Спосіб стимуляції репродукції вірусу грипу

Корисна модель належить до галузі вірусології і може використовуватись для одержання великої кількості вібріонів, проведення вірусологічних, імунологічних, наукових і діагностичних досліджень, одержання вакцинних препаратів і діагностичних тест-систем. Відомий спосіб [1] одержання біомаси вірусів шляхом їх вирощування на клітинах тканин потребує постійної підтримки життєздатності культури клітин, спеціальних поживних середовищ і специфічних технологій культивування, спосіб трудомісткий, енергоємний і дорогий. Відомий спосіб [2] репродукції вірусів грипу на курячих ембріонах дозволяє одержувати незначну кількість вірусів. В основу корисної моделі поставлене завдання спростити спосіб, підвищити його ефективність і репродукцію (вирощування) вірусу грипу. Поставлене завдання вирішують шляхом вирощування вірусів грипу на курячих ембріонах при дії магнітного потоку південної спрямованості. Приклад 1. Здійснення способу. В якості об'єктів дослідження було беруть віруси грипу типу A (H1N1) штами 80 і 209, які було виділено від хворих на грип, та музейний штам вірусу грипу типу A (H3N2) (Вікторія) 66/88, одержаний з музею Українського Центру грипу та гострих респіраторних вірусних інфекцій Міністерства охорони здоров'я України. До початку дослідження штами підтримують пасажами на курячих ембріонах. Культивування здійснюють в умовах термостату при температурі 37,5°С, вологості повітря 40-70%. Для інфікування вірусами грипу використовують курячі ембріони віком 10-11 діб з вираженою сіткою кровоносних судин, вагою 20,0-22,0г кожний. Всі операції по зараженню та розтину ембріонів проводять в окремому простерилізованому боксі. Ембріони розміщують на підставці повітряною камерою вгору. Поверхню шкарлупи оброблюють розчином етилового спирту (70°), далі розчином йоду (5%). Шкарлупу у центрі повітряної камери проколюють голкою, після чого крізь отвір за допомогою шприца з голкою вводять вірусовмісний матеріал для культивування на глибину 2-3мм нижче повітряної камери. В порожнину алантоїсу матеріал вводять в об'ємі 0,2мл, інфікуюча доза вірусу становить 64256 ГО/0,2мл. Отвір у шкарлупі заливають розплавленим стерильним парафіном. Впритул до кожного ембріона перед його розміщенням у термостаті з боку повітряної камери поміщають джерело магнітного потоку — ферітбарієвий диск діаметром 20мм та товщиною 3мм з напругою магнітного поля 12мТл. Після цього курячі ембріони поміщають в термостат на інкубування протягом 72 годин після інфікування. Перед розтином курячі ембріони витримують три години при температурі -10°С. В умовах боксу проводять обробку шкарлупи розчином етилового спирту (70°) та йоду (5%). Поверхню шкарлупи обпалюють у вогні пальника. Шкарлупу зрізують за допомогою ножиць вище межі повітряної камери на 1-2мм. Пастерівською пітеткою відбирають алантоїсну та амніотичну рідину з кожного ембріону в окремі пробірки. Отриману рідину центрифугують у режимі 1500об/хв протягом 10хв. Надосадову рідину для подальшої роботи зберігають у стерильній пробірці в холодильнику при температурі 4°С. Приклад 2. Визначення ефективності способу. Ефективність способу визначають за рівнем гемаглютинінів вірусів грипу A (H1N1) та A (H3N2), які утворюються у курячих ембріонах, що перебувають під дією магнітного потоку. Для цього використовують реакцію гемаглютинації (РГА) (3) курячих еритроцитів, які одержують від півня. Кров півня з підкрильцевої вени змішують з 2% розчином лимоннокислого натрію, фільтрують, тричі відмивають у фізіологічному розчині (0,85% розчин NaCl) шляхом додаванні його до еритроцитів з подальшим перемішуванням суміші та центрифугуванням при 1000об./хв. протягом 10хв. З осаду еритроцитів готують 1% суспензію на фізіологічному розчині для використання у РГА. Для проведення реакції гемаглютинації роблять послідовні розведення досліджуваної алантоїсної рідини фізіологічним розчином у полістиролових планшетах на 96 лунок. У пропорції 1:1 змішують розведену алантоїсну рідину та 1% розчин еритроцитів у лунках планшетів і залишають при температурі +18-+20°С на годину. Після цього проводять облік одержаних результатів, які наведено в таблиці 1. Таблиця 1 Дія магнітного потоку на утворення гемаглютинінів вірусів грипу типу А (H1N1)in ovo Штам вірусу грипу типу А NN Кількість ембріонів у досліді Гемаглютинаційна активність досліджуваних штамів (ГО/0,2мл) 80 209 42 48 64 256 Групи досліду І II III Результати дослідження (титр гемаглютинінів ГО /0,2мл) 22,69 10,55 66,66 180,02 102,0 267,75 Примітка: І Група — курячі ембріони, які не були піддані дії магнітного потоку; II Група — курячі ембріони, які знаходились під дією магнітного потоку північної спрямованості; III Група — курячі ембріони, які знаходились під дією магнітного потоку південної спрямованості. Як видно з наведеної таблиці, незалежно від штаму вірусу грипу, південна орієнтація магнітного потоку призводить, порівняно з північною, до стимуляції утворення гемаглютинінів вірусу грипу типу A (H1N1) в курячих ембріонах. Найвищим цей показник виявився у штамі 80, де він становить 6,3 рази, дещо нижчий у штама 209 (2,65 рази). Більше того, виявилося, що рівень утворених гемаглютинінів під дією магнітного потоку південної орієнтації перевищує дані, які одержані у контрольних серіях досліду без дії магнітного потоку — для штаму 80 у 2,9 рази та для штаму 209 у 1,48 рази. Ефективність способу визначають також по утворенню гемаглютинінів вірусу грипу типу A (H3N2) у курячих ембріонах під впливом магнітного потоку південної спрямованості (табл. 2). Таблиця 2 Вплив полярності магнітного потоку та його напруженості на утворення гемаглютинінів вірусу грипу A (H3N2) Група досліду n Результати дослідження (ГО/0,2мл) X І II III IV V 10 10 10 10 10 34,5 */ 17,6 **/ 38,4 **/ 6,4 */ 97,6 ***/ mx ±6,93 ±5,7 ±11,16 ±5,2 ±5,7 «t» ±3,24 ±2,8 ±2,8 ±3,24 ±7,05 Примітка: «І» - контроль; «II» - Північ, модуль напруги 12мТл; «III» - Південь, модуль напруги 12мТл; «IV» - Північ, модуль напруги 32мТл; «V» - Південь, модуль напруги 32мТл; «t */» - критерій достовірності між групами І та IV ±3,24; «t **/» - критерій достовірності між групами II та III ±2,8; «t ***/» - критерій достовірності між групами І та V ±7,05; «n» - кількість курячих ембріонів у групі досліду. З наведених даних видно, що південний напрям магнітного потоку (групи III та V) стимулює утворення вірусу грипу A (H3N2), рівні гемаглютинінів якого, порівнюючи з даними для північного потоку, збільшуються у 2,18 (III група) — 15,25 (V група) разів, а стосовно контролю — у 1,1-2,8 разів. У таблиці 2 сумовані результати дослідження ролі напруженості магнітного потоку у репродукції вірусу грипу. Встановлено, що її підвищення у 2 рази, до 32мТл, для південного напряму магнітного потоку (група V) збільшує рівень гемаглютинінів вірусу грипу типу A(H3N2) порівняно з групою III (модуль напруги становить 12мТл) у 2,54 рази. Цей факт свідчить про наявність прямої залежності інтенсивності утворення гемаглютинінів вірусу грипу типу А від напруги магнітного потоку південної спрямованості. Статистичне дослідження цих показників показує рівень їх високої достовірності стосовно групи контролю та груп досліду, ембріони в яких піддавали дії магнітного потоку північної спрямованості і підтверджує критерієм «t*» їх повну рівнозначність. Запропонований корисною моделю спосіб стимуляції репродукції вірусу рипу має значні переваги над прототипом, спрощує спосіб — не потребує постійної підтримки життєдіяльності культури клітин, специфічних технологій їх вирощування, які трудомісткі, енергоємні і коштовні, вимагають спеціальних поживних середовищ (1) і великої кількості курячих ембріонів і, до того ж дають незначну активність репродукції вірусу (2) грипу. Спосіб дозволяє одержати значну біомасу вірусів грипу. Джерела інформації 1. «Виділення та культивування вірусів грипу на культурі клітин MDCK» додаток до наказу МОЗ України №488 від 17.07.2006р. 2. Методические рекомендации "Выделение вирусов гриппа в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация" (утв. Федеральной службой РФ по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 18 апреля 2006г. N 0100/4430-06-34). 3. Топчий М. К., Корнюшенко Н. П. Руководство к практическим занятиям по вирусологии. — К.: Изд-во Киевского Университета, 1967. - 248 с.