Спосіб визначення рівня катіонних білків нейтрофілів

Спосіб відноситься до галузі медицини, а саме лабораторної діагностики. Може бути використаний в гематології, імунології, терапії, хірургії, акушерстві, гінекології та ін. Відомий спосіб визначення рівня катіонних білків нейтрофілів (КБн) цитохімічним методом з бромфеноловим синім [Шубич М.Г. Выявление катионного белка в цитоплазме лейкоцитов с помощью бромфенолового синего // Цитология. - 1974, №10. - С.1321-1322], який включає: забір капілярної крові; приготування мазка; фіксацію мазка в 5% розчині сульфосаліцилової кислоти протягом 60-90с.; промивання мазка дистильованою водою; висушування; фарбування мазка нанесенням на нього 3-5мл 0,1% розчину бромфенолового синього в 0,05М боратному буфері рН 8,2 на 1-2хв.; промивання мазка дистильованою водою; промивання мазка в трьох змінах 0,05М боратного буфера по 1-3хв.; висушування на повітрі; дофарбовування 1% розчином сафраніну протягом 30-60с; промивання проточною водопровідною водою; висушування; мікроскопування; виявлення катіонного білка за наявністю синіх гранул у цитоплазмі нейтрофілів; підрахунок рівня катіонних білків у 100 нейтрофілах в умовних одиницях за Астальді - Верга [Astaldi G., Verga L. Acta haematol., 1957, vol. 17, p. 129-136], для чого, залежно від ступеня забарвлення цитоплазми, досліджувані нейтрофіли розподіляють на 4 групи: з негативною реакцією (-), слабкопозитивною (+), позитивною (++) і різко позитивною (+++); далі число нейтрофілів з однаковою інтенсивністю забарвлення помножують на відповідне даній групі число плюсів, сума цих добутків складає умовні одиниці (у.о.); отримані дані порівнюють з даними, що визначені у практично здорової людини (у контролі), і за цим показником роблять висновок про рівень катіонних білків у пацієнта. Недоліком даного способу є неврахування показника рівня катіонних білків, який відображує вплив пори року та статі, що обумовлює некоректну оцінку результатів дослідження. Ознаками, спільними з рішенням, що заявляється, є: - забір капілярної крові; - приготування мазка; - фіксація мазка в 5% розчині сульфосаліцилової кислоти; - промивання мазка дистильованою водою; - висушування; - фарбування мазка нанесенням на нього на 1-2хв. 3-5мл 0,1% розчину бромфенолового синього в 0,05М боратному буфері (рН 8,2); - промивання мазка в трьох змінах 0,05М боратного буфера по 1-3хв.; - висушування на повітрі; - дофарбовування 1% розчином сафраніну протягом 30-60с.; - промивання проточною водопровідною водою; - висушування мазка; - мікроскопування та виявлення катіонного білку за наявністю синіх гранул у цитоплазмі нейтрофілів; - підрахунок рівня катіонних білків у 100 нейтрофілах залежно від ступеня забарвлення цитоплазми в умовних одиницях за Астальді - Верга; - порівняння отриманих даних з даними контролю і висновок за цим показником про рівень катіонних білків у нейтрофілах пацієнта. Відомий спосіб оцінки рівня катіонних білків за параметрами їхнього річного біоритму [Н.В.Колесник, Н.Г. Баранник, Ю.А. Кривохацкая, Г.Б Стерн, Н.Б. Широколобова. Параметры годовых ритмов активности ферментов лейкоцитов практически здоровых лиц // Тезисы докладов научно-практической конференции врачей г.Запорожье, посвященной памяти выдающихся медиков - рационализаторов В.В.Ярошенко и Я.Р.Гасуля. Запорожье. - 1994. - 156с. - С.95-97], який включає реєстрацію місяця і години забору капілярної крові; приготування мазка; фіксацію мазка в 5% розчині сульфосаліцилової кислоти протягом 60-90с.; промивання мазка дистильованою водою; висушування; фарбування мазка нанесенням на нього на 1-2хв. 3-5мл 0,1% розчину бромфенолового синього в 0,05М боратному буфері (рН 8,2); промивання мазка в трьох змінах 0,05М боратного буфера по 1-3хв.; висушування на повітрі; дофарбовування 1% розчином сафраніну протягом 30-60с.; промивання проточною водопровідною водою; висушування; мікроскопування; виявлення катіонного білка за наявністю синіх гранул у цитоплазмі нейтрофілів; підрахунок рівня катіонних білків у 100 нейтрофілах залежно від ступеня забарвлення цитоплазми в умовних одиницях за Астальді - Верга; порівняння даних зі середньорічним значенням цього показника в популяції, який приймають за норму, а амплітуду річного коливання - за верхню і нижню межі норми, і за цим показником роблять висновок про рівень катіонних білків. Недоліком даного способу є неможливість порівняння рівня катіонних білків досліджуваного зразка крові з таким, який відповідає сезону дослідження та статі пацієнта, що призводить до некоректної оцінки результатів дослідження. Спільними з прототипом ознаками є: - реєстрація дати дослідження; - забір капілярної крові; - приготування мазка; - фіксацію мазка в 5% розчині сульфосаліцилової кислоти протягом 60-90с.; - промивання мазка дистильованою водою; - висушування; - фарбування мазка нанесенням на нього на 1-2хв. 3-5мл 0,1% розчину бромфенолового синього в 0,05М боратному буфері (рН 8,2); - промивання мазка в трьох змінах 0,05М боратного буфера по 1-3хв.; - висушування на повітрі; - дофарбовування 1% розчином сафраніну протягом 30-60с.; - промивання проточною водопровідною водою; - висушування; - мікроскопування та виявлення катіонного білка за наявністю синіх гранул у цитоплазмі нейтрофілів; - підрахунок рівня катіонних білків у 100 нейтрофілах залежно від ступеня забарвлення цитоплазми в умовних одиницях за Астальді - Верга; - порівняння отриманих даних з показником цього ферменту в популяції і висновок за цим показником про рівень катіонних білків у пацієнта. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення рівня катіонних білків, який шляхом цитохімічної реакції і врахування залежності рівня КБн від пори року та статі, дозволяє здійснити експресоцінку рівня КБн в обстежуваної особи, підвищити її точність і коректність. Суттєвими ознаками способу є: - реєстрація дати дослідження; - реєстрація статі досліджуваної особи; - забір капілярної крові; - приготування мазка; - фіксація мазка в 5% розчині сульфосаліцилової кислоти протягом 60-90с.; - промивання мазка дистильованою водою; - висушування; - фарбування мазка нанесенням на нього на 1-2хв. 3-5мл 0,1% розчину бромфенолового синього в 0,05М боратному буфері (рН 8,2); - промивання мазка в трьох змінах 0,05М боратного буфера по 1-3хв.; - висушування на повітрі; - дофарбовування 1% розчином сафраніну протягом 30-60с.; - висушування; - мікроскопування; - виявлення катіонного білка за наявністю синіх гранул у цитоплазмі нейтрофілів; - підрахунок рівня катіонних білків у 100 нейтрофілах залежно від ступеня забарвлення цитоплазми в умовних одиницях за Астальді - Верга; - розрахунок відносного рівня КБнвідн. у досліджуваної особи за формулою: КБНп КБнвідн. = x100%, (1) 159,9 + 116X - 5,35Y , де КБнвід. - відносний рівень КБн в обстежуваної особи, %; КФнп - рівень КБн в обстежуваної особи, у.о.; 159,9 - постійний коефіцієнт значення рівня КБн у популяції протягом року, у.о.; 11,6 - постійний коефіцієнт впливу статі пацієнтів на рівень КБн; X - стать, дорівнює: 1 - для чоловіків; 2 - для жінок; 5,35 - постійний коефіцієнт впливу сезону року на рівень КБн; Y - сезон року, дорівнює: 1 - зима; 2 - весна; 3 - літо; 4 - осінь; - висновок за цим показником про стан рівня КБн у пацієнта. Відмінними від прототипу ознаками є визначення відносного рівня катіонних білків за формулою 1 шляхом порівняння результатів рівня КБн пацієнта з урахуванням статі зі значеннями рівня КБн в популяції у конкретному сезоні. Спосіб обґрунтовано щомісячними дослідженнями протягом трьох років (394 особи) активності ферменту в мазках периферичної крові позаштатних донорів з діагнозом «здоровий» і відсутністю змін у лейкоцитарній формулі. Досліджували кров, що відбирали між 9 і 10 годинами ранку, реєстрували дату дослідження та стать досліджуваної особи; відбирали капілярну кров; готували мазок; фіксували мазок в 5% розчині сульфосаліцилової кислоти протягом 60-90с; промивали мазок дистильованою водою; висушували; фарбували мазок нанесенням на нього на 1-2хв. 3-5мл 0,1% розчину бромфенолового синього в 0,05М боратному буфері (рН 8,2); промивали мазок в трьох змінах 0,05М боратного буфера по 1-3хв.; висушували на повітрі; дофарбовували 1% розчином сафраніну протягом 30-60с.; промивали проточною водопровідною водою; висушували; мікроскопували; виявляли катіонний білок за наявністю синіх гранул у цитоплазмі нейтрофілів; підраховували рівень катіонних білків у 100 нейтрофілах залежно від ступеня забарвлення цитоплазми в умовних одиницях за Астальді - Верга; для чого досліджувані нейтрофіли розподіляли на 4 групи: з негативною реакцією (-), слабко позитивною (+), позитивною (++) і різко позитивною (+++); число нейтрофілів з однаковою інтенсивністю забарвлення помножували на відповідне даній групі число плюсів, сума цих добутків складала умовні одиниці (у.о.) Статистичний аналіз отриманої бази даних здійснювали за допомогою ППП SPSS,v.13, модулів «Множинна регресія» - метод зважених найменших квадратів, «Факторний аналіз», «Часові ряди» та «Графічний аналіз». Активність ферменту в практично здорових осіб не залежить від віку. На основі статистичного аналізу бази даних було встановлено залежність активності кислої фосфатази від сезону року та статі особи, що відображується рівнянням КБнс=159,9+11,6Х-5,35Y, (2) де КБнс - рівень катіонних білків, що відповідають конкретному сезону року, у.о.; 159,9 - постійний коефіцієнт значення рівня катіонних білків у популяції протягом року, у.о.; 11,6 - постійний коефіцієнт вливу статі на рівень КБ; Х - стать, дорівнює: 1 - для чоловіків, 2 - для жінок; 5,35 - постійний коефіцієнт впливу сезону року на рівень КБ; Y - сезон року, дорівнює: 1 - зима; 2 - весна; 3 - літо; 4 - осінь. 95% довірчий інтервал дорівнює ± 15у.о. Спосіб здійснюють таким чином: реєструють дату дослідження, стать досліджуваної особи; відбирають капілярну кров; готують мазок; фіксують мазок в 5% розчині сульфосаліцилової кислоти протягом 60-90с.; промивають мазок дистильованою водою; висушують, фарбують мазок нанесенням на нього на 1-2хв. 3-5мл 0,1% розчину бромфенолового синього в 0,05М боратному буфері (рН 8,2); промивають мазок в трьох змінах 0,05М боратного буфера по 1-3хв.; висушують на повітрі; дофарбовують 1% розчином сафраніну протягом 30-60с.; промивають проточною водопровідною водою; висушують; мікроскопують; виявляють катіонний білок за наявністю синіх гранул у цитоплазмі нейтрофілів; підраховують рівень катіонних білків у 100 нейтрофілах залежно від ступеня забарвлення цитоплазми в умовних одиницях за Астальді - Верга; для чого досліджувані нейтрофіли розподіляють на 4 групи: з негативною реакцією (-), слабко позитивною (+), позитивною (++) і різко позитивною (+++); число нейтрофілів з однаковою інтенсивністю забарвлення помножують на відповідне даній групі число плюсів, сума цих добутків складає умовні одиниці (у.о.); визначають відносний рівень вмісту КБнвідн. за формулою 1, і за цим показником роблять висновок про стан рівня КБн у пацієнта і при значенні показника в діапазоні 100±15 діагностують норму. Приклад конкретного виконання. Пацієнтка К., вік - 29 років. Діагноз - вагітність 31 тиждень, загроза переривання вагітності. Дата дослідження активності КБн - 19 лютого 2005р. Відбирали капілярну кров; готували мазок; фіксували мазок в 5% розчині сульфосаліцилової кислоти протягом 60-90с.; промивали мазок дистильованою водою; висушували; фарбували мазок нанесенням на нього на 1-2хв. 3-5мл 0,1% розчину бромфенолового синього в 0,05М боратному буфері (рН 8,2); промивали мазок в трьох змінах 0,05М боратного буфера по 1-3хв.; висушували на повітрі; дофарбовували 1% розчином сафраніну протягом 30-60с.; промивали проточною водопровідною водою; висушували; мікроскопували; виявляли катіонний білок за наявністю синіх гранул у цитоплазмі нейтрофілів; підраховували рівень катіонних білків у 100 нейтрофілах залежно від ступеня забарвлення цитоплазми в умовних одиницях за Астальді - Верга; для чого досліджувані нейтрофіли розподіляли на 4 групи: з негативною реакцією (-), слабко позитивною (+), позитивною (++) і різко позитивною (+++); число нейтрофілів з однаковою інтенсивністю забарвлення помножували на відповідне даній групі число плюсів, сума цих добутків складала умовні одиниці (у.о.) Рівень КБНп у вагітної жінки склав 200у.о. Розраховували відносний рівень вмісту КБнвідн у пацієнтки за формулою 1: 200 КБнвідн. = x100% = 112,5%, 159,9 + 116x2 - 5,35x1 , де х - дорівнює 2 (стать жіноча); Y - дорівнює 1 ( сезон - зима); Значення відносного рівня КБн у пацієнтки відповідає популяційній нормі для жінок у зимовий сезон. Таким чином, загроза переривання вагітності на 31 тижні у пацієнтки К. здійснюється на фоні нормального рівня вмісту КБн, що свідчить про відсутність наявності запалювального процесу. Пацієнт З., вік - 35 років. Діагноз - правосторонній адгезивний отит. Дата дослідження активності КБн - 5 червня 2005р., відбирали капілярну кров; готували мазок; фіксували мазок в 5% розчині сульфосаліцилової кислоти протягом 60-90с.; промивали мазок дистильованою водою; висушували, фарбували мазок нанесенням на нього на 1-2хв. 3-5мл 0,1% розчину бромфенолового синього в 0,05М боратному буфері (рН 8,2); промивали мазок в трьох змінах 0,05М боратного буфера по 1-3хв.; висушували на повітрі; дофарбовували 1% розчином сафраніну протягом 30-60с.; протягом 1-2с.; промивали проточною водопровідною водою; висушували; мікроскопували; виявляли катіонний білок за наявністю синіх гранул у цитоплазмі нейтрофілів; підраховували рівень катіонних білків у 100 нейтрофілах залежно від ступеня забарвлення цитоплазми в умовних одиницях за Астальді - Верга; для чого досліджувані нейтрофіли розподіляли на 4 групи: з негативною реакцією (-), слабко позитивною (+), позитивною (++) і різко позитивною (+++); число нейтрофілів з однаковою інтенсивністю забарвлення помножували на відповідне даній групі число плюсів, сума цих добутків складала умовні одиниці (у.о.) Рівень КБн у хворого склав 156у.о. Розраховували відносний рівень КБнвідн у пацієнта за формулою: 156 x100% = 100,4%, КБнвідн. = 159,9 + 11,6x1- 5,35x3 де х - дорівнює 1 ( стать - чоловіча); Y - дорівнює 3; ( сезон - літо). Відповідно до отриманих даних рівень КБн пацієнта З. з діагнозом - правосторонній адгезивний отит, знаходиться на рівні популяційної норми для чоловіків улітку, що свідчить про те, що КБн - не беруть участі в патогенезі такого роду захворювань. Таким чином, запропонований спосіб дозволяє проводити експрес-оцінку рівня катіонних білків у нейтрофілах пацієнтів з урахуванням статі та сезону року, що вкрай важливе тому, що КБн, як відомо, - могутні ендогенні антибіотики широкого спектру дії, до яких у мікроорганізмів не формується стійкість.