Спосіб культивування вірусу грипу птиці

Спосіб культивування вірусу грипу птиці на курячих зародках 9-11-добового віку, який полягає в інкубації зародків із наступним їх інфікуванням вірусом грипу птиці, розтином та визначенням гемаглютинуючої та інфекційної активності хоріоналантоїсної рідини, який відрізняється тим, що інкубування курячих зародків, інфікованих вірусом грипу птиці, проводять при температурі 33 °С. (19) (21) u200813007 (22) 10.11.2008 (24) 10.04.2009 (46) 10.04.2009, Бюл.№ 7, 2009 р. (72) БІЛЯВЦЕВА ОЛЕНА АНАТОЛІЇВНА, UA, ВОРОТІЛОВА НАДІЯ ГРИГОРІВНА, UA (73) КРИМСЬКА ДОСЛІДНА СТАНЦІЯ НАЦІОНАЛЬНОГО НАУКОВОГО ЦЕНТРУ "ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ", UA 3 40466 4 центрифужні стакани ємністю 50см3; курячих зародків хоріон-алантоїсну рідину попереовоскоп; днього пасажу [1]. колби конічні скляні ємністю 100см3 за ГОСТ 2. Культивування вірусу грипу на курячих за1770-74; родках у гуманітарній медицині. пробірки скляні ємністю 10, 15, 20см3 за ГОСТ Яйця білих леггорнів після 10-11 днів інкубації 25336-82; проглядають на овоскопі та відбирають для подапіпетки пастеровські 1, 2, 5 і 10см3 за ГОСТ льшої роботи ті, в яких знаходиться живий заро20292-74; док. Шкаралупу над пугою протирають 70% спирступки фарфорові; том і в центрі роблять отвір. Яйце розміщують на шприці з голками; овоскоп пугою до верху й, прокручуючи навколо скло кварцове; вертикальної осі, знаходять зародок. Для інфікунатрій хлористий за ГОСТ 4233-77 0,87% розвання використовують шприць об'ємом 1мл з голчин (фізіологічний з рН 7,2-7,4); кою діаметром 0,6мм та довжиною 40мм. Яйце натрію гідроокис по ГОСТ 4328-77, 3% розчин залишається на овоскопі, голку достатньо швидабо інші дезінфікуючі розчини; ким колючим рухом вводять в порожнину амніона. натрій лимоннокислий 3-заміщений за ГОСТ Голка знаходиться у правильному положенні, якщо 22280-76,5% розчин; зародок рухається разом з нею. 0,2мл інфікованойод по ГОСТ 4159-79 5% розчин; го матеріалу вводять в амніотичну порожнину. Для антибіотики (пеніцилін, стрептоміцин); одночасового інфікування також в порожнину алапарафін; нтоїса вводять голку злегка витаскують і вводять розвиваючі курячі зародки 9-11-добового віку; ще 0,2мл матеріалу. Отвір в шкаралупі закривають еритроцити півнів у фізіологічному розчині, 1% краплею універсального синтетичного клею. Мазавись; готуються наступним чином: кров беруть у теріалом одного зразка інфікують не менше 5 запівнів або курей у віці старше 6 місяців з підкрильродків. Інфіковані зародки інкубують 3-4 дні при цевої вени колбу з фізіологічним розчином у рівтемпературі 33,0°С [2]. них об'ємах з 5% розчином лимоннокислого натру. Прототип. За ГОСТом 25581-91 «Птица сельсОдержану кров відмивають фізіологічним розчикохозяйственная. Методы лабораторной диагносном, осаджають центрифугуванням з частотою тики» описано спосіб культивування вірусу грипу оборотів 1500об/хв впродовж 15 хвилин. З осаду птиць на курячих зародках. Інфікуванню підлягавідмитих еритроцитів готують 1% суспензію на ють зародки 9-10 добового віку. Контролем є 3-5 фізіологічному розчині і зберігають не більш 5 діб незаражених зародків. при температурі 4°С. Перед інфікуванням зародки овоскопують, Підготовка досліду. відмічають межу пуги. Збоку зародка між кровоноВірусутримуючий матеріал, ізолят збудника сними судинами відмічають дільницю для проколу грипу Influenza A virus /Ch/Sivash/02/2006/H5N1 шкаралупи й інокуляції досліджуємого матеріалу. [4,5], гомогенізують у стерильному фізіологічному Шкаралупу з боку пуги і місце проколу дезинфікурозчині у співвідношенні 1:5 у ступці з кварцовим ють та обробляють фламбуванням. У центрі повітсклом. Гомогенат центрифугують з частотою оберяного простору та в місці введення досліджуємортів 2000об/хв. впродовж 15 хвилин. Надосадкову го матеріалу роблять пробійником отвір, потім рідину відбирають піпеткою і обробляють антибіочерез нього вводять 0,2см3 вірусного матеріалу на тиками для пригнічення сторонньої мікрофлори. глибину 2-3мм в алантоїсну порожнину. Після інПроведення досліду. фікування зародків отвір в шкаралупі заливають Для проведення досліду надосадкової рідини, парафіном. Інфіковані і контрольні зародки інкубуотриманої після обробки кожного зразка вірусного ють у термостаті протягом 72 годин при темпераматеріалу, інфікують не менше 5 зародків 9-11турі 37°С. добового віку. Контролем є 3-5 неінфікованих заУ процесі інкубації зародки овоскопують один родка. раз за добу через 24 години. Зародки, які загибли Перед інфікуванням зародки овоскопують, впродовж перших 24 годин, знезаражують, інші відмічають межу пуги. Збоку зародка між кровоновитримують у холодильнику при температурі 4°С. сними судинами відмічають дільницю для проколу Через 72 години інкубації усі зародки охолоджують шкаралупи й інокуляції досліджуємого матеріалу. при температурі 4°С впродовж 12-18 годин, вскриШкаралупу з боку пуги і місце проколу дезинфікувають і досліджують на наявність вірусу грипу [3]. ють та обробляють фламбуванням. У центрі повітМетою наших досліджень було вдосконалення ряного простору та в місці введення досліджуємотемпературних режимів культивування грипу птиць го матеріалу роблять пробійником отвір, потім на курячих зародках, що забезпечує накопичення через нього вводять 0,2см3 вірусного матеріалу на вірусної біомаси. глибину 2-3мм в алантоїсну порожнину. Після інПоставлена мета досягається шляхом інкубуфікування зародків отвір в шкаралупі заливають вання курячих зародків при температурі 33°С. парафіном. Інфіковані і контрольні зародки інкубуОпис запропонованого способу ють у термостаті протягом 72-96 годин при темпеМетодика культивування вірусу грипу на куряратурі 33°С. чих зародках. У процесі інкубації зародки овоскопують два Апаратура, матеріали і реактиви. рази за добу. Зародки, які загибли впродовж перДля проведення досліду застосовують: ших 24 годин, знезаражують, інші витримують у термостат, який налаштовують на температухолодильнику при температурі 4°С. Через 72-96 ру нагріву 33°С; центрифугу з частотою обертів 3000об/хв.; 5 40466 6 1. Ветеринарная вирусология./В.Н.Сюрин, години інкубації усі зародки охолоджують при темР.В.Белоусова, Н.В.Фомина. - М.: Колос, 1984.пературі 4°С впродовж 12-18 годин і вскривають. 376с. Обробка результатів. 2. Р.Робинсон, У.Даул и др. Лабораторная диЗразок вважають негативним, якщо у 3-5 паагностика вирусных и риккетсиозных заболевасажах не було виявлено гемаглютинації еритроциний./ Под редакцией проф.Э.Леннета и Н.Шмидт. тів і патогенної дії вірусу (загибель зародків). При М.: «Медицина», 1974. - С.333-349. присутності гемаглютинації еритроцитів або заги3. ГОСТ 25581-91 «Птица сельскохозяйственбелі зародків проводять ідентифікацію виділеного ная. Методы лабораторной діагностики». вірусу в реакції затримки гемаглютинації (РЗГА) з 4. Патент на корисну модель №20245. Штам позитивною сироваткою до вірусу грипу птиць вірусу грипу «А(курка) Сиваш/02/06(Н5N1)» для H5N1 [6] з визначенням титру вірусу. РЗГА вважавиготовлення біопрепаратів проти пташиного гриють позитивною, якщо специфічна грипозна сиропу. Стегній Б.Т., Бузун A.I., Музика Д.В., Бабкін ватка повністю гальмує гемаглютинуючу активМ.В., Бісюк І.Ю., Стегній М.Ю., Майорова К.Ф., ність вірусутримуючого матеріалу не менше 1/4 до Білявцева О.А. 1/8 її гомологічного титру. 5. Бабкін М.В., Бузун A.I., Стегній Б.Т., ГерілоЗапропонований спосіб дозволяє накопичувавич А.П. Депонування штаму «А(курка) ти слабо вірулентний вірус грипу птиць шляхом CHBaiu/02/06(H5N1)» вірусу пташиного грипу культивування його на курячих зародках при тем.//Між від.тематич.збірник «Ветеринарна медиципературі інкубації 33°С з подальшим використанна», - 2006. - №87. - С.31-34. ням хоріон-алантоїсної рідини з слабо вірулентним 6. Патент на корисну модель №31027. Спосіб вірусом для отримання біологічних препаратів отримання позитивної контрольної сироватки до (діагностичних та профілактичних). вірусу грипу птиці. Білявцева О.А., Воротілова Джерела інформації: Н.Г., Іонкіна І.Б., Болдирєв А.Д., Стегній Б.Т., Музика Д.В. Комп’ютерна верстка В. Мацело Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601