Спосіб одержання інсуліну

Спосіб одержання інсуліну, що включає водно 33795 Поставлена мета досягається тим, що подрібнену підшлункову залозу екстрагують 60-85%-вим спиртовим розчином, центрифугують, осаджують баластні білки, фільтрують і одержаний розчин наносять на колонку з сульфокатіонітрм, відмивання баластних білків проводять амонійно-ацетатним буфером з рH 6,0, а елюцію проводять 0,1-1,0 М б і карбонатним буфером з рН 6,5-9,0. Відділення проінсуліну і інших полімерних білків проводять на сорбенті на основі силікагелю з прищепленими гексадециль-ними групами, а як елюент використовують водні розчини з вмістом ізо-пропілового спирту (10-50%) і оцтової, кислоти (0,1-5,0%). Очищення від дезамідованих і інших форм інсуліну проводять в градієнті водно-органічного елюенту з вмістом оцтової, кислоти від 0,2 до 0,8%. Суть способу заключається в дво –триcтадійній обробці підшлункової, залози: - на першій стадії, видаляють основні баластні білки шляхом водно-спиртового екстрагування підшлункової, залози з наступною іонообмінною хроматографією на колонці з сульфокатіонітом і елююванням 0,1-1,0 М бікарбонатним буфером з рН 6,5-9,0, що дозволяє підвищити на 5-12% вихід інсуліну, одержують інсулін-сирець з вмістом інсуліну на рівні 90-93%, - на другій стадії видаляють проінсулін і полімерні білки хроматографією розчину інсуліну-сирцю, що містить ізопропиловий спирт і оцтову кислоту, на колонці (10х30 см) з Діасорбом-130-С16Т, 20 мкм. Елюювання здійснюють тим же розчином із швидкістю 150 мл/хв. Збирають фракцію, що містить основний пік за оптичною густиною. Як детектор використовують фотометр при довжині хвилі 280 нм і довжиною оптичного шляху кювети 0,5 мм. Далі інсулін можна кристалізувати і висушивати до вмісту води не більше 10%, одержуючи (вихід не менше 80%) кристалічний інсулін з вмістом основної речовини не менше 95% і вмістом проінсуліну - не більше 5 ррМ. - на третій стадії, інсулін, одержаний на стадії 2, вносять в розчин, що містить 5-50% етанолу (ацетонітрилу, іаопропілового спирту) і 0,1- 5,0% оцтової, кислоти. Наносять на колонку (15х30 см), упаковану сорбентом Діасорбом-130-С16Т в розміром частинок 12 мк. Елюювання здійснюють лінійним градієнтом від 0 до 100% буфера А+Б за 5 год із швидкістю 120 мл/хв. Буфер А: 12% етанолу, 0,3% оцтової кислоти у воді; буфер Б: 50% етанолу, 0,3% оцтової кислоти. Збирають 10 фракцій основного піку і аналізують їх аналітичною високоефективною рідинною хроматографією (ВЕРХ). Після аналізу об'єднують фракції з вмістом інсуліну не менше 98%. Об'єднані фракції, інсуліну кристалізують (вихід не менше 90%) і висушують до вмісту води не більше 10%. Одержують кристалічний інсулін з вмістом основної, речовини не менше 98,5%, проінсуліну - не більше 5 ррМ, дезамідованих форм інсуліну - не більше 0,3%, високомолекулярних білків - не більше 0,3% (хроматографічна характеристика продукту - 99,17-вого інсуліну, показана на фіг.2). Фракції, з вмістом основної, речовини від ЗО до 98% об'єднують і накопичують для наступної, переробки за стадією 3. Основні переваги запропонованого способу порівняно з прототипом: - зменшено кількість операцій: одна операція при виділенні і дві операції, при очищенні цільового продукту, що в свою чергу значно здешевлює весь процес і скорочує в 180 (1) разів час його проведення; - на першій стадії, робочі об'єми зменшуються практично у 15 разів, що спрощує технологію і суттєво полегшує дотримання санітарних норм виробництва; - кількість енергоємних операцій скорочено до мінімуму; - вміст білкових домішок в інсуліні, одержаному запропонованим способом, набагато нижче, ніж у кращих зразках закордонного виробництва. Метод простий і оригінальний в реалізації., не потребує значної. кількості дорогокоштовного обладнання. В лабораторних умовах проведення всіх операцій по виділенню цільового продукту, починаючи з осадження супутніх компонентів із спиртового екстракту і закінчуючи сушінням, займає один день, а в промислових умовах проведення всіх операцій по одержанню високоочищеного інсуліну (в об'ємах не менше 100 кг на рік. потребує два дні. Запропонований спосіб відрізняється значною наукоємністю, як за видом матеріалів і обладнання, що використовуються, так і за змістом і типом технологічних операцій. П р и к л а д 1. Одержання вксокоочищеної субстанції монокомпонентного інсуліну свиней. Стадія 1. 1 тонну підшлункової залози свиней подрібнюють, екстрагують 60-85% спиртовим розчином, центрифугують, осаджують баластні білки, фільтрують і одержаний розчин наносять на колонку з сульфокатіонітом КУ-23 або Macro-Prep high S support, Bio-Rad USA, 50 мкм, відмивку баластних білків проводять амоній-ацетатним буфером з рН 6,0, елюювання здійснюють 0,5М бікарбонатним буфером (рН 7,5). Проводять кристалізацію і висушують до залишкової, вологості 10%. Одержують 100 г кристалічного інсуліну з вмістом основної речовини 92%. Стадія 2. 100 г кристалічного інсуліну, одержаного за стадією 1, розчиняють в 10 л розчину, що містить 10 % ізопропілового спирту і 0,3% оцтової, кислоти та наносять на колонку діаметром 10 см, довжиною 30 см, заповнену сорбентом Діасорб130-С16Т, 20 мкм. Елюювання проводять тим же розчином із швидкістю 150 мл/хв. Збирають фракцію, що містить основний пік за оптичною густиною. Як детектор використовують фотометр при довжині хвилі 280 нм і довжиною оптичного шляху кювети 0,5 мм. Інсулін кристалізують і висушують до вмісту води не більше 10%. Одержують 80 г (вихід 80%) кристалічного інсуліну з вмістом основної речовини 95% і вмістом проінсуліну 5 ррМ. Стадія 3. 80 г кристалічного інсуліну, одержаного за стадією 2, розчиняють в 9 л розчину, що містить 8% етанолу (або ацетонітрилу чи ізопропілового спирту) і 0,3% оцтової, кислоти. Наносять на колонку 15х30 см, залаковану сорбентом Діасорб-ІЗО-СІбТ з розміром частинок 12 мкм. Елюювання здійснюють лінійним градієнтом від 0 до 100% буфера А+Б за 5 годин із швидкістю 120 мл/хв. Буфер А: 15% етанола, 0,3% оцтової кислоти у воді (17 л), буфер Б: 50% етанола, 0,3% оцтової, кислоти у воді (17 л). Збирають 10 фракцій основного піку і аналізують їх аналітичною ВЕРХ. Пі 2 33795 сля аналізу об'єднують фракції, з вмістом інсуліну не менше 98%. Одержують 72 г (вихід 90%) кристалічного інсуліну з вмістом основної, речовини не менше 98,5%, проінсуліну - не більше 1 ррМ, дезамідованих форм - не більше 0,3%, інсуліну ВРХ не більше 0,2%, висо-комолекулярних білків - не більше 0,2%. Фракції, із вмістом основної, речовини від ЗО до 98% об'єднують і накопичують для наступної переробки за стадією 3. Приклад2. Одержання високоочищеної субстанції монокомгтонен-тного інсуліну великої рогатої худоби(ВРХ). Стадія 1. 1 тонну підшлункової. залози ВРХ подрібнюють, екстрагують 60-85% спиртовим розчином, центрифугують, осаджують баластні білки, фільтрують і одержаний розчин наносять на колонку з сульфокатіонітом КУ-23 відмивку баластних білків проводять амоній-ацетатним буфером з рН 6,2, елюювання здійснюють 0,5 М бікарбонатним буфером (рН 7,0). Проводять кристалізацію і висушують до залишкової; вологості 8%. Одержують 110 г кристалічного інсуліну з вмістом основної речовини 93%. Стадія 2. 110 г кристалічного інсуліну, одержаного за стадією 1, розчиняють в 10 л розчину, що містить 15% ізопропілового спирту і 0,5% оцтової, кислоти та наносять на колонку діаметром 10 см, довжиною 30 см, заповнену сорбентом Діасорб130-С16Т, 20 мкм. Елюювання проводять тим же розчином із швидкістю 150 мл/хв. Збирають фракцію, що містить основний пік за оптичною густиною. Як детектор використовують фотометр при довжині хвилі 280 нм і довжиною оптичного шляху кювети 0,5 мм. Інсулін кристалізують і висушують до вмісту води на рівні 8%. Одержують 90 г (вихід 82%) кристалічного інсуліну з вмістом основної, речовини 95% і вмістом про інсуліну 0,5 ррМ. Стадія 3. 90 г кристалічного інсуліну, одержаного за стадією 2, розчиняють в 10 л розчину, що містить 8% етанолу або ацетонітрилу і 0,3% оцтової, кислоти. Наносять на колонку 15х30 см, запаковану сорбентом Діасорб-130-С16Т з розміром частинок 12 мкм. Елюювання здійснюють лінійним градієнтом від 0 до 100% буфера А+Б за 5 годин із швидкістю 120 мл/хв. Буфер А: 15% етанола, 0,5% оцтової, кислоти у воді (17 л), буфер Б: 50% етанола, 0,5% оцтової, кислоти у воді (17 л). Збирають 10 фракцій основного піку і аналізують їх аналітичною ВЕРХ. Після аналізу об'єднують фракції, з вмістом інсуліну не менше 98%. Одержують 81 г (вихід 90%) кристалічного інсуліну з вмістом основної, речовини не менше 98,5%, проінсуліну - не більше 1 ррМ, дезамідованих форм - не більше 0,3%, інсуліну свиней - не більше 0,1%, високомолекулярних білків - не більше 0,25%. Фракції, із вмістом основної, речовини від ЗО до 98% об'єднують і накопичують для наступної, переробки за стадією 3. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3