Спосіб визначення трихотеценових мікотоксинів та зеараленону в зерні

1. Спосіб визначення трихотеценових мікотоксинів та зеараленону в зерні, що включає екстракцію, чищення екстракту, хроматографування та виявлення, який відрізняється тим, що при хроматографуванні використовують як елюент міцелярний розчин поверхнево-активних речовин. 3 26008 4 Поставлена задача досягається тим, що шляструшують і після розподілу фаз відділяють нижній хом екстракції мікотоксинів із зразка зерна шестиводно-ацетоновий шар, а шар гексану вилучають. кратним (маса до об'єму) об'ємом суміші ацетону з До водно-ацетонового шару додають двічі по 20мл 10%-вим розчином хлористою натрію (6:1), осагексану, струшуючи кожного разу, і після розподілу дження снівекстрагованих речовин розчином ацефаз знову вилучають верхній шар (гексан). Потім тату плюмбуму з масовою часткою 6% (50мл роздо водно-ацетонового екстракту в ділильну лійку чину на 100мл екстракту), знежирення екстракту двічі додають по 40мл хлороформу, кожного разу гексаном (тричі по 20-40мл гексану на 120мл екстструшують і після розподілу фаз для подальшого ракту), переекстракцію мікотоксинів з водноаналізу відбирають нижній шар (хлороформ). Хлоацетонового розчину у хлороформ (двічі по 40мл), роформові екстракти об'єднують, додають 5-7г об'єднання хлороформових екстрактів та їх зневобезводного сірчанокислого натрію, струшують і днення сірчанокислим натрієм, випарювання екстзалишають на 10хв. Розчин фільтрують, фільтрат ракту та розчинення сухого залишку у 100мкл бенвипарюють насухо. С ухий залишок розчиняють в золу, нанесення екстракту у кількості 2-20мкл па 1-2мл бензолу і переносять в пробірку на 5мл, хроматографічну пластинку з тонким шаром силівипарюють насухо, залишок розчиняють в 100мкл кагелю, хроматографування у міцелярному розчибензолу. ні цетшітридиній хлориду (5,0-10,0ммоль/л), з доНа хроматографічну пластинку з тонким шаданками 1-пропанолу 1% (у/у) та тетраборату ром силікагелю наносять стандартні розчини в натрію (10-20ммоль/л), виявлення Т-2 токсину та об'ємах, що містять від 50 до 250нг Т-2 токсину та НТ-2 токсину за допомогою суспензії чутливого від 500 до 2500нг НТ-2 токсину. Екстракт зразка, тест-організму С pseudotropicales 44-пк, нанесеної що досліджується, наносять у кількості від 5-50мкл на хроматографічну пластину, вкриту агаризована пластинку. ним поживним середовищем, та виявлення зеараДалі пластинки хроматографують у міцелярленону 0,05%-вим розчином червоного міцного ному розчині цетилпіридиній хлориду (5ммоль/л), з ЖЖ у 50%-вому етиловому спирті. додатком 1-пропанолу 1% (v/v) та те траборату Відмінною ознакою способу, що заявляється, є натрію (10ммоль/л). Для приготування елюенту до використання у якості елюенту міцелярного розчикаліброваної мірної колби об'ємом 50,00±002мл ну поверхнево-активних речовин (ПАР), а саме вносять 2,5мл вихідного розчину ЦПХ з концентцетилпіридиній хлориду (ЦПХ) 5,0-10,0, модифікорацією 0,10моль/л, 0,5мл 1-пропанолу та 5мл ставаного доданками 1-пропанолу зі стабілізованим ндартного тетраборатного буферного розчину (рН тетраборатом натрію (10-20ммоль/л) значенням 9,18), до мітки доводять дистильованою водою. рН від 8,0 до 10,0, при проведенні хроматографуВихідні водні розчини ПАР готують ваговим спосовання досліджуваних об'єктів. бом за точною наважкою речовини. Елюент, що Технічним результатом заявленого способу приготували, вносять в хроматографічну камеру. визначенім Т-2 токсину, НТ-2 токсину та зеаралеКамера насичення не потребує, тому її не обкланону є: дають фільтрувальним папером, а пластини хро- по-перше, відсутність у складі елюенту токматографують відразу. Пластини виймають, коли сичних та летких компонентів, тоді як складові елюент дійде до лінії фронту (приблизно через 10 елюенту аналога (толуол, етилацетат та мурашихвилин), та висушують. на кислота) відносяться до небезпечних речовин, Після цього на пластинки наносять агарне по- по-друге, час проведення аналізу скорочено живне середовище, на яке (після застигання серена 1 годину 40 хвилин за рахунок зменшення видовища) наносять водну емульсію клітин дріжджів трат часу на хроматографування у 2 рази та відсуштаму С. pseudotropicalis 44-пк та витримують 18тності потреби насичувати камеру парами елюен20 годин при 32°С, після чого реєструють характер ту; росту тест-організму, замірюючи діаметр зон за- по-третє, вартість елюенту для одного витримки росту, що спостерігається за наявності Т-2 значення, що використовується у заявленому споабо НТ-2 токсину. собі (приблизно 0,09 грн. на 1 аналіз), в 4,5 разів Маси Т-2 та НТ-2 токсину визначають за діаменша за вартість елюенту аналога (0,33 грн.). метрами зон затримки росту за формулами: Приклади використання корисної моделі, що m(T-2) = 21,6e0,15d; заявляється. Приклад 1. Спосіб визначення Т-2 m(HT-2) = 490,6e0,11d токсину та НТ-2 токсину в зерні. Концентрації Т-2 та НТ-2 токсину в пробі виІз середньої проби розмеленого зерна або значають за формулою: комбікорму беруть пробу масою 25г, вносять в 2 ´ 100 ´ B X= , де конічну колбу на 500мл, додають 20мл 10%-вого 25 ´ A розчину хлористого натрію і старанно перемішуX - концентрація Т-2 або НТ-2 токсину в пробі ють. Потім додають 120мл ацетону і суміш стру.мкг/кг; шують протягом 1год, після чого фільтрують крізь А - об'єм екстракту, нанесеного на пластинку, паперовий фільтр в мірний циліндр і відбирають мкл; 100мл фільтрату. В - маса Т-2 або НТ-2 токсину, пг, що відповіДо 100мл фільтрату додають 20мл 15%-вого дає величині зони відсутності росту тестводного розчину оцтовокислого свинцю та 30мл мікроорганізму; води, перемішують і витримують впродовж 10хв. 100 - об'єм екстракту; мкл: Осад, що утворився, відділяють шляхом фільтру25 - маса проби, г; вання крізь паперовий фільтр. 120мл фільтрату вносять в ділильну лійку, додають 40мл гексану, 5 26008 6 2 - коефіцієнт, що враховує втрати мікотоксидодатком 1-пропанолу 1% (v/v) та те траборату пів в процесі екстракції і очищення. натрію (10ммоль/л). Для приготування елюенту до Приклад 2. Спосіб визначення зеараленону в каліброваної мірної колби об'ємом 50,00±0,02мл зерні, вносять 2,5мл вихідного розчину ЦПХ з концентІз середньої проби розмеленого зерна або рацією 0,10моль/л, 0,5мл 1-пропанолу та 5мл стакомбікорму беруть пробу масою 25г, вносять в ндартного тетраборатного буферного розчину (рН конічну колбу на 500мл, додають 20мл 10%-вого 9,18), до мітки доводять дистильованою водою. розчину хлористого натрію і старанно перемішуВихідні водні розчини ПАР готують ваговим спосоють. Потім додають 120мл ацетону і суміш струбом за точною наважкою речовини. Елюент, що шують протягом 1год, після чого фільтрують крізь приготували, вносять в хроматографічну камеру. паперовий фільтр в мірний циліндр і відбирають Камера насичення не потребує, тому її не обкла100мл фільтрату. дають фільтрувальним папером, і пластини хроДо 100мл фільтрату додають 20мл 15%-вого матографують відразу. Пластини виймають, коли водного розчину оцтовокислого свинцю та 30мл елюент дійде до лінії фронту (приблизно через 10 води, перемішують і витримують впродовж 10хв. хвилин), та висушують. Осад, що утворився, відділяють шляхом фільтруЗеараленон визначають обприскуванням плавання крізь паперовий фільтр. 120мл фільтрату стинки 0,05%-вим розчином міцного червоного вносять в ділильну лійку, додають 40мл гексану, ЖЖ у розчині етилового спирту з масовою часткою струшують і після розподілу фаз відділяють нижній 50%; про присутність зеараленону у зразку свідводно-ацетоновий map, a шар гексану вилучають. чить поява плями жовтого кольору, значення Rf До водно-ацетонового шару додають двічі по 20мл якої відповідає значенню Rf свідка. гексану, струшуючи кожного разу, і після розподілу Джерела інформації: фаз знову вилучають верхній шар (гексан). Потім 1. Кононенко Г. П., Буркин А. А. Развитие и содо водно-ацетонового екстракту в ділильну лійку временное состояние аналитических исследовадвічі додають по 40мл хлороформу, кожного разу ний микотоксинов // Лабораторный журнал. - 2002. струшують і після розподілу фаз для подальшого -№1.-С. 50-55. аналізу відбирають нижній шар (хлороформ). 2. Sherema J. Planar Chromatography // Хлороформові екстракти об'єднують, додають Analytical Chemistry. - 2000. - №12. - P.9-25. 5-7г безводного сірчанокислого натрію, струшують 3. Котик А. Н., Рухляда В. В., Тр уфанова В. А. і залишають на 10хв. Розчин фільтрують, фільтрат Способ обнаружения в кормах микотоксинов из випарюють насухо. С ухий залишок розчиняють в группы 12, 13-эпокси-Д9-трихотеценов.- А.С. № 1-2мл бензолу і переносять в пробірку на 5мл, 660653, М. Кл. А 23 К 1/00//G 01 N 33/02,05.05.79, випарюють насухо, залишок розчиняють в 100мкл Бюл. №17. бензолу. 4 Ображей А.Ф., Погрібняк JIL, Корзуненко На хроматографічну пластинку з тонким шаО.Ф. та ш. Методичні вказівки по санітарнором силікагелю наносять стандартний розчин зеамікологічній оцінці та поліпшенню якості кормів / раленону в об'ємі, що містить від 20 до 100нг зеаВказівки затверджені Державним Департаментом раленону та екстракт зразку, що досліджується, у ветеринарної медицини Міністерства АПК України кількості від 5 до 50мкл. (№ 15-14/73 від 06.03.1998 p.). - 106 с. Далі пластинки хроматографують у міцелярному розчині цетилпіридиній хлориду (5ммоль/л), з Комп’ютерна в ерстка А. Крижанівський Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601