Спосіб одержання полісахариду

Спосіб одержання полісахариду, що включає періодичне культивування Acinetobacter sp. ІMB В7005 і синтез полісахариду на поживному середо 3 33117 4 Спосіб здійснюється таким чином. сівний матеріал використовують культуру з експоAcinetobacter sp. ІMB В-7005 вирощують на серененційної фази росту (20-24год.), вирощену на довищі такого складу (г/л): КН2РО4 - 3,2; КОН - 0,8; мінеральних середовищах наведеного вище складу, що містять як джерело вуглецевого живлення NH4NO3 - 0,3; MgSO4´7Н2О - 0,4; СаСІ2´2Н2О - 0,1; етанол (0,5%, об’ємна частка). Кількість посівного FeSO4´7H2 O - 0,001. У середовище додатково матеріалу становить 10% від об’єму середовища. вносять 0,5% (об’ємна частка) дріжджового автоліКонцентрацію біомаси визначають за оптичзату та 0,0006% (масова частка) пантотенату ною густиною клітинної суспензії з наступним пекальцію. Початкова концентрація етанолу у серерерахунком на абсолютно суху біомасу клітин довищі становить 0,2-0,3% (об’ємна частка), глю(АСБ) у відповідності з калібрувальним графіком. кози - 0,2-0,3% (масова частка). Як посівний матеЕфективність трансформації вуглецю субстратів в ріал використовують культур у з експоненційної ЕПС оцінюють за наступними показниками: кільфази росту (20-24год.), вирощену на мінеральному кість синтезованих ЕПС, вихід ЕПС від субстрату, середовищі наведеного вище складу, що містить ЕПС-синтезувальна здатність. Кількість синтезо0,5% (об’ємна частка) етанолу як джерело вуглеваного полісахариду встановлюють ваговим метоцевого живлення. Кількість посівного матеріалу дом. ЕПС-синтезувальну здатність розраховують становить 10%. Культивування здійснюють у коляк відношення кількості синтезованого ЕПС до бах об’ємом 750мл з 100мл середовища на качалбіомаси та виражають у г ЕПС/ г АСБ. ці (220об/хв..) при 30°С, рН 6,8-7,0 упродовж Концентрацію етанолу в культуральній рідині 120год. визначають за методом газорідинної хроматограЧерез 20-24год. культивування здійснюють фії, глюкози - за глюкозооксидазним методом, піроздрібнене внесення етанолу і глюкози порціями рувату - за реакцією з 2,4-динітрофенілгідразином, по 0,2-0,3% (об’ємна і масова частка відповідно) ацетату - ензиматичним методом з використанням до кінцевої концентрації 0,8-0,9% (об’ємна і масоацетаткінази// Активність ацетил-КоА-синтетази ва частка відповідно). (КФ 6.2.1.1) у безклітинних екстрактах аналізують Використання нового способу дає змогу знизиза утворенням ацетил-КоА, що вступає у реакцію з ти у два раза концентрацію солей у середовищі гідроксиламіном з утворенням ацетилгідроксамакультивування продуцента полісахариду. ту. Продукт реакції ацетилгідроксамату з хлорним Приклад 1. Синтез полісахариду під час росту залізом визначають спектрофотометрично при Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на середовищах з 540нм. різним вмістом солей. З даних, наведених у табл.1, видно, що показКультивування бактерій здійснюють на міненики синтезу полісахариду під час культивування ральних середовищах такого складу (г/л) : КН 2РО4 продуцента на середовищі 1, в якому вміст солей - 3,2; КОН - 0,8; NH4NO3 - 0,3; MgSO4 ´7Н2О - 0,4; знижено у 2 рази порівняно з прототипом, є також СаСІ2´2Н2О - 0,1; FeSO4 ´7Н2О - 0,001 (середовиу 2 рази нижчими. При цьому рН культуральної ще 1) і КН2РО4 - 6,8; КОН -1,8; NH4NO3 - 0,3; рідини знижувалось до 5,0-5,2, що було зумовлено MgSO4 ´7H2O - 0,4; СаСІ2 ´2Н2О - 0,1; FeSO 4´7H2O накопиченням ацетату (до 30мМ). У таких умовах - 0,001 (середовище 2). Молярність буферу у секультивування активність ацетил-КоА-синтетази редовищі 1 становить 0,02М, у середовищі 2 (фермента, за участю якого ацетат залучається до 0,05М. У середовища додатково вносять 0,5% метаболізму у Acinetobacter sp. 1MB В-7005) зни(об’ємна частка) дріжджового автолізату та жувалась у 3,3 рази. Ці результати свідчать про 0,0006% (масова частка) пантотенату кальцію. Як лімітування С 2-метаболізму бактерій в умовах мікджерело вуглецю і енергії використовують суміш сотрофного росту на середовищі 1. етанолу і глюкози у концентрації 0,75% (об’ємна частка) і 0,75% (масова частка) відповідно. Як поТаблиця 1 Синтез полісахариду Acinetobacter sp. 1MB В-7005 на середовищах з різним вмістом солей Середовище культивування Середовище 1 Середовище 2 (прототип) Показники процесу ЕПС, г/л Вихід ЕПС від субстрату, % рНкінцеве Ацетат уКР, мМ Піруват у КР, мМ 4,5 33,5 5,2 30,0 0 Активність ацетилКоА-синтетази, нмоль .хв-1мг-1 білка 54,2 9,2 68,1 6,8 0 0 180,0 Примітка. КР - культуральна рідина Приклад 2. Вплив аденілатів на активність ацетил-КоА-синтетази Культивування бактерій здійснюють в умовах, описаних вище, до середини експоненційної фази росту (18-22год.). Для одержання безклітинних екстрактів культуральну рідину обробляють ульт развуком (22кГц) на апараті УЗДН-1 упродовж 60с, після чого центрифугують (5000g, 10хв., 4°С). Осад клітин тричі відмивають від залишків середовища та полісахариду 0,05М трис-НСl буфером (рН 7,0), центрифугуючи (5000g, 10хв., 4°С). Така ультразвукова обробка культуральної рідини при 5 33117 6 водить до розщеплення високомолекулярних ЕПС (22кГц) 4 рази по 50с при 4°С. Дезінтеграт на низькомолекулярні фрагменти. При цьому істоцентрифугують (12000g, 30хв., 4°С), осад відкидатно знижується в’язкість культуральної рідини, що ють, супернатант використовують як безклітинний дає можливість відокремити клітини від фрагменекстракт. Активність ацетил-КоА-синтетази визнатів ЕПС при центрифугуванні. чають як описано вище. Концентрація аденілатів Відмиті клітини ресуспендують в 0,05М трис(НАДН, Н АДФН, АМФ, аденозин, аденін) у реакНСІ буфері (рН 7,0) та руйнують ультразвуком ційній суміші – 1мМ. Таблиця 2 Активність ацетил-КоА-синтетази Acinetobacter sp. ІMB В-7005 за присутності аденілатів Аденілати (1мМ) НАДН НАДФН АМФ Аденін Аденозин Контроль (без аденілатів) Активність ацетил-КоА-синтетази (нмоль .хв-1мг-1 білка) у процесі росту на середовищі 1 середовищі 2 (прототип) 17,6 64,2 15,7 60,0 20,6 73,2 23,6 82,1 27,9 80,5 54,2 180,0 Таким чином, за присутності аденілатів активність ацетил-КоА-синтетази знижується майже у 3 рази. Окиснення етанолу й ацетальдегіду у Acinetobacter sp. ІMB В-7005 здійснюється НАД+- та НАДФ+-залежними дегідрогеназами, отже, продукти окиснення С 2-субстратів, зокрема, НАДН і НАДФН, інгібують активність ацетил-КоАсинтетази, що в свою чергу зумовлює накопичення ацетату у культуральній рідині і зниження рН. Наявність буферу у середовищі 2 (на відміну від середовища 1) «гасить» коливання рН, зумовлені накопиченням ацетату. При рН, близьких до нейтрального, екзогенний ацетат може знову поступати у клітини бактерій і залучатися до метаболізму. Приклад 3. Вплив рН на швидкість окиснення ацетату інтактними клітинами Acinetobacter sp. ІMB В-7005 Культивування бактерій здійснюють в умовах, описаних вище, до середини експоненційної фази росту. Для визначення швидкості окиснення субстрату клітини Acinetobacter sp. В-7005 центрифугують (4000g, 15хв., 4°С). Отриманий осад клітин двічі відмивають від залишків середовища 0,05М К+-фосфатним буфером (рН 7,0) центрифугуючи (4000g, 15хв., 4°С). Відмиті клітини ресуспендують у 0,05М К+-фосфатному буфері (рН 7,0). Для інкубації клітин при визначенні швидкості окиснення субстратів використовуть трис-НСl буфер (0,05М, рН 7,0). Швидкість окиснення ацетату калію (10мМ) встановлюють за швидкістю поглинання кисню у реакційній суміші полярографічним методом за допомогою електроду закритого типу на полярографі ППТ-1 при температурі 28-30°С. Як видно з наведених у табл.3 даних, швидкість окиснення ацетату максимальна при нейтральному значенні рН. При рН 5,0 ацетат клітинами не окиснюється. Для зниження інгібувальної дії проміжних продуктів окиснення етанолу й ацетальдегіду на активність ацетил-КоА-синтетази (для зниження внутрішньоклітинної концентрації НАДН і НАДФН) у процесі росту бактерій на середовищі з етанолом і глюкозою знижували початкову концентрацію субстратів. Таблиця 3 Швидкість окиснення ацетату інтактними клітинами Acinetobacter sp. ІMB В-7005 за різних значень рН рН реакційної суміші 5,0 6,0 7,0 8,0 Швидкість окиснення ацетату, нмоль О2.xв-1мг-1 клітин у процесі росту на середовищі 1 середовищі 2 (прототип) 0 0 19,3 48,1 40,8 99,5 35,3 80,4 Приклад 4. Вплив початкової концентрації субстратів на швидкість окиснення С 2-С6-субстратів інтактними клітинами Acinetobacter sp. 1MB В-7005 Культивування бактерій здійснюють до середини експоненційної фази росту на середовищі 2 з етанолом і глюкозою в умовах, описаних вище. Початкова концентрація етанолу і глюкози становить (%, об’ємна частка і %, масова частка, відпо відно): 0,25 і 0,25; 0,5 і 0,5; 0,75 і 0,75. Швидкість окиснення С2-С6-субстратів аналізували як описано вище. Дані наведено у табл.4. Таким чином, за зниження початкової концентрації субстратів до 0,25% у середовищі культивування швидкість окиснення ацетату інтактними клітинами підвищується в 1,8 раза. При цьому швидкість окиснення етанолу, ацетальдегіду, глю 7 33117 кози і пірувату залишається практично на одному й тому самому рівні. 8 Таблиця 4 Вплив початкової концентрації етанолу і глюкози на швидкість окиснення С 2-С6-субстратів клітинами Acinetobacter sp. ІMB В-7005 Джерело вуглецевого живлення Етанол, 0,25% + глюкоза, 0,25% Етанол, 0,5% + глюкоза, 0,5% Етанол, 0,75% + глюкоза, 0,75% Швидкість дихання (нмоль О2/ хв мг клітин) за присутності етанолу ацеталь-дегіду ацетату калію глюкози пірувату 74,7 79,8 73,9 67,3 59,4 71,6 78,4 52,5 66,7 58,3 70,3 78,2 40,8 65,6 56,2 Приклад 5. Вплив роздрібненого внесення етанолу і глюкози на синтез полісахариду Acinetobacter sp. ІMB В-7005. Культивування бактерій здійснюють упродовж 120год. на середовищі 2 з етанолом і глюкозою в умовах, описаних вище. Початкова концентрація етанолу і глюкози становить (%, об’ємна частка і%, масова частка, відповідно): 0,2 і 0,2; 0,3 і 0,3; 0,4 і 0,4; 0,5 і 0,5; 0,8 і 0,8. Через кожні 20-22год. росту у середовище вносять етанол і глюкозу порціями по 0,2-0,3% до кінцевої концентрації цих субстратів 0,8-0,9%. Показники синтезу полісахариду наведено у табл.5. Таблиця 5 Синтез полісахариду за роздрібненого введення субстратів у середовище культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 Початкова концентрація субстратів ЕПС, г/л Етанол, 0,2% +глюкоза, 0,2% Етанол, 0,3% +глюкоза, 0,3% Етанол, 0,4% +глюкоза, 0,4% Етанол, 0,5% +глюкоза, 0,5% Етанол, 0,8% +глюкоза, 0,8% 9,2 9,2 7,2 6,3 5,0 Таким чином, зниження у середовищі 2 початкової концентрації етанолу і глюкози до 0,2-0,3% з наступним роздрібненим внесенням субстратів порціями по 0,2-0,3% до кінцевої концентрації 0,8% дає змогу підвищити кількість синтезованого полісахариду до рівня згідно протитипу. Але згідно корисної моделі, вміст солей у середовищі культивування удвічі нижчий, ніж у прототипі. Приклад 6. Синтез полісахариду залежно від інтервалу роздрібненого внесення субстратів ЕПС-синтезувальна здатність, г ЕПС/ г АСБ 6,15 6,20 4,92 3,95 3,35 Культивування бактерій здійснюють упродовж 120год. на середовищі 2 з етанолом і глюкозою в умовах, описаних вище. Початкова концентрація етанолу становить 0,2% (об’ємна частка), глюкози 0,2% (масова частка). Через 12, 16, 20 і 24год. росту у середовище вносять етанол і глюкозу порціями по 0,2% до кінцевої концентрації 0,8% (табл.6). Таблиця 6 Залежність синтезу полісахариду від режиму внесення субстратів Інтервал внесення субстратів, год 12 16 20 24 ЕПС, г/л 7,5 8,4 9,25 9,2 Отже, показники синтезу полісахариду найвищі за умови роздрібненого внесення субстратів у середовище через кожні 20-24год. Таким чином, використання запропонованого способу дає змогу реалізувати без зниження пока ЕПС-синтезувальна здатність, г ЕПС/ г АСБ 5,0 5,9 6,15 6,20 зників синтезу процес одержання полісахариду на середовищі, в якому вміст солей знижено у два разі порівняно з прототипом. 9 Комп’ютерна в ерстка Л.Литв иненко 33117 Підписне 10 Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601