Спосіб визначення наявності аутоімунної реакції у хворих на ішемічну хворобу серця

Спосіб визначення наявності аутоімунної реакції у хворих на ішемічну хворобу серця, що включає забір крові, отримання сироватки, визначення вмісту кінцевих продуктів вільнорадикального окислення білків сироватки крові 1,4динітрофенілгідразонів, який відрізняється тим, що для аналізу беруть 0,1 мл сироватки крові хворого, осад білків сироватки крові здійснюють за допомогою (0,9 мл) 20 % розчину трихлороцтової кислоти (ТХОК), до денатурованих білків додають рівний об'єм (1 мл) 0,1 М 2,4-ДФГ (2,4динітрофенілгідразин), що розчинений в 2N НС1 і U 2 (19) 1 3 відносно загальної кількості лімфоцитів (на 200500 клітин). В контрольні проби додають 800 мкл ППС та 200 мкл плазми крові. Нормальні значення - менше 5 %. Описаний спосіб визначення наявності аутосенсибілізації по клітинному типу має наступні недоліки. Виконання цього способу вимагає використання великої кількості процедур, значних витрат часу (від трьох до семи діб), використання дорогих реагентів та апаратури. Найбільш близьким по технічній суті запропонованому є спосіб визначення наявності (більше 200 мОд/мл) або відсутності (менше 200 мОд/мл) аутосенсибілізації по гуморальному типу за рівнем аутоантитіл до окислених ліпопротеїдів низької щільності в сироватці крові з використанням імуноферментних тест-систем (ВІ-20032 Biomedica gruppe, Відень, Австрія), який полягає в тому, що в лунки планшету поміщають по 200 мкл буферного розчину, потім додають по 20 мкл матеріалів (стандарти, контролі, біозразки) розведені буферним розчином 1:50. Інкубують протягом півтори години при 37 °С. Після інкубації зливають надосадкову рідину. Осад промивають чотири рази 300 мкл розведеним водою 1:20 буферним розчином. Підсушують фільтрувальним папером. В усі лунки додають по 100 мкл кон'югату (моноклональні антитіла IgG-HRPO). Інкубують 30 хвилин при кімнатній температурі. Після інкубації підсушують фільтрувальним папером. В усі лунки додають по 100 мкл субстрату (ТМВ - розчин). Інкубують 15 хвилин при кімнатній температурі в темному місті. Потім додають в усі лунки по 50 мкл зупиняючого розчину (Н2 SO4). Вимірюють абсорбцію негайно при довжині хвилі 450 та 620 нм. Розрахунок проводять відніманням від значення проби значення контролю (з урахуванням розведення 1:50) на мілілітр сироватки крові. Нормальні значення - менше, ніж 200 мОд/мл. Цей спосіб має наступні недоліки: витрати великих коштів на готові імуноферментні тестсистеми, використання спеціальної апаратури (елізопроцесор). В основу способу поставлено завдання розробки способу визначення наявності аутоімунної реакції у хворих на ішемічну хворобу серця, заснованому на визначенні ступеня активації вільнорадикального окислення білків сироватки крові у хворих на ішемічну хворобу серця, в якому шляхом зміни дій, режимів та застосування речовин забезпечується економія часу та коштів та підвищується специфічність та точність оцінки наявності аутоімунного процесу у хворих на ішемічну хворобу серця. Для цього процес передбачає визначення вмісту кінцевих продуктів вільнорадикального окислення білків сироватки крові 1,4дінітрофенілгідразонів у хворих на ішемічну хворобу серця. Новим у способі є те, що для аналізу беруть 0,1 мл сироватки крові хворого, осад білків сироватки крові здійснюють за допомогою (0,9 мл) 20 % розчину трихлороцтової кислоти (ТХОК), до денатурованих білків додають рівний об'єм (1мл) 0.1М 2,4 - ДФГ (2,4-дінітрофенілгидразин), що розчине 42338 4 ний в 2N НС1 і этиловому спирті та видержаного в киплячій бані до повного розчинення 2,4-ДФГ, в контрольну пробу додають замість 2,4-ДФГ рівний об'єм 2N НС1, інкубацію здійснюють при кімнатній температурі протягом однієї години, потім проби центрифугують при 6000 g протягом 15-20 хвилин, осад промивають 3 рази розчином этанол- этилацетат (1:1), центрифугують при 6000 g протягом 15-20 хвилин для екстракції ліпідів та 2,4-ДФГ, який не прореагував з карбонільними групами окислених білків, отриманий осад підсушують з метою усунення розчинника, що залишився (етанолетілацетата) і потім розчиняють в 8М розчині сечовини, сечовину приливають до осаду в об'ємі 4 мл і витримують в киплячій бані протягом 5 хвилин до повного розчинення, оптичну щільність 1,4дінітрофенілгідразонів, що утворилися регіструють на спектрофотометрі при довжині хвилі 370 нм., результати розраховують як оптичну щільність на мілілітр сироватки крові, оптична щільність - умовна одиниця Од/мл., та при значеннях, вищих за 6,5 Од/мл роблять висновок про наявність аутоімунної реакції. Показано, що ішемічна хвороба серця супроводжується оксидативним стресом в результаті надмірної активації окислювальних реакцій та пригнічення антиоксидантного захисту організму. В умовах оксидативного стресу окрім ліпідних молекул окислювальній модифікації можуть підлягати і білкові компоненти організму, що призводить до модифікації (окисленню) їх N-кінцевої частини амінокислоти та зміна їх структурної організації, що може стати причиною придбання останніми антигенних властивостей та ініціації аутоімунного процесу до власних білків організму. Саме цей процес лежить в основі розвитку аутоімунних уражень. Вміст кінцевих продуктів вільнорадикального окислення білків сироватки крові 1,4дінітрофенілгідразонів у хворих на ішемічну хворобу серця має чітку корелятивну залежність від наявності аутосенсибілізації у хворих на ішемічну хворобу серця. Перевагою над існуючими методами є те, що для оцінки наявності аутосенсибілізації використовується лише визначення вмісту 1,4дінітрофенілгідразонів в 0,1 мл сироватки крові. Внаслідок цього підвищується економія робочого часу, хімічних реагентів (реагенти для імуноферментного аналізу мають високу ціну), специфічність, точність діагностики і тим самим ефективність лікування хворих на ішемічну хворобу, які мають ознаки окислювального стресу. Для аналізу беруть 0,1 мл сироватки крові хворого. Осад білків сироватки крові здійснюється за допомогою (0,9 мл) 20 % розчину трихлороцтової кислоти (ТХОК). До денатурованих білків додають рівний об'єм (Імл) 0,1М 2,4- ДФГ (2,4-дінітрофенілгидразин), що розчинений в 2Н НС1 і етиловому спирті та видержаного в киплячій бані до повного розчинення 2,4-ДФГ. В контрольну пробу додають замість 2,4-ДФГ рівний об'єм 2Н НС1. Інкубацію здійснюють при кімнатній температурі протягом однієї години. Потім проби центрифугують при 6000 g протягом 15-20 хвилин. Осад промивають 3 рази розчином етанол - етилацетат 5 42338 (1:1), центрифугують при 6000 g протягом 15-20 хвилин для екстракції ліпідів та 2,4-ДФГ, який не прореагував з карбонільними групами окислених білків. Отриманий осад підсушивають з метою усунення розчинника, що залишився (етанолєтілацетата) і потім розчиняють в 8М розчині сечовини. Сечовину приливають до осаду в об'ємі 4 мл і витримують в киплячій бані протягом 5 хвилин до повного розчинення. Оптичну щільність 1,4дінітрофенілгідразонів, що утворилися реєструють на спектрофотометрі при довжині хвилі 370 нм. Результати розраховують як оптичну щільність на мілілітр сироватки крові. Оптична щільність умовна одиниця Од/мл., та при значеннях, вищих за 6,5 Од/мл роблять висновок про наявність аутоімунної реакції. Для впровадження нововведення необхідна наступна аппаратура: центрифуга, спектрофотометр. Нормальні значення коливаються в межах 4,56,5 Од/мл. При значеннях більших, ніж 6,5 Од/мл у хворих можна визначити активацію аутоімунних реакцій. Спосіб пояснюється наступними прикладами: Приклад 1. Хворий М., 50 років, діагноз: нейроциркуляторна дистонія без ішемічної хвороби серця. По вищеописаному способу було проведено дослідження. Отримані наступні результати: Оптична щільність розчину при довжині хвилі 370 нм - 0,400. Розрахунок [0,400 : 0,1 мл] = 4,0 Од/мл . Кількість 1,4-дінітрофенілгідразонів в сироватці крові становить 4,0 Од/мл. Реакція бласттрансформації лімфоцитів до антигенів судин - 2 %. Рівень аутоантитіл до окислених ліпопротеїдів низької щільності - 100 мОд/мл. Реакція аутосенсибілізації відсутня. Приклад 2. Хворий К., 52 роки, діагноз: ішемічна хвороба серця, стенокардія напрягу, атеросклероз. Коронарографія зафіксувала атеросклеротичний стеноз коронарних артерій. По вищеописаному способу було проведено дослідження. Комп’ютерна верстка І.Скворцова 6 Отримані наступні результати: Оптична щільність розчину при довжині хвилі 370 нм - 0,700. Розрахунок [0,700 : 0,1 мл] = 7,0 Од/мл . Кількість 1,4-дінітрофенілгідразонів в сироватці крові становить 7,0 Од/мл. Реакція бласттрансформації лімфоцитів до антигенів судин - 7 %. Рівень аутоантитіл до окислених ліпопротеїдів низької щільності -250 мОд/мл. Зареєстрована реакція аутосенсибілізації по клітинному та гуморальному типу. Приклад 3. Хворий Г., 57 років, діагноз: ішемічна хвороба серця, стенокардія покою та напрягу, атеросклероз. Коронарографія зафіксувала атеросклеротичний стеноз коронарних артерій. По вищеописаному способу було проведено дослідження. Отримані наступні результати: Оптична щільність розчину при довжині хвилі 370 нм - 0,900. Розрахунок [0,900 : 0,1 мл] = 9,0 Од/мл . Кількість 1,4-дінітрофенілгідразонів в сироватці крові становить 9,0 Од/мл. Реакція бласттрансформації лімфоцитів до антигенів судин - 10 %. Рівень аутоантитіл до окислених ліпопротеїдів низької щільності - 290 мОд/мл. Зареєстрована реакція аутосенсибілізації по клітинному та гуморальному типу. Приклад 4. Хворий Н., 61 рік, діагноз: ішемічна хвороба серця, стенокардія покою та напрягу, атеросклероз, III функціональний клас. Коронарографія зафіксувала атеросклеротичний стеноз коронарних артерій. По вищеописаному способу було проведено дослідження. Отримані наступні результати: Оптична щільність розчину при довжині хвилі 370 нм - 1,350. Розрахунок [1,350 : 0,1 мл] = 10,350 Од/мл . Кількість 1,4-дінітрофенілгідразонів в сироватці крові становить 10,350 Од/мл. Реакція бласттрансформації лімфоцитів до антигенів судин - 17 %. Рівень аутоантитіл до окислених ліпопротеїдів низької щільності -350 мОд/мл. Зареєстрована реакція аутосенсибілізації по клітинному та гуморальному типу. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601