина, а термическая обработка дестатимезного комплекса недостаточна для денатурации линопротендной структуры молекулы дестабилазы. При прогревании же более 15 минут происходит не только разрушение дестабилазы, но и денатурация всех белковых компонентов. Как видно из таблицы, конечный продукт, получаемый по данному способу, обладает высокой антитромбиновой активностью. Способ прост, нетрудоемок и дает выход гирудина в 20 раз больше, чем способ-прототип. Способы тестирования: 1. Определение антитромбиновой активности: Антитромбиновую активность определяют по времени свертывания 0,1 мл 0,3% раствора фибриногена в присутствии 0,1 мл раствора тромбина, содержащего одну NIH международную единицу активности. Удлинение времени свертывания в 2 раза соответствует 2 антитром-биновым единицам гирудина (АТNIH). 2. Электрофоретический анализ проводили в системе Лемли, используя 12,5% полиаприламид-ный гель в присутствии 2М мочевины [2]. Источники информации 1. Markwardt F. Versuche zum Reationsmechanismus des Hirudins Archlv e xp.Path. und Pharmak. Bd.232, Heft 1, 2957. 2. Wilson E.M., Spusberg T.G. Methods in Enzymology, 40, 171-176, 1975. Таблица Определяемый параметр 1. Анти тромбиновая активность (АТЖН Ед/мг) 2. Молекулярные массы белковых фракций при электрофорезе (Да) 3. Количество гирудина (мг) 4. Соотношение: масса исходной биомассы к массе полученного гирудина (гр/мг) Прототип №1 Примеры изобретения №2 №3 №4 8500 8500 9120 7800 8300 7100 и агрегаты 6100 6500 9300 7100 7100 7100 7100 7 6,2 3,2 7,4 29 33 27 572 2 28191 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 34 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Method of hirudin obtaining from the medical leeches

Автори англійською

Nikonov Hennadii Ivanovych, Tytova Olena Oleksandrivna, Selezniov Kostiantyn Heorhiiovych

Назва патенту російською

Способ получения гирудина из медицинских пиявок

Автори російською

Никонов Геннадий Иванович, Титова Елена Александровна, Селезнев Константин Георгиевич

МПК / Мітки

МПК: A61K 35/62

Мітки: пиявок, отримання, медичних, гірудину, спосіб

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/3-28191-sposib-otrimannya-girudinu-iz-medichnikh-piyavok.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб отримання гірудину із медичних пиявок</a>

Подібні патенти