Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб одержання інгібітора амілази, що включає обробку компонента зерна вівса екстрагентом, відокремлення осаду, обробку осаду екстрагентом, хроматографічне очищення виділеного білка і сушіння цільового продукту, який відрізняється тим, що як компонент зерна вівса використовують борошенце вівса, яке обробляють бікарбонатним буферним розчином при рН = 7,0-11,0, відокремлюють осад і фракціюють білки подвійною обробкою сульфатом амоніаку, після чого видаляють сульфат амонію і здійснюють очищення білка афінною хроматографією.

Текст

Спосіб одержання інгібітора амілази, що включає обробку компонента зерна вівса екстрагентом, 3 35845 но використовувати вакуумний апарат, що значно удорожчує технологію. Використання органічних розчинників при кімнатній температурі для екстракції білкових речовин, які володіють біологічною активністю, тобто ферменти та їх інгібітори, супроводжується повною втратою їх біологічної активності, тому екстракцію ферментів та їх інгібіторів необхідно проводити тільки за дуже низьких температур: (-18 ¸ -20) °С та з мінімальним часом контакту розчинника з сировиною. Виділення інгібітору за методом прототипу вимагає використання складного приладу - високорідинного хроматографу на колонці Nucleosil C4 з використанням токсичних органічних розчинників. В способі, що пропонується, використовується фракціювання сульфатом амоніаку з подальшою афінною хроматографією супернатанту на колонці з дешевим сорбентом, що не потребує складного апаратурного оформлення. Активність інгібітору, який вилучено за прототипом складає 32%, що значно менше, ніж активність інгібітору, виділеного за методом, що патентується (38%). В основу корисної моделі поставлено задачу створити удосконалений спосіб одержання інгібітора амілази, в якому шляхом заміни вихідної сировини, а також умов екстрагування та очищення білку, забезпечити вилучення інгібітору a-амілази з максимальною антиамілолітичною активністю. Поставлена задача вирішена в спосіб одержання інгібітора амілази, що включає обробку компонента зерна вівса екстрагентом, відокремлення осаду. обробку осаду екстрагентом, хроматографічне очищення виділеного білка і сушку цільового продукту тим, що як компонент зерна вівса використовують борошенця вівса, яке обробляють бікарбонатним буферним розчином при рН = 7,0-11,0, відокремлюють осад і фракціонують білки подвійною обробкою сульфатом амоніаку, після чого видаляють сульфат амоніаку і здійснюють очищення білка афінною хроматографією. Новим у корисній моделі, що заявляється, є наявність таких ознак: - використання борошенець вівса в якості компонента зерна вівса; - умови екстрагування; - очищення білку афінною хроматографією. Причино-наслідковий зв'язок між сукупністю заявлених ознак і досягнення технологічного результату можна пояснити наступним: вилучення інгібітору панкреатичної a-амілази з максимально можливою антиамілолітичною активністю базується на досягненні максимального ступеню очищення інгібітору за рахунок використання найбільш ефективного специфічного екстрагенту - бікарбонатного буферу, подвійного використання неорганічних (тобто, більш фізіологічних) реактивів та найбільш ефективної афінної хроматографії, в основу якої покладена спорідненість інгібітору до ферменту. Спосіб здійснюється наступним чином. Борошенеця вівса попередньо знежирюють 10-ма об'ємами петролейного ефіру в апараті Сокслета. Екстракцію інгібітора панкреатичної амілази 4 з борошенець вівса проведено 0,1М бікарбонатним буфером, рН 7,0 - 11,0, якій містить 0,15М NaCl (гідромодуль 5) при постійному перемішуванні на магнітній мішалці (число обертів 5000об/хв) при кімнатній температурі протягом 1 години. Осад відокремлюють від супернатанту за допомогою центрифугування при швидкості 8000 обертів за хвилину впродовж 20 хвилин. Фракціювання супернатанту проводять сульфатом амоніаку з масовими концентраціями солі між 40 і 75%. Отриманий осад розчинюють у дистильованій воді. Суспензію білку поміщають в пористу мембрану і діалізують проти 500мл дистильованої води впродовж 3 днів. Отриманий зразок центрифугують при 5000об/хв впродовж 30 хвилин. Супернатант піддають афінній хроматографії. Супернатант наносять на колонку (1x15см) з сорбентом: панкреатична амілаза - сефароза 4В зі швидкістю 15мл/год. Після закінчення насичення сорбенту, яке контролюють за появою в фільтраті інгібіторної активності по відношенню до тваринної a-амілази, гель промивають 0,05М трис/НС1 буфером, рН = 8,0. Потім гель в колонці промивають послідовно 1М розчином NaCl та 8М сечовиною в 0,05М трис/НСl буфері, рН = 8,0. Десорбцію інгібітора проводять 10-3М розчином НС1. Активну фракцію нейтралізують до рН = 8,0 1М розчином NaOH й ліофільно висушують. Активність інгібітору складає 38%. Приклад 1. Борошенеця вівса попередньо знежирюють 10-ма об'ємами петролейного ефіру в апараті Сокслета. До 100г борошенець вівса додають 500мл 0,1М бікарбонатного буферу, рН 9,2, який містить 0,15М NaCl. Екстракцію проводять при постійному перемішуванні на магнітній мішалці (число обертів 5000об/хв) при кімнатній температурі впродовж 1 години. Осад відокремлюють за допомогою центрифугування при швидкості 8000об/хв впродовж 20 хвилин. До екстракту додають 11,56г (NH4)2SO4. Осад відокремлюють центрифугуванням, до супернатанту додають 19,08г (NH4)2SO4, осад відокремлюють центрифугуванням. До одержаного осаду додають 30мл дистильованої води. Суспензію білку поміщають в пористу мембрану і діалізують проти 500мл дистильованої води впродовж 3 днів. Проводять афінну хроматографію на колонку (1х15см) з сорбентом: панкреатична амілаза - сефароза 4В наносять супернатант зі швидкістю 15мл/хв. Після закінчення насичення сорбенту, яке контролюють за появою в фільтраті інгібіторної активності по відношенню до тваринної а-амілази, гель промивають 0,05М трис/НСІ буфером, рН = 8,0 (50мл). Потім гель в колонці промивають послідовно 1М розчином NaCl (20мл) та 8М сечовиною в 0,05М трис/НСl буфері, рН = 8,0 (32мл). Десорбцію інгібітора проводять 10-3 М розчином НСl (80мл). Активну фракцію нейтралізують до рН = 8,0 1М розчином NaOH й ліофільно висушують. Приклад 2. Здійснюють аналогічно прикладу 1, але екстракцію проводять бікарбонатним буфером з діапазоном рН середовища 7,0-11,0. Отримані дані наведені в таблиці. 5 35845 6 Таблиця Вплив рН бікарбонатного буферу на антиамілолітичну активність інгібітору рН бікарбонатного буферу 7,0 8,0 9,2 10,0 11,0 Активність інгібітору амілази, % 28,5 35 38 33,8 28 Як видно з даних, наведених в таблиці, оптимальне значення рН є 9,2, при цьому екстрагуєть Комп’ютерна в ерстка Д. Шев ерун ся білок з найбільшою інгібіторною активністю по відношенню до панкреатичної a-амілази. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Method for producing amylase inhibitor

Автори англійською

Krusir Halyna Vsevolodivna, Kushnir Nadia Anatoliivna

Назва патенту російською

Способ получения ингибитора амилазы

Автори російською

Крусир Галина Всеволодовна, Кушнир Надежда Анатольевна

МПК / Мітки

МПК: A61K 38/43, A61K 38/00

Мітки: інгібітора, одержання, спосіб, амілази

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/3-35845-sposib-oderzhannya-ingibitora-amilazi.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб одержання інгібітора амілази</a>

Подібні патенти