Спосіб одержання штамів менінгокока

Способ получения штаммов менингококка, предусматривающий получение при температуре культивирования 37°С рекомбинанта с полиагглютинабельными свойствами при передаче генетического материала с помощью спонтанной трансформации путем смешивания живых исходных взвесей менингококков серогрупп А и С в соотношениях 10:1-1:10 и выращивании в жидкой питательной среде в течение 5-10 часов с последующим селекционным отбором для достижения гомогенности культуры рекомбинанта по полисахаридному признаку. (19) (21) 96093512 (22) 10.09.1996 (24) 16.10.2000 (33) UA (46) 16.10.2000, Бюл. № 5, 2000 р. (72) Єлисеєва Ірина Віталіївна, Бабич Євген Михайлович, Волянський Юрій Леонідович, Білозерський Володимир Іванович (73) ХАРКІВСЬКИЙ НАУКОВО-ДОСЛІДНИЙ ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. МЕЧНИКОВА 28359 Однако данный метод также не определяет параметров трансформации полисахаридного признака у менингококка. Указанные эксперименты легли в основу многочисленных исследований, проведенных в отношении других видов бактерий (Сборник методик по генетике микроорганизмов // М.: Медицина, 1970. - 248 с., С.Г. Инге-Вечтомов. Генетика с основами селекции // М.: Высшая школа, - 1989. 592 с.). Кэтлин воспроизводил трансформацию признака устойчивости-чувствительности к стрептомицину у менингококков в трех вариантах. Первый осуществлялся с использованием в качестве трансформирующего начала внутриклеточной ДНК, которая извлекалась из лизированных детергентами микробных клеток и подвергалась этанольной экстракции, депротеинизации с додецил-сульфатом натрия и расширенному очищению, включая обработку ацетилтриметиламмония бромидом и кальция хлоридом (В.W. Саtlin. Transformation of Neisseria meningitidis by DеохуrіbоnuсІеаtеs from cells and from culturе slime // J. Bacteriol. - 1960, V. 79. - № 4, - P. 579-590). Второй вариант в основном сводился к вышеописанному, но включал первоначальный этап накопления нативной ДНК (2-6 суток в зависимости от штамма) при культивировании менингококка в жидкой питательной среде, центрифугирование и фильтрацию надосадочной жидкости, что существенно удлиняло сроки исследования (B. Wesley Catlin. Transformation of Neisseria meningitidis by DеохуrіbоnuсІеаtеs from cells and from culturе slime // J. Bacteriol. - 1960, V. 79. - № 4, - P. 579-590). В третьем из приведенных автором экспериментов трансформация клеток достигалась при использовании в качестве трансформирующего начала нативного вещества жидкой фазы суспензии менингококков. Культуры донорного штамма менингококка, устойчивого к стрептомицину и чувствительного к эритромицину, инкубировали в течение 9, 24, 45, 47, 72, 92, 144 часов в термостате при 37°С и постоянном встряхивании первые 18 часов. В качестве питательной среды использовались сердечно-мозговой бульон и сердечная вытяжка с добавлением 0,2% глюкозы. Далее культуры центрифугировались (3000´G, 1 час, 8°С). Надосадочная жидкость отфильтровывалась в стакан с соблюдением асептических условий. Реципиентные клетки стрептомицин-чувствительного и эритромицин-резистентного штамма менингококка культивировались на НI-агаре + + 1,0 мг эритромицина на мл в течение 15 часов, затем суспендировались в сердечном бульоне, 2,0 мл взвеси смешивали при 36°С с 0,5 мл бесклеточного трансформирующего субстрата, разведенного 1:5 и 1:25. Через 15 (50) минут экспозиции добавлялась кристаллическая дезоксирибонуклеаза, которая прерывала процесс трансформации. Трансформирующая активность нативного бесклеточного субстрата, в результате проведенных экспериментов, оказалась несколько превышающей таковую частично очищенного препарата внеклеточной ДНК в концентрации 5 мг/мл, о чем свидетельствует род отношений их трансформа ционных коэффициентов в разных пробах, варьирующий от 1,01 до 4,44 (B. Wesley Catlin. Transformation of Neisseria meningitidis by DеохуrіbоnuсІеаtеs from cells and from culturе slime // J. Bacteriol. - 1960, V. 79. - № 4, - P. 579-590). Недостатками метода являются: приведенные условия осуществления трансформации определены только для признака устойчивости к стрептомицину, но не для полисахаридного признака, время экспозиции реципиентных клеток с нативным субстратом - 15 (50) минут - выбрано произвольно, не оговаривается соотношение донорного и реципиентного компонентов трансформирующей системы, выход трансформантов незначительный. Прототип по данным изученной патентной литературы найти не удалось. В основу изобретения поставлена задача разработать способ получения штаммов менингококка, обладающих полиагглютинабельными свойствами, путем использования метода спонтанной трансформации при определенных условиях, что позволяет получить штамм с новыми свойствами, использование которого повысит эффективность препаратов для специфической профилактики менингококковой инфекции. Поставленная задача достигается путем использования двух живых штаммов Neisseria meningitidis серогрупп А и С при совместном выращивании их в жидкой питательной среде, что позволяет реализовать спонтанную трансформацию полисахаридного признака двух менингококковых популяций, которые выступают одновременно в качестве донора и реципиента трансформирующего начала, что дает без экспериментального вмешательства (центрифугирование, фильтрация и т.д.) более высокий выход трансформантов с полиагглютинабельными свойствами (А+С); определенные соотношения исходных концентраций каждого штамма компенсируют возможный внутривидовой антагонизм менингококков разных серогрупп, когда серогрупповой признак одной из них практически полностью вытесняется другим, что определяется, в первую очередь, индивидуальными свойствами штамма; определенное время совместного культивирования позволяет микробным популяциям достигнуть наиболее высокого уровня компетентности, который обычно наблюдается в поздней логарифмической фазе роста, дает возможность осуществлению метаболической активности, необходимой для развития у трансформантов или их потомства полиагглютинабельного полисахаридного признака и его накоплению в результате деления трансформированных микробных клеток, причем, удлинение времени культивирования в жидкой питательной среде свыше 10 часов приводит к значительному росту вероятности возникновения и установления в популяции мутантов с гетерогенными агглютинабельными свойствами; последующее использование селекции позволяет отобрать гомогенный по серогрупповому признаку штамм, обладающий высокой и стабильной при субкультивировании агглютинабельностью. Описанные условия обеспечивают технический результат, который позволяет получить гомогенный по агглютинирующему признаку полиагглютинабельный штамм-продуцент полисахаридов 2 28359 А и С серогрупп, который может быть использован в дальнейшем для изготовления менингококковой вакцины, эффективной одновременно в отношении двух наиболее значимых серогрупп А и С. Способ воспроизводится следующим образом. Готовят две 1 млрд. (по оптическому стандарту ГИСК им. Л.А. Тарасевича) взвеси путем смыва суточных агаровых менингококковых культур серогрупп А и С в подогретом до 37°С физиологическом растворе. Вносят 0,5 мл каждой взвеси в пробирку с 3,0 мл бульона Хоттингера с добавлением 20% нормальной лошадиной сыворотки, помещают на 4 часа в холодильник при температуре 8°С. Затем берут синхронизированные таким образом культуры менингококков серогрупп А и С и добавляют попарно в ряд пробирок с 3,0 мл бульона Хоттингера с 20% нормальной лошадиной сыворотки в соотношениях 10:1-1:10. Полученные таким образом смешанные культуры помещают в термостат на 5-10 часов при температуре 37°С, после чего делают высев "газоном" на чашку с 20%-ным сывороточным агаром Хоттингера. При появлении видимого роста после инкубирования в термостате при температуре 37°С отбирают изолированные колонии, высевают на сектора чашек с той же питательной средой. В дальнейшем с полученными субкультурами ставят реакцию агглютинации на стекле с диагностическими менингококковыми сыворотками серогрупп А и С по стандартной методике, указанной в наставлении по применению сывороток. Субкультуры с агглютинацией на "четыре креста" вновь пересевают для повторного получения изолированных колоний и последующего отбора наиболее однородных по полиагглютинабельному признаку популяций, которые в 90-100% случаев постановки реакции агглютинации с субпопуляциями обладают выраженной агглютинабельностыо с диагностическими сыворотками серогрупп А и С. Пример 1 Брали два музейных штамма менингококков серогрупп А (№ 10) и С (№ 293), выращивали их на 20%-ном сывороточном агаре Хоттингера при температуре 37°С в термостате в течение 18 часов, после чего выросшие агаровые культуры менингококков смывали подогретым до 37°С физиологическим раствором. По оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича готовили две 1 млрд. взвеси штаммов. По 0,5 мл каждой взвеси вносили в пробирку с 3,0 мл бульона Хоттингера с добавлением 20% нормальной лошадиной сыворотки и помещали в холодильник при температуре 8°С. Через 4 часа добавляли в одну из двух пробирок с 3,0 мл бульона Хоттингера с добавлением 20% нормальной лошадиной сыворотки 0,05 мл взвеси менингококка серогруппы А и 1,0 мл взвеси менингококка серогруппы С, во вторую пробирку с той же питательной средой - 0,05 мл первого из названных компонентов и 0,5 мл - второго. Таким образом, в первой пробирке соотношение двух культур менингококков серогруппы А и С составило 1:20, а во второй - 1:10. Пробирки со смешанными культурами помещали в термостат при температуре 37°С. Через 5 часов инкубации, после появления видимого роста (помутнение бульона) в обеих пробирках делали высевы на две чашки Петри по 0,05 мл бульонной культуры, тщательно растирая по поверхности агара Хоттингера с добавлением 20% нормальной лошадиной сыворотки. После инкубирования в термостате при температуре 37°С на следующий день (через 18 часов) отбирали с каждой из двух ча шек по 24 изолированные колонии, пересевали их на сектора чашек с агаром Хоттингера и помещали в термостат для подращивания микробной массы до появления видимого роста культуры на поверхности агара. С каждой из выросших субкультур ставили реакцию агглютинации на стекле с диагностическими менингококковыми сыворотками серогрупп А и С по стандартной методике, изложенной в наставлении по применению сывороток. В результате из 24 исследованных в реакции агглютинации субкультур ассоциированной культуры менингококков серогрупп А и С, взятых в соотношении 1:20 соответственно, все 24 (100%) агглютинировались только диагностической сывороткой серогруппы С. Из 24 субкультур второй ассоциированной культуры, где исходное соотношение менингококков серогрупп А и С составляло 1:10, 13 (54,2%±10,2%) агглютинировались только диагностической сывороткой серогруппы С, а 11 (45,8%±10,2%) - одновременно двумя сыворотками серогрупп А и С. В дальнейшем субкультуру с наиболее выраженными (на четыре "креста") полиагглютинабельными свойствами (агглютинация одновременно с двумя диагностическими сыворотками серогрупп А и С), подвергали селекции, ежедневно пересевая на агаре Хоттингера отобранные изолированные колонии на протяжении 15 пассажей, каждый раз изучая гетерогенность по агглютинабельному признаку, как было описано выше, до получения гомогенного полиагглютинабельного штамма, субкультуры которого в 90-100% случаев давали резко положительную реакцию агглютинации. Срок наблюдения стабильности полиагглютинабельных свойств - 20 пассажей. Пример 2 Методика исследования соответствовала описанной в примере 1, однако были взяты другие соотношения менингококков серогрупп А и С (штаммы те же), а именно: в первую пробирку вносили 1,0 мл взвеси менингококка серогруппы А и 0,05 мл взвеси менингококка серогруппы С, во вторую - 0,5 мл культуры первого ассоцианта и 0,05 мл - второго. Результаты реакции агглютинации показали, что из 24 субкультур ассоциации с 20-кратным исходным преобладанием менингококков серогруппы А 23 ((95,8±4,1)%) агглютинировались диагностической сывороткой серогруппы А, а 1 ((4,2± ±4,1)%) проявила полиагглютинабельность, взаимодействуя с диагностическими сыворотками обеих серогрупп. Вторая ассоциированная культура, исходное соотношение штаммов менингококков в которой было 10:1, характеризовалась более выраженной гетерогенностью по агглютинабельному признаку. Полиагглютинабельных субк ультур было 14 ((58,3±10,1)%), остальные 10 ((41,7±10,1)%) 3 28359 агглютинировались только диагностической сывороткой серогруппы А. В табл. 1 представлена серологическая характеристика ассоциированных культур менингококка серогрупп А и С, взятых в разных исходных соотношениях и полученных в соответствии с описанной в примере 1 методикой. Статистическая оценка полученных результатов свидетельствует, что удельный вес образовавшихся полиагглютинабельных культур достоверно не отличался, если исходные взвеси брались в интервале соотношений 10:1-1:10 и составлял от (45,8±10,2)% до (66,7±9,6)%. В случае значительного преобладания одного из ассоциантов (20:1 и 1:20) удельный вес полиагглютинирующих культур резко снизился (в 14 раз по сравнению с соотношением 1:10, t=5; 0,1