Спосіб модифікації золотої поверхні сенсорного чіпа для іммобілізації білків, злитих з глютатіон-s-трансферазою

Корисна модель належить до біотехнології, біофізики, аналітичної біохімії та медицини і може бути використана з метою створення сенсорних чіпів для вивчення білок-білкових взаємодій. Для створення сенсорного чіпа, що використовується в біосенсорних пристроях із застосуванням явища поверхневого плазменного резонансу (ППP), один з партнерів по взаємодії має бути іммобілізований на сенсорній поверхні [1]. Біосенсори на основі явища ППР знаходять все ширше застосування в медицині та ветеринарії (діагностика хвороб), фармацевтичній та харчовій галузях (контроль якості сировини, напівфабрикатів та готової продукції), в біотехнологічній науковій практиці [1]. Аналіз залежності зміни кута ППР в часі дозволяє без застосування будь-яких міток вивчати утворення макромолекулярних комплексів в режимі реального часу, що значно зпрощує проведення експерименту [1]. ППР-біосенсори, що використовуються для вивчення міжмолекулярних взаємодій складаються з призми повного внутрішнього відбиття, кварцевого чіпа з золотим напиленням, джерела монохроматичного світла (лазера), фоточутливого елементу для фіксування оптичного сигналу та електронного пристрою, що автоматично обробляє інформацію [2]. Створення шару біологічних молекул на поверхні чіпа проводять декількома шляхами. Пряма адсорбція на металеву поверхню - простий і зручний метод, але можлива втрата нативної конформації білка, а отже і втрата активності. Адсорбція на модифіковану поверхню, що захищає/зберігає нативну конформацію білку - більш складний метод порівняно з попереднім [3-7]. Іммобілізація білків на модифікованій поверхні з певною поверхневою концентрацією - дозволяє зменшити стеричні фактори при вивченні білок-білкових взаємодій. Пряма адсорбція білків на золоту поверхню сенсорного чіпа відбувається за рахунок атомів сірки, що є в складі деяких амінокислотних залишків (наприклад - цистеїну). Але при іммобілізації на метал білок втрачає третинну стр уктуру, а отже і нативні властивості, і не може бути використаний для подальшого вивчення [8]. При адсорбції на модифіковану поверхню, що захищає/зберігає нативну конформацію білку, білок, що іммобілізується, дистанціюється від металевої поверхні шляхом створення на ній проміжного моно-, чи полімолекулярного шару. Розроблено багато способів такої модифікації поверхні металу, як правило для неї використовуються: тіоли та їх похідні, циклічні та ароматичні сірковмісні гетероцикли, неорганічні сірковмісні сполуки (сірководень, тіоціанати), полімери (декстрани, білок А) [3, 4, 8]. При модифікації металу поверхня є, як правило, гомогенною, і складається з активних центрів, що створює додаткові просторові перешкоди при вивченні міжмолекулярних взаємодій, оскільки молекули білків щільно іммобілізуються на поверхню сенсорного чіпа. Найбільш близьким до розробленого нами методу є спосіб модифікації сенсорної поверхні із збереженням просторової конформації злитого білка [3]. Даний спосіб модифікації має наступні етапи: очищення поверхні чіпа від можливого забруднення сумішшю перекису водню (35%-го) та сірчаної кислоти (70-90%) в об'ємному співвідношенні 1:1, утворення шару гуанідінтіоціонату на поверхні золота в слабокислому середовищі, для зменшення деструкційного впливу металу, іммобілізація протеїну А (Staphilococcus aureus) в ТВЕ буфері (рН8,08,6) при концентрації 1мг/мл. Зв'язування моноклональних антитіл (МКАТ a-GST mouse, Sigma) проводили в MAPS II буфері протягом 120-200хв. Наступним етапом є іммобілізація білку та перевірка взаємодії з ймовірним білком-партнером. За способом, взятим за прототип, білок іммобілізується з невизначеною поверхневою концентрацією, що підвищує вплив стеричних факторів при перевірці міжбілкових взаємодій, просторова орієнтація молекули білку може виявитися такою, що унеможливить зв'язування з партнером, чіпи одержані таким способом, мають нетривалий термін зберігання - до 1 тижня. Це може привести до некоректного аналізу міжбілкових взаємодій. Цей спосіб потребує застосування дорогих реактивів. В основу корисної моделі покладено розробку нового способу модифікації золотої поверхні сенсорних чіпів, що дозволить іммобілізувати GST-рекомбінантні білкові молекули з певною поверхневою концентрацією та без втрати просторової конформації, що може використовува тися на вітчизняному обладнанні з використанням більш доступних та порівняно недорогих реактивів. Поставлена задача вирішується за рахунок створення на золотій поверхні сенсорного чіпа комплексу карбокситіол-ацетат кадмію-глютатіон, що служить для іммобілізації GST-рекомбінантних білків. За допомогою суміші тіолу та карбокситіолу створюють гетерогенну поверхню, основа якої носить гідрофобний характер, що обумовлений метильними групами тіолів, але над поверхнею виступають заряджені центри, завдяки більшим вугле водневим ланцюгам карбокситіолу. Активацію карбоксильних груп проводять ацетатом кадмію за рахунок утворення зв'язку за донорно-акцепторним механізмом. Основою запропонованого способу модифікації поверхні золота з метою іммобілізації GST-рекомбінантних білків є заміна якірного елементу МКАТ проти GST, на природний субстрат глютатіони-трансферази - трипептид глютатіон. Останній здатний за рахунок сірки цистеїну за донорно-акцепторним механізмом утворювати зв'язок з металомкомплексоутворювачем - кадмієм. Суть корисної моделі полягає в наступному. Спочатку очищають поверхню чіпа від можлививого забруднення сумішшю перекису водню (35%-го) та сірчаної кислоти (70-90%) (Фіг.1). Далі створюють гетерогенну поверхню за допомогою суміші спиртових розчинів мілімолярної концентрації тіолу та карбокситіолу з молярним співвідношенням 300:1 протягом 12-15год, при температурі 30-37°С. Активацію карбоксильних груп проводять сантимолярним спиртовим розчином ацетату кадмію не менше 2 годин при кімнатній температурі, або 15-20год. при +4°С. Чіпи зберігають в розчині ацетату кадмію протягом місяця. За 1-2год. до використання чіп інкубують в боратно-калієвому буферному розчині глютатіону за кімнатної температури (концентрація глютатіону - 1мМ). Іммобілізацію білку проводять на ППРспектрометрі в фосфатному буфері (PBS). Приклад конкретного виконання способу. Приклад 1. Поверхню чіпа очищають сумішшю 35%-го перекису водню та 70%-ї сірчаної кислоти в об'ємному співвідношенні 1:1. Далі додають суміші спиртових мілімолярної концентрації тіолу та карбокситіолу з молярним співвідношенням 300:1 та інкубують протягом 15год, при температурі 37°С. Активацію карбоксильних груп проводять сантимолярним спиртовим розчином ацетату кадмію 20год. при +4°С. Для зберігання чіпи поміщають в спиртовий розчин ацетату кадмію. Перед використанням чіп інкубують в боратно-калієвому буферному розчині 1мМ глютатіону за кімнатної температури протягом 1год. Порівняння розробленого способу модифікації зі способом-прототипом. Приклад 2. На чіпах, отриманих способом, що заявляється та способом-прототипом іммобілізували білок GST. Порівняння адсорбційних кривих (Фіг.2 та Фіг.3) засвідчує е фективність запропонованого способу модифікації сенсорної поверхні для іммобілізації GST-злитих білків, оскільки ППР відгук отриманий згідно запропонованої методики (Фіг.3) має однаковий порядок з прототипом (Фіг.2). Використання способу пояснюють приклади 3-4. Приклад 3. На модифіковану, згідно з прикладом 1, поверхню сенсорного чіпа в фосфатному буфері проводять іммобілізацію GST-рекомбінантного білку цитоплазматичної частини поверхневого рецептору CD150GST-CD150ct (Фіг.4) протягом 45хв. (робоча концентрація білків становить 50мкг/мл). Промивають чіп фосфатним буфером PBS, щоб відмити білок, який неспецифічно зв'язався з поверхнею. Пропускають GST-білок для блокування молекул глютатіону, що не вступили в реакцію, промивають чіп PBS, щоб відмити білок, який неспецифічно зв'язався із поверхнею. Перевіряють взаємодію цитоплазматичної частини поверхневого рецептору CD150 з адапторним рекомбінантним білком GST-SH2D1A. Промивають чіп PBS, щоб відмити білок, який неспецифічно зв'язався з іммобілізованим білком та для перевірки міцності зв'язку. Білки взаємодіють в молярному співвідношенні 1:1. Приклад 4. На модифіковану поверхню сенсорного чіпа (згідно з прикладом 1) в фосфатному буфері проводимо іммобілізацію фосфорильованого GST-рекомбінантного білку - GST-CD150ctPY (Фіг.5) та перевіряємо його кількісне зв'язування з адапторним рекомбінантним білком GST-SH2D1A відповідно до прикладу 3. Білки взаємодіють в молярному співвідношенні 1:2. Отже, молярні співвідношення білків-партнерів іммобілізованих, на модифікованій за способом, що заявляється, поверхні сенсорного чіпа відповідають результатам, отриманим іншими біохімічними методами [912]. Наведені приклади засвідчують ефективність розробленого способу модифікації поверхні для іммобілізації GST-злитих білків з метою вивчення білок-білкових взаємодій. Отже розроблена корисна модель придатна до використання в науково-дослідній практиці, а саме для вивчення білок-білкових та білок-нуклеїнових взаємодій. Також зважаючи на простоту та відносно невелику вартість виконання способукорисна модель придатна і до використання в медицині з метою скринінгової діагностики наявності специфічних антитіл в біологічних рідинах. Підписи до фігур 1-5. Фіг.1. Схема розробленої сенсорної архітектури для аналізу GST-злитних білків на основі перетворювачів поверхневого плазменного резонансу. Фіг.2. Адсорбційна крива іммобілізації GST на поверхню чіпа, модифіковану протеїном А та моноклональними антитілами (α-GST). Фіг.3. Адсорбційна крива іммобілізації GST на поверхню чіпа, модифіковану комплексом карбокситіол-ацетат кадмію-глутатіон. Фіг.4. Адсорбційна крива взаємодії іммобілізованого білку GST-CD150ct з GST-злитим адапторним білком SH2D1A. Фіг.5. Адсорбційна крива взаємодії фосфорильованої форми GST-злитого білку цитоплазматичної частини поверхневого рецептору CD150 та GST-злитого адапторного білку SH2D1A. Джерела інформації 1. Homola J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors //Anal Bioanal Chem. -2003. - V.377, P.528-539. 2. Snopok Β.Α., Kostyuke vych K.V., Rengevych O.V., Shirshov Y.M., Venger E.F., Kolesnikova I.N., Lugovskoi E.V. A biosensor approach to probe the structure and function of the adsorbed proteins: fibrinogen at the gold surface //Semiconductor Physics, Quantum Electronics & Optoelectronics. -1998. -V.1, P.121-134. 3. Boltovets P.M., Snopok Β.Α., Boyko V.R., Shevchenko T.P., Dyachenko N.S., Shirshov Y.M. Detection of plant viruses using a surface plasmon resonance via complexing with specific antibodies //J Virol Methods. -2004. -V.121, (1). - P.101-6. 4. Praig V., Hall Ε.Α. Seeking connectivity between engineered proteins and transducers: connection for glutathione S-transferase fusion proteins on surface plasmon resonance devices //Anal Chemica Acta. - 2003. -V.500, P.323-336. 5. Hermanson G.T., Mallic A.K., Smith P.K., Immobilized Affinity Ligand Techniques //1992, San Diego: Academic Press. 6. Glatz Z., Psotova J., Janiczek O., Chroust K., Jowet T. Use of thiopropyI sepharose for the synthesis of an adsorbent for the affinity chromatography of glutathione S-transferase //J Chromatogr В Biomed Sci AppL - 1997. V.688, P.239-243. 7. Sehr P., Zumbach K., Pawlita M. A generic capture ELISA for recombinant proteins fused to glutathione Stransferase: validation for HPV serology //J of Immunol Meth. - 2001. - V.253, P.153-162. 8. Снопок Β.Α., Снопок Б.А., Болтовец Π.Η., Ро увел Ф. Влияние локального окружения и состояния иммобилизированного лиганда на процесс его взаимодействия с макромолекулярным рецептором //Теоретическая и экспериментальная химия. -2006. - V.42, (4). - Р.206-211. 9. Howie D., Simarro M., Sayos J., Guirado M., Sancho J., Terhorst C. Molecular dissection of the signaling and costimulatory functions of CD 150 (SLAM): CD150/SAP binding and CD150-mediated costimulation //Blood. - 2002. V.99, (3). - P.957-965. 10. ShIapatska L.M., Mikhalap S.V., Berdova A.G., ZeIensky O.M., YunT.J., Nichols K.E., Clark Ε.Α., Sidorenko S.P. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A //J Immunol. - 2001. - V.166, (9). - P.5480-7. 11. Latour S., Gish G., Helgason C.D., Humphries R.K., Pawson Т., Veillette A. Regulation of SLAM-mediated signal transduction by SAP, the X-linked lymphoproliferative gene product //Nat Immunol. - 2001. - V.2 , (8). - P.681-90. 12. Sidorenko S.P., Mikhalap S.V., Shlapatska L.M., Yurchenko M.Y., Akimov Y.M., Chekhun V.F., Signal transduction pathways initiated via cell surface receptor CD150: in silico and in vitro analysis, in Bioinformatics of Genome Regulation and structure, N.K.a. R. Hofestaedt, Editor. 2004, Kluver Academic Publishers: Boston/Dortrecht/London. p.203-210.