Спосіб одержання препарату інсуліну середньопролонгованої дії

Спосіб одержання препарату ін суліну се редньопролонгованої. дії, що включає во дноспиртову екстракцію підшлункової, за лози тварин, іонообмінну хро матографію, хроматографічне відділення проінсуліну та інши х баластних білків, суспенвування очищеного інсуліну з протамін-сульфатом та 33798 нення отриманої субстанції в розчині соляної кислоти, а та кож цинковій кристалізації. інсуліну з використанням розчинів цинку хло ристо го, окису цинку та оцтовокислого, натрію хло риду з добавленням консерванту ("Ре гламент производства инсулина-лонга и инсулина-ультралонга", М.,1982). Основні недоліки методу: невисокий вихід інсуліну, невизначеність якості спиртового екстракту підшлункової, залози, багато стадійність, трудоємність і енергоємність, неекономічний метод концентрування, дуже низька продуктивність (50 мл/год), значні витрати інсуліну для приготування його го тової, лі карської, форми. Ме тою винахо ду є розробка високоефе ктивного, економічного, науковоємного, швидкого і високопродуктивного способу одержання високоочищеного інсуліну сви ней або великої, рогатої, худоби з ха рактеристиками субстанції, інсуліну: вміст інсуліну - не менше 98,5-99,2 %(як правило 98,8-99,3%), вміст проінсуліну - не більше 10 ррМ (як правило, 0,5-5,0 ррМ), вміст інших ба ластних білків - не більше 1%, і препарату інсуліну середньо-пролонгованої, дії: вміст інсуліну ви сокоочищенного сви ного або телячого або їх суміші - 36-42 ОД, натрію фосфо рнокислого - 3,75-4,20 мг, протамін-сульфа ту 0,14-0,22 мг, фенолу - 0,6-0,7 мг, м-крезолу - 1,51,7 мг, гліцерину - 15-19 мг, води високоочище ної для ін'єкцій - до 1мл. Поставлена мета до сягається тим, що по дрібнену підшлункову залозу екстрагують 63-85%-вим спиртовим розчином, центрифугують, осаджують баластні білки, фільтрують і одержаний розчин наносять на колонку з сульфо катюнітом, відмивання баластних білків проводять амонійно-ацетатним буфером з рН 6,0, а елюцію проводять 0,1-1,0 М бікарбонатним буфе ром з рН 6,5-9,0. Відділення проінсуліну і інши х полімерних білків проводять на сорбенті на основі силікагелю з прище пленими гексадецильними групами, а як елюент використовують водні розчини з вмістом ізо-пропілового спирту (10-50%) і оцтової кислоти (0,1-5,0%). Очищення від дезамідованих і інших форм інсуліну проводять в градієнті водно-органічного елюенту э вмістом оцтової, кислоти від 0,2 до 0,8%. Приготування препарату інсуліну середньо-пролонгованої дії здійснюють шляхом отримання суспензії, високоочищеного монокомпонентного інсуліну з застосуванням' спеціальної, технології і ви користанням розчинів монокомпонентного інсуліну, на трію фосфо рнокислого, протамін-сульфату, фенолу, м-крезолу, глі церину, води високочищеної, для ін'єкцій. Суть способу заключається в дво-тристадійній обробці підшлункової. залози: - на першій стадії, видаляють основні баластні білки шляхом водно-спирто вого екстрагування підшлункової, залози а наступною іонообмінною хроматографією на колонці з сульфокатіоні том і елююванням 0,1-1,0 М бікарбонатним буфе ром з рН 6,5-9,0, що до зволяє підвищи ти на 5-12% вихід інсуліну, одержують інсулін-сирець з вмістом інсуліну на рівні 90-93%, - на другій стадії, видаляють проінсулін і полімерні білки хроматографією розчину інсуліну-сирцю, що містить ізопропиловий спирт і оцтову кислоту, на колонці (10х30 см) з Діасорбом-130-С16Т, 20 мкм. Елюювання здійснюють тим же розчином із швидкістю 150 мл/хв. Збирають фракцію, що міс тить основний пік за оптичною густиною. Як детектор використовують фотометр при довжині хви лі 280 нм і довжиною оптичного шляху кювети 0,5 мм. Далі інсулін можна криста лізувати і висушивати до вмісту води не більше 10%, одержуючи (вихід не менше 80%) кристалічний інсулін з вмістом основної, речовини не менше 95% і вмістом проінсуліну - не більше 5 ррМ. - на третій стадії, інсулін, одержаний на стадії 2, вносять в розчин, що містить 5-50% етанолу (ацетонітрилу, ізопропілового спирту) і 0,1- 5,0% оцтової, кислоти. Наносять на колонку (15х30 см), упаковану сорбентом Діасорбом-130-С16Т з розміром частинок 12 мкм. Елюювання здійснюють лінійним градієнтом від 0 до 100% буфе ра А+Б за 5 год із шви дкістю 120 мл/хв. Буфер А: 12% ета нолу, 0,3% оцтової, кислоти у воді; буфер Б: 50% етанолу, 0,3% оцтової, кислоти. Зби рають 10 фракцій основного піку і аналізують їх аналітичною високоефекти вною рідинною хромато графі єю (ВЕРХ). Після аналізу об'єднують фра кції, з вмістом інсуліну не менше 98%. Об'єднані фракції інсуліну кристалізують (вихід не менше 90%) і висушують до вмісту во ди не більше 10%. Оде ржують кристалічний інсулін з вмістом основної речовини не менше 98,5%, проінсуліну - не більше 5 ррМ, де замідованих форм інсуліну - не більше 0,3%, висоскомолекулярних білків - не більше 0,3%. Фракції з вмістом основної речови ни від ЗО до 98% об'єднують і накопичують для настурної переробки за стадією 3. - на четвертій стадії, отримують препарат інсуліну середньо-пролонгованої дії, шляхом спеціальної, технології, розчинення кристалічного ви сокоочищеного монокомпонентного інсуліну з ви користанням компонентів у та кому співвідношенні: вміст інсуліну високоочищеного монокомпонентного свиного або телячого або ї.х суміші - 36-42 ОД, натрію фо сфорнокислого -3,75-4,20 мг, протамін-сульфату - 0,14-0,22 мг, фенолу -0,6-0,7 мг, м-крезолу 1,5-1,7 мг, гліцерину - 15-19 мг, води високоочищеної, для ін'єкцій - до 1мл. Основні переваги запропонованого способу порівняно з прото типом: - зменшено кількість операцій: одна операцій при виділенні і дві операції, при очищен ні цільового продукту, що в свою чергу значно здешевлює весь процес і скорочує в 180 (!) разів час його проведення; - на першій стадії, робочі об'єми зменшуються практично у 15 разів, що спрощує те хнологію і суттєво полегшує до тримання санітарних норм виробництва; - вміст білкових до мішок в інсуліні, одержаному запропонованим способом, набагато нижче, ніж у кращи х зразках закордонного виробництва. - препарат інсуліну се редньо-пролонгованої, дії. забезпечує ви соку те рапевти чну е фекти вність, стабільність суспензії, після струшування, його "м'яку" дію, надійність дії. консерванту і повну нетоксичність останнього. Ме тод простий і оригінальний в реалізації., не потребує значної. кількості дорогокоштовного обладнання. Запропонований спосіб видрізняється значною наукоємністю, як за видом матеріалів і обладнання, що використовується, так і за змістом і типом технологічних операцій. 2 33798 Приклад . Одержання високоочище ного препарату монокомпонентного інсуліну сви ней середньо-пролонгованої, дії.. С тадія 1. 0,4-1,0 тони підшлункової, залози свиней подрібнюють, екстрагують 60-85% спиртовим розчином, центрифугують, осаджують баластні білки, фільтрують і одержаний розчин наносять на колонку з сульфо катіонітом КУ-23 або Macro-Prep high S support, Bio-Rad USA, 50 мкм, відмивку баластних білків проводять амоній-ацетатним буфе ром а рН 6,0, елюювання здійснюють 0,5М б і карбонатним буфером (рН 7,5). Проводять кристалізацію і висушують до залишкової, во логості 10%. Одержують 100 г кристалічного інсуліну з вмістом основної речови ни 92%. Стадія 2. 100 г кристалічного інсуліну, одержаного за стадією 1, розчиняють в 10 л розчину, що містить 10 % ізопропілового спирту і 0,3 % оцтової кислоти та наносять на колонку діаметром 10 см, довжиною 30 см, заповнену со рбентом Діасорб130-С16Т, 20 мкм. Елюювання проводять із швидкістю 150 мл/хв. Збирають фракцію, що містить основний пік за оптичною густиною. Як дете ктор використовують фотометр при довжині хвилі 280 нм і довжиною опти чного шля ху кювети 0,5 мм. Інсулін кристалізують і висушують до вмісту води не більше 10%. Одержують 80 г (вихід 80 %) кристалічного інсуліну з вмістом основної речовини 95% і вмістом проінсуліну 5 ppm. Стадія 3. 80 г кристалічного інсуліну, одержаного за стадією 2, розчиняють в 9 л розчину, що містить 8% етанолу (або ацетонітрилу чи ізопропілового спирту) і 0,3% оцтової кислоти. Наносять на колонку 15´30 см, запаковану сорбентом Діасорб-130-С16Т з розміром части нок 12 мкм. Елюювання здійснюють лінійним градієнтом від 0 до 100% буфе ра А+Б за 5 годин зі швидкістю 120 мл/хв. Буфер А: 15% етанола, 0,3% оцто вої кислоти у во ді ( 17 л ), буфер Б: 50% етанола , 0,3% оцтової кислоти у воді (17 л ) Збирають 10 фракцій основного піку і аналізують їх аналітичною ВЕРХ. Після аналізу об’єднують фракції з вмістом інсуліну не менше 98%. Оде ржують 72 г (вихід 90%) кристалічного інсуліну з вмістом основної речовини не менше 98,5%, проінсуліну не більше-1ppM де амідованих форм- не більше 0,3%, інсуліну ВРХ- не більше 0,2%, високомолекулярних білків не більше-0,2%. Фракції із вмістом основної речови ни від 30 до 98% об’єднують і накопичують для наступної переробки за стадією 3. Стадія 4. 72 г високоочищеного інсуліну порціями розчиняють в 0,005-0,05 М оцтовій кислоті з доданням води для ін’єкцій (pH 3,0-3,5). Отриманий розчин інсуліну змішують поступово з розчином 5%-вого натрію фо сфорнокислого , 1-2%-вим розчином протамін-сульфа ту, 1-3%-вими розчинами фенолу, м-крезолу та глі церину і доводять загальний об’єм суспензії до 48-53 літрів, яку потім направляють на стеріалізуючу фі льтрацію. Простерилізовану суспензію інсуліну надалі стерильно розливають у фла кони або пенфі ли, інші користувачі та ук упорюють їх. Потім здійснюють контроль, маркування, пакування готової (препарату інсуліну се редньо-пролонгової дії). Отриманий таким чином препарат інсуліну середньо-пролангової дії під назвою “МК суінсулін СП” має наступний склад: вміст інсуліну ви сокоочищеного монокомпонентного (свиного або телячого або їх суміші ) 36-42 ОД (характеристи ка субстанції інсуліну: вміст інсуліну не менше 98,599,2% (як правило 98,8-99,3 )), вміст проінсуліну не більше 10 ppM ( як правило, 0,01 – 5,0 ppM), вміст інши х баластних білків – не більше 1-2%), натрію фо сфорнокислого – 3,75 – 4,20 мг, протамін-сульфату – 0,14-0,22мг, фенолу – 0,6 - 0,7мг, м-крезолу – 1,5 – 1,7 мг, глі церину – 15 – 19 мг, води високоочище ної для ін’єкцій – до 1мл. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3