Спосіб визначення т-2 токсину, нт-2 токсину та зеараленону в зерні

1. Спосіб визначення Т-2 токсину, НТ-2 токсину та зеараленону, що включає екстракцію, очищення екстракту, хроматографію та виявлення, який відрізняється тим, що як елюент при хроматографії використовують водний розчин міцелоутворюючих поверхнево-активних речовин. 3 32845 хроматографування, знизити собівартість аналізу та уникнути ризику для здоров'я персоналу під час здійснення способу. Поставлена мета досягається у способі визначення в зерні Т-2 токсину, НТ-2 токсину та зеараленону, який включає екстракцію мікотоксинів із зразка зерна шестикратним (маса до об'єму) об'ємом суміші ацетону з 10% розчином хлористого натрію (6:1), осадження коекстрактивних речовин 6% розчином оцтовокислого свинцю (50мл розчину на 100мл екстракту), знежирення екстракту гексаном (тричі по 20-40мл гексану на 120мл екстракту), переекстракцію мікотоксинів з водноацетонового розчину у хлороформ (двічі по 40мл), об'єднання хлороформових екстрактів та їх зневоднення сірчанокислим натрієм, випарювання екстракту та розчинення сухого залишку у 100мкл бензолу, нанесення екстракту у кількості 2-20мкл на хроматографічну пластинку з тонким шаром силікагелю, хроматографію у водному розчині, що складається з цетилпіридинію хлориду (5,010,0ммоль/л), Твіну-80 (0,1-25,0ммоль/л) та тетраборату натрію (10-20ммоль/л), виявлення Т-2 токсину та НТ-2 токсину за допомогою суспензії чутливого тест-організму С. pseudotropicales 44-пк, нанесеної на хроматографічну пластину, вкриту агаризованим поживним середовищем, та виявлення зеараленону 0,05 розчином червоного міцного ЖЖ у 50% етиловому спирті. Відмінною ознакою способу, що заявляється, є метод хроматографії з використанням у якості елюенту суміші водних розчинів міцелоутворюючих поверхнево-активних речовин, а саме цетилпіридинію хлориду та Твіну-80 у концентраціях 5,010,0 та 0,1-25,0ммоль/л відповідно, зі стабілізованим тетраборатом натрію (10-20ммоль/л) значенням рН від 8,0 до 10,0. Завдяки якостям, характерним для компонентів елюенту, та особливостям процесу хроматографії, збільшується швидкість розділення речовин, зникає потреба насичувати камеру парами елюенту, знижується собівартість аналізу та нівелюється шкідливий вплив компонентів елюенту на здоров'я персоналу та навколишнє середовище. Приклади використання способу, що заявляється. Приклад 1 Спосіб визначення у зерні Т-2 токсину та НТ-2 токсину. Із середньої проби розмеленого зерна або комбікорму беруть пробу масою 25 г, вносять в конічну колбу на 500мл, додають 20мл 10% розчину хлористого натрію і старанно перемішують. Потім додають 120мл ацетону і суміш стр ушують протягом 1год., після чого фільтрують крізь паперовий фільтр у мірний циліндр і відбирають 100 мл фільтрату. До 100 мл фільтрату додають 20мл 15% водного розчину оцтовокислого свинцю та 30 мл води, перемішують і витримують впродовж 10хв. Осад, що утворився, відділяють шляхом фільтр ування крізь паперовий фільтр. 120мл фільтрату вносять у ділильну лійку, додають 40мл гексану, стр ушують і після розподілу фаз відділяють нижній водноацетоновий шар, а шар гексану вилучають. До 4 водно-ацетонового шару додають двічі по 20мл гексану, струшуючи кожного разу, і після розподілу фаз знову вилучають верхній шар (гексан). Потім до водно-ацетонового екстракту в ділильну лійку двічі додають по 40мл хлороформу, кожного разу струшують і після розподілу фаз для подальшого аналізу відбирають нижній шар (хлороформ). Хлороформові екстракти об'єднують, додають 5-7г безводного сірчанокислого натрію, струшують і залишають на 10хв. Розчин фільтрують, фільтрат випарюють насухо. С ухий залишок розчиняють в 1-2мл бензолу і переносять в пробірку на 5мл, випарюють насухо, залишок розчиняють в 100мкл бензолу. На хроматографічну пластинку з тонким шаром силікагелю наносять стандартні розчини в об'ємах, що містять від 50 до 250нг Т-2 токсину та від 500 до 2500нг НТ-2 токсину. Екстракт зразка, що досліджується, наносять у кількості 5-50мкл на пластинку. Далі пластинки хроматографують у водному розчині цетилпіридинію хлориду (5ммоль/л), Твіну80 (5ммоль/л) та тетраборату натрію (10ммоль/л). Для приготування елюенту до каліброваної мірної колби об'ємом 50,00±0,02мл вносять 2.5мл вихідного розчину ЦПХ з концентрацією 0,10моль/л, 5 мл розчину Твін-80 з концентрацією 50ммоль/л та 5мл стандартного тетраборатного буферного розчину (рН 9,18), до мітки доводять дистильованою водою. Вихідні водні розчини ПАР готують ваговим способом за точною наважкою речовини. Приготований елюент вносять у хроматографічну камеру. Камера насичення не потребує, тому її не обкладають фільтрувальним папером, а пластини хроматографують відразу. Пластини виймають, коли елюент дійде до лінії фронту (приблизно через 10хв.), та висушують. Після цього на пластинки наносять агарне поживне середовище, на яке (після застигання середовища) наносять водну емульсію клітин дріжджів штаму С. pseudotropicalis 44-пк та витримують 1820год за температури 32°С, після чого реєструють характер росту тест-організму, замірюючи діаметр зон затримки росту, що спостерігається за наявності Т-2 або НТ-2 токсину. Масу Т-2 токсину та НТ-2 токсину визначають за діаметрами зон (d) затримки росту за формулами: m(T-2)=21,6e 0,15d m(HT-2)=490,6e0,11d Концентрацію Т-2 та НТ-2 токсину в пробі визначають за формулою: C= 2 ´ 100 ´ B , 25 ´ A де X - концентрація Т-2 або НТ-2 токсину у пробі (мкг/кг); А - об'єм екстракту, нанесеного на пластинку (мкл); В - маса Т-2 або НТ-2 токсину (нг), що відповідає величині зони відсутності росту тестмікроорганізму; 100 - об'єм екстракту (мкл); 25 - маса проби (г); 5 32845 2 - коефіцієнт, який ураховує втрати мікотоксинів у процесі екстракції та очищення. Приклад 2 Спосіб визначення в зерні зеараленону. Із середньої проби розмеленого зерна або комбікорму беруть пробу масою 25г, вносять у конічну колбу на 500мл, додають 20мл 10% розчину хлористого натрію і старанно перемішують. Потім додають 120мл ацетону і суміш стр ушують протягом 1год, після чого фільтрують крізь паперовий фільтр у мірний циліндр і відбирають 100мл фільтрату. До 100мл фільтрату додають 20мл 15% водного розчину оцтовокислого свинцю та 30мл води, перемішують і витримують впродовж 10хв. Осад, що утворився, відділяють шляхом фільтр ування крізь паперовий фільтр. 120мл фільтрату вносять у ділильну лійку, додають 40мл гексану, стр ушують і після розподілу фаз відділяють нижній водноацетоновий шар, а шар гексану вилучають. До водно-ацетонового шару додають двічі по 20мл гексану, струшуючи кожного разу, і після розподілу фаз знову вилучають верхній шар (гексан). Потім до водно-ацетонового екстракту у ділильну лійку двічі додають по 40мл хлороформу, кожного разу струшують і після розподілу фаз для подальшого аналізу відбирають нижній шар (хлороформ). Хлороформові екстракти об'єднують, додають 5-7г безводного сірчанокислого натрію, струшують і залишають на 10хв. Розчин фільтрують, фільтрат випарюють насухо. С ухий залишок розчиняють у 1-2мл бензолу і переносять у пробірку на 5мл, випарюють насухо, залишок розчиняють у 100мкл бензолу. На хроматографічну пластинку з тонким шаром силікагелю наносять стандартний розчин зеараленону в об'ємі, що містить від 20 до 100нг зеараленону, та екстракт досліджуваного зразку у кількості від 5 до 50мкл. Далі пластинки хроматографують у водному розчині цетилпіридинію хлориду (5ммоль/л), Твіну80 (5ммоль/л) та тетраборату натрію (10ммоль/л). Для приготування елюенту до каліброваної мірної колби об'ємом 50,00±0,02мл вносять 2,5мл вихідного розчину ЦПХ з концентрацією 0,10моль/л, 5мл розчину Твін-80 з концентрацією 50ммоль/л та 5мл стандартного тетраборатного буферного розчину (рН 9,18), доводять до мітки дистильованою водою. Вихідні водні розчини ПАР готують ваговим способом за точною наважкою речовини. Пригото Комп’ютерна в ерстка Н. Лисенко 6 ваний елюент вносять у хроматографічну камеру. Камера насичення не потребує, тому її не обкладають фільтрувальним папером, і пластини хроматографують відразу. Пластини виймають, коли елюент дійде до лінії фронту (приблизно через 10хв.), та висушують. Зеараленон визначають обприскуванням пластинки 0,05% розчином міцного червоного ЖЖ у розчині етилового спирту з масовою часткою 50%; про присутність зеараленону у зразку свідчить поява плями жовтого кольору, значення Rf якої відповідає значенню Rf свідка. Технічні результати заявленого способу визначення Т-2 токсину, НТ-2 токсину та зеараленону такі: по-перше, елюент, який використовується у заявленому способі, не має у своєму складі токсичних та летких компонентів, тоді як складові елюенту-аналога (толуол, етилацетат та м урашина кислота) відносяться до небезпечних речовин, гранична допустима концентрація яких становить 0,2-0,5мг/м 3; по-друге, час проведення аналізу скорочено на 1год 40хв. за рахунок зменшення витрат часу на хроматографування у 2 рази та відсутності потреби насичувати камеру парами елюенту; по-третє, вартість елюенту для одного визначення, що використовується у заявленому способі (0,06грн.), тобто у 5,5 разів менша за вартість елюенту аналога (0,33грн.). Джерела інформації: 1. Кононенко Г.П., Буркин А.А. Развитие и современное состояние аналитических исследований микотоксинов //Лабораторный журнал. - 2002. №.-С.50-55. 2. Sherema J. Planar Chromatography //Analytical Chemistry. - 2000. - №12. - P.9-25. 3. ГОСТ 28001-88 Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма. Методы определения микотоксинов: Т-2 токсина, зеараленона (Ф-2) и охратоксина А. 4. Котик А.Н., Рухляда В.В., Тр уфанова В.А. Способ обнаружения в кормах микотоксинов из группы 12, 13-эпокси- D 9-трихотеценов.- А.с. SU №660653, М., 1979. 5. Ображей А.Ф., Погрібняк Л.І., Корзуненко О.Ф. та ін. Методичні вказівки по санітарномікологічній оцінці та поліпшенню якості кормів /Затв. Державним Департаментом ветеринарної медицини Міністерства АПК України за №15-14/73 від 06.03.1998р. - 106с. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601